CN109988814B - 一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法 - Google Patents

一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109988814B
CN109988814B CN201910211589.2A CN201910211589A CN109988814B CN 109988814 B CN109988814 B CN 109988814B CN 201910211589 A CN201910211589 A CN 201910211589A CN 109988814 B CN109988814 B CN 109988814B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gold
polypeptide
titanium
bioactive polypeptide
grafting density
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910211589.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109988814A (zh
Inventor
王琳
方舟
陈军建
胡冠松
辛浩千
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Huarui Medical Instrument Co ltd
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201910211589.2A priority Critical patent/CN109988814B/zh
Publication of CN109988814A publication Critical patent/CN109988814A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109988814B publication Critical patent/CN109988814B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/21—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Pseudomonadaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • G01N2333/245—Escherichia (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤为：(1)将金/含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底材料竖直没入并固定于含巯基的生物活性多肽溶液中；(2)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，取出基底材料，清洗，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金/钛生物材料；(3)通过在金/钛生物材料表面培养细菌和/或细胞并观察其生长情况，确定最佳生物活性多肽接枝密度区域；(4)测定最佳多肽接枝密度区域中生物活性多肽的接枝密度。本发明可以快速确定金/钛表面不同生物活性多肽分子的最佳接枝密度，并获得最佳接枝密度的金/钛生物材料的制备条件，从而用于指导金/钛材料的表面改性。

