CN110003158B - 一种黄绿木霉菌的代谢产物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及从黄绿木霉菌(Trichoderma aureoviride)液体发酵物中提取的一种聚酮类化合物及其制法和应用。具体而言，本发明公开了一种聚酮类化合物，其化学结构式为：

Description

一种黄绿木霉菌的代谢产物和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及从黄绿木霉菌(Trichoderma aureoviride)液体发酵物中提取的一种新化合物及其制法和抗菌活性应用。

背景技术

微生物次级代谢产物是许多临床常用药物的主要来源，其中大约80％的抗生素都是由放线菌产生。然而，在人类利用抗生素以后，耐药菌株的产生也越来越多，对于新的抗药性病原菌，传统的抗生素已不能满足人们的需求，人类的健康受到严重的威胁，因此，开发新的药物己迫在眉睫。真菌所产生的活性代谢产物化学结构特殊且结构多样化，可以作为寻找新型活性物质的新资源，真菌是抗生素的重要来源(如青霉素来源于青霉菌)，因此，研究真菌及其次生代谢产物对开拓发现新型抗生素具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种木霉聚酮类化合物及其制备方法和用途—作为抗菌剂。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种黄绿木霉菌的聚酮类化合物，其结构式为：

本发明所述黄绿木霉具体可为中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC32248的菌株。

本发明还同时提供了上述木霉聚酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：

1)、将黄绿木霉菌接种于PDA平板培养基中，在28±0.5℃的恒温培养箱中，培养3d；

2)、之后将新鲜的菌丝接种于有100mL高压灭菌的液体PDA培养基中，在温度28±0.5℃，转速180rpm的摇床上培养3d，得种子液；

3)、将种子液按照10％-15％的接种量转接至发酵培养基中，按照步骤1摇床条件发酵培养7d；

4)、将步骤3所得发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥，得粗浸膏；

5)、使用步骤4的粗浸膏用10倍质量的硅胶制作硅胶柱，刚开始以纯二氯甲烷洗脱，然后以二氯甲烷和甲醇比值为100:1、100:2、100:4依次洗脱，得到不同的洗脱部分；

6)将步骤5的100:1洗脱部分干燥处理后经凝胶柱层析分离，以甲醇为洗脱剂，所得的沉淀在甲醇中重结晶；得到聚酮类化合物。

本发明还同时提供了上述聚酮类化合物在抗菌剂中的应用，具体为：用于抑制病原细菌的生长，所述菌为金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌。

本发明具有如下有益效果：

1.本发明的聚酮类化合物是一种新化合物，可以作为具有抗菌剂或其先导物使用。

2.本发明的聚酮类化合物可以利用微生物进行液体发酵生产，工艺简便，周期短，成本低，来源有保证。

3.本发明利用生物法合成聚酮类化合物对环境无污染。

具体实施方式

下面结合具体实施案例对本发明做进一步的解释。

实施例1、黄绿木霉菌的液体发酵

黄绿木霉菌株(保藏编号为ACCC32248)获自中国农业微生物菌种保藏管理中心，将木霉菌株接种于PDA平板培养基中，在28±0.5℃的恒温培养箱中，培养3d；之后将新鲜的菌丝接种于有100mL高压灭菌的液体PDA培养基中，在温度28±0.5℃，转速180rpm的摇床上培养3d，得种子液；将种子液按照10％-15％的接种量转接至发酵培养基中，在温度28±0.5℃，转速180rpm的摇床上培养7d。

实施例2、黄绿木霉菌的聚酮类化合物提取和分离

将实施例1制备而得的20L发酵液经3层纱布过滤，得到滤液，将该滤液用中等极性有机溶剂乙酸乙酯进行1:1萃取数次，直到有机相无萃取物得到为止，合并所有萃取液，使用旋转蒸发仪高压浓缩，得到相应菌株的粗提物9.5g；将上述粗提物与等质量100-200目的硅胶拌匀，于40℃烘箱中将样品烘干，进一步研磨成粉末状，备用；使用粗提物10倍质量的硅胶制作硅胶柱，以不同比例的二氯甲烷和甲醇为以洗脱剂，极性从低到高进行洗脱。刚开始以纯二氯甲烷洗脱，然后以二氯甲烷和甲醇比值为100:1、100:2、100:4依次洗脱(每种洗脱液的用量均为约10倍柱体积)，最后得到100:1洗脱部分为1.2g，干燥处理后经凝胶柱层析分离，以甲醇为洗脱剂，所得的沉淀在甲醇中重结晶得到聚酮类化合物45mg。其结构式为：