Description

一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛 选方法
技术领域
本发明属于生物材料表面改性领域，具体涉及一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法。
背景技术
生物材料植入体内，所有的反应均发生于材料的表面。因此，材料表面的性质至关重要，生物材料的表面改性也成为领域研究的热点。其中，利用各种生物活性多肽对材料表面进行改性处理，可以有针对性地提高材料表面的生物学行为。但是，用于改性的多肽分子在材料表面的密度直接决定了材料表面的生物活性。当生物活性多肽的接枝密度过低时，材料表面的性能提高受限；而当接枝密度过高时，某种活性多肽的聚集会抑制其他生物活性，且由于多肽的昂贵价格，会显著增加成本。因此，用于生物材料表面改性的多肽具有合理的接枝密度。
如金被广泛用于制备传感器类生物材料，且由于其与巯基的特异性反应，金表面可接枝具有抗菌功能的多肽，提高其表面的抗细菌污染能力；接枝具有促细胞粘附功能的多肽，提高其对细胞感应的敏感性等。但是，传统的研究方法大都采用正交实验确定金表面多肽的最佳接枝密度，过程十分繁琐耗时。如何能够开发快速确定生物活性多肽，如具有抗菌功能的HHC36多肽或具有促细胞粘附功能的RGD多肽，在金等材料表面合理接枝密度的高通量筛选和控制方法，成为研究的难点。
发明内容
为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法。
该方法可以确定构建材料表面接枝生物活性多肽的最佳参数，包括材料表面生物活性多肽最佳接枝密度及其制备条件参数，从而指导金/钛基生物材料表面的改性。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，包括以下步骤：
(1)将基底材料竖直没入并固定于浓度为10～200μM含巯基的生物活性多肽溶液中；所述基底材料为金基底材料或含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底材料；
(2)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，取出基底材料，清洗，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金/钛生物材料；
(3)通过在步骤(2)的金/钛生物材料表面培养细菌和/或细胞并观察其生长情况，确定生物活性多肽的最佳接枝密度区域；
(4)测定生物活性多肽的最佳接枝密度。
步骤(1)所述生物活性多肽溶液中的生物活性多肽为RGD多肽(结构如式1所示)或HHC36多肽(结构如式2所示)。
Figure BDA0002000710380000021
Figure BDA0002000710380000031
步骤(1)所述的生物活性多肽溶液为浓度为10～180μM的RGD多肽溶液或浓度为20～200μM的HHC36多肽溶液。
步骤(1)所述金基底材料在使用前经过食人鱼洗液处理2～5min，然后再用丙酮、乙醇和去离子水分别清洗1～3次；所述含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底材料在使用前经过无水乙醇和水各超声清洗15min，然后氮气吹干。
所述食人鱼洗液由98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得。
步骤(2)所述蒸发方式为加热和/或抽气。
所述加热温度为30～80℃，所述抽气的装置为万向抽气罩或通风橱。
步骤(2)所述完全蒸发的时间为50～210min；所述生物活性多肽溶液的溶剂为无水乙醇。
步骤(2)所述清洗为：取出的基底材料用丙酮、乙醇和去离子水分别清洗1～3次。
步骤(3)所述细菌通过利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察其生长情况；所述细胞通过利用FITC荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察其生长情况。
所述利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察细菌的生长情况；具体步骤如下：
①在Petrifilm的两层膜之间涂覆磷酸缓冲溶液(PBS)；
②将样品(生物活性多肽接枝密度梯度化的金/钛生物材料)置于培养板中，加入细菌浓度为105cfu/mL的菌液，静置培养；
③取出金/钛生物材料，用PBS清洗，待表面菌液干燥后，置于步骤①的Petrifilm两层膜之间，静置培养；
④取出步骤③Petrifilm两层膜之间的金/钛生物材料，观察Petrifilm膜上细菌的分布情况，确定金/钛生物材料中生物活性多肽的最佳接枝密度区域。
步骤①所述磷酸缓冲溶液由137mM NaCl、2.7mM KCl、10.1mM Na2HPO4和1.8mMKH2PO4配制而成，体积为1ml。
步骤②所述菌液体积为200微升；所述静置培养的条件为：37℃下培养2.5h。
步骤③所述PBS清洗的数次为3次；所述静置培养的条件为：37℃下培养12h。
步骤④所述金/钛生物材料表面的每一个细菌均会落在Peterfilm上形成红色圆点，根据Peterfilm上红色圆点的分布情况，判断细菌在金/钛生物材料表面各个区域的分布情况，以及每一区域的抗菌效果，从而确定抗菌区域范围。
所述利用FITC荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察其生长情况，具体步骤如下：
①将金/钛生物材料用乙醇消毒后，置于培养板中，加入浓度为105个/mL的细胞悬液，静置培养；
②取出金/钛生物材料，用PBS清洗，然后用戊二醛固定；
③将固定后的金/钛生物材料置于饱和FITC溶液(异硫氰酸荧光素溶于DMSO形成的饱和溶液)中静置，然后用PBS清洗；
④在激光共聚焦显微镜下，利用FITC通道观察步骤③的金/钛生物材料表面细胞分布情况以及细胞粘附数量，确定促进细胞粘附和抗菌区域范围。
步骤①所述乙醇优选为体积浓度为75％的乙醇溶液，所述消毒时间为2.5h；所述细胞悬液的体积为0.5-1ml；所述静置培养的条件为：37℃、5％CO2环境下培养24h。
步骤②所述清洗次数为3次；所述固定的条件为：4℃下固定12h。
步骤③所述静置时间为30min；所述清洗次数为3次。
步骤(3)所述细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌中的一种以上。
步骤(3)所述细胞为骨髓间充质干细胞或血管内皮细胞。
步骤(4)所述测定生物活性多肽最佳接枝密度的方法为：通过XPS技术与耗散型石英晶体微天平(QCM)相结合的方法测定步骤(3)所述最佳接枝密度区域对应的接枝密度。
所述通过XPS技术与QCM相结合的方法的具体计算公式如下：
Δm＝-CΔf
m多肽＝mQCMA多肽/AQCM
式中，Δm：QCM芯片接枝多肽前后的质量变化，C：芯片感应常数，Δf：QCM芯片接枝多肽前后的频率变化；
m多肽：金/钛材料表面接枝多肽的质量，即接枝密度；mQCM：QCM芯片表面接枝多肽的质量，mQCM等于Δm；A多肽：金/钛材料表面接枝的多肽XPS氮峰强度；AQCM：QCM芯片表面接枝的多肽氮峰强度。
所述一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，用于指导金/钛基生物材料表面改性的方法，具体为：
将金基底材料或含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底材料浸泡在含巯基的生物活性多肽溶液中，制得目标生物活性多肽接枝密度的金/钛生物材料，确定浸泡参数：生物活性多肽溶液的浓度A、浸泡时间B和温度C的方法为：
将步骤(2)的生物活性多肽接枝密度梯度化的金/钛生物材料按照步骤(1)所述竖直方向自上而下划分为N个区域，区域标号为1～N，步骤(3)确定生物活性多肽的最佳接枝密度区域为第n区域，1＜n＜N，n和N均为整数，步骤(1)所述生物活性多肽溶液的浓度为aμM，步骤(2)所述完全蒸发的时间为b min，完全蒸发的温度为c；则A＝a/(1-n/N)μM，B＝nb/Nmin，C＝c；
其中，所述目标生物活性多肽接枝密度与步骤(4)所述最佳生物活性多肽接枝密度区域中生物活性多肽的接枝密度相同。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明方法简单，能够快速确定生物活性多肽接枝改性功能化金/钛生物材料的制备参数，包括生物活性多肽的最佳接枝密度、制备过程中浸泡金/钛材料所需的时间以及生物活性多肽溶液的浓度；解决了传统正交实验法过程繁琐、耗时的问题。
(2)通过本发明所述方法确定金/钛材料的最佳生物活性多肽接枝密度指导制得的金/钛生物材料对金葡菌的抑制率达到99.99％，对骨髓间充质干细胞促细胞粘附性能提高1.85倍。
(3)本发明所述方法适用于指导基于金生物材料表面功能化改性，包括抗菌、促细胞粘附等改性。
附图说明
图1为制备生物活性多肽接枝密度梯度化的金/钛生物材料过程中溶剂蒸发示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本申请实施例和对比例中涉及的生物材料如下：
金黄色葡萄球菌(ATCC 6538P)；大肠杆菌(ATCC 15224，购买于广东微生物研究中心)；绿脓杆菌(ATCC 15442)；小鼠骨髓间充质干细胞(ATCC CRL-12424，VWRInternational,LLC,Pennsylvania,USA)；血管内皮细胞(
Figure BDA0002000710380000061
CRL-2873，VWRInternational,LLC,Pennsylvania,USA)。
本申请实施例所用HHC36和RGD多肽购买于上海强耀生物科技有限公司。
本申请实施例所述在金/钛基底表面培养金黄色葡萄球菌，利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察其抑制细菌生长情况，具体步骤如下：
①在Petrifilm(大肠杆菌测试片)两层膜之间涂覆1ml磷酸缓冲溶液(PBS)；
②将金/钛基底置于24孔培养板中，加入200微升细菌浓度为105cfu/mL的金黄色葡萄球菌菌液，在37℃下静置培养2.5h；
③取出步骤②的金/钛基底，用PBS清洗3次，待表面菌液干燥后，置于步骤①的Petrifilm两层膜之间，在37℃下静置培养12h；
④取出步骤③Petrifilm两层膜之间的金/钛基底，观察Petrifilm膜上的金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和绿脓杆菌分布情况，确定金/钛基底表面最佳生物活性多肽接枝密度区域，其中金/钛基底表面的每一个细菌均会落在Peterfilm上形成红色圆点，根据Peterfilm上红色圆点的分布情况，判断细菌在金/钛基底表面各个区域的分布情况，以及每一区域的抗菌效果，从而确定抗菌区域范围。
本申请实施例所述在金/钛基底表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，利用FITC荧光和激光共聚焦显微镜