实施例3、黄绿木霉菌的聚酮类化合物结构鉴定

黄绿木霉菌的聚酮类化合物的结构是基于它们的性状、质谱、核磁共振谱数据分析而确定的。

性状和光谱学数据如下：

黄色固体，易溶于甲醇和丙酮。从高分辨正源电喷雾质谱HR-ESI-MS中得出的准分子离子峰[M+H]⁺m/z 369.1196，计算值为C₁₇H₂₁O₉ 369.3012；[M+Na]⁺m/z 391.1020计算值为C₁₇H₂₀O₉Na 391.2832。因此推测该化合物的分子式为C₁₇H₂₀O₉。合物的核磁共振波谱数据如下：¹H NMR(400MHz,Acetone-d₆)δ9.72(d,J＝7.9Hz,1H),7.24(d,J＝15.5Hz,1H),6.90(d,J＝4.9Hz,1H),6.48(dd,J＝15.4,7.9Hz,1H),6.34(s,1H),6.07(s,1H),5.79(s,1H),5.67(s,1H),5.56(d,J＝4.7Hz,1H),5.51(s,1H),4.29(d,J＝5.9Hz,1H),3.97(s,1H),2.64(m,2H),1.29(m,6H)。¹³C NMR(151MHz,Acetone-d6)δ195.01(C-5),193.56(C-14),171.12(C-8),152.33(C-1),149.42(C-6a),145.35(C-12),131.26(C-13),123.02(C-6),111.08(C-7),94.85(C-2),77.39(C-4),71.79(C-3),70.23(C-2a),65.08(C-10),44.32(C-9),23.63(C-11),19.47(C-15)。

实施例3、黄绿木霉菌的聚酮类化合物对病原菌的抑制作用

采用滤纸片法对黄绿木霉菌的聚酮类化合物进行抗抗菌活性测试。将白色念珠菌接种于PDA液体培养基，其它三种病原菌接种于NA液体培养基，30℃，180r/min摇床培养过夜。然后用无菌水把菌液浓度调到0.5-1个麦氏。化合物和阳性对照(两性霉素、庆大霉素)用丙酮配置成浓度为6mg/mL。无菌条件下，用移液枪吸取200μL稀释好的菌悬液打到NA和PDA固体平板上并涂布均匀，然后用移液枪吸取5μL配置好的化合物和阳性对照溶液，分别滴于灭直径5mm无菌滤纸片上，待丙酮挥发干后，将滤纸片放入到涂满病原菌的平板中央，将培养皿倒置放于恒温培养箱中孵育24h左右，

备注说明：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(NA)配方为：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂粉18g，定容至1L；麦芽浸汁培养基(MEA)配方为：麦芽20g、20g蔗糖、1g蛋白胨和18g琼脂粉，待加热溶解定容至1L。不添加琼脂粉者，为其液体培养基(ME)。

聚酮类化合物对对致病菌的生长抑制作用见下表1。从表中数据可知，在供试浓度为30μg/滤纸片时，化合物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有中等抑制活性，抑菌圈直径分别为7.3mm和7.0mm

表1.黄绿木霉菌的聚酮类化合物对致病菌的生长抑制作用(mm)

注：结果表示为抑菌圈直径±3个平行测量值的标准；硫酸庆大霉素和两性霉素分别为致病细菌和白色念珠菌的阳性对照；NI表示没有活性；供试浓度为30μg/滤纸片。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种黄绿木霉的聚酮类化合物，其特征是结构式为：

2.如权利要求1所述的木霉菌化合物的制备方法，其特征是包括如下步骤：

1)、将黄绿木霉菌，中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏编号为ACCC32248的菌株，接种于PDA平板培养基中，在28±0.5℃的恒温培养箱中，培养3d；

2)、之后将新鲜的菌丝接种于有100mL高压灭菌的液体PDA培养基中，在温度28±0.5℃，转速180rpm的摇床上培养3d，得种子液；

3)、将种子液按照10％～15％的接种量转接至发酵培养基中，按照步骤2摇床条件发酵培养7d；

4)、将步骤3所得发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥，得粗浸膏；

5)、使用步骤4的粗浸膏用10倍质量的硅胶制作硅胶柱，刚开始以纯二氯甲烷洗脱，然后以二氯甲烷和甲醇比值为100:1、100:2、100:4依次洗脱，得到不同的洗脱部分；

6)将步骤5的100:1洗脱部分干燥处理后经凝胶柱层析分离，以甲醇为洗脱剂，所得的沉淀在甲醇中重结晶；得到聚酮类化合物。

3.根据权利要求1所述的黄绿木霉的聚酮类化合物在制备对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有拮抗活性药物中的用途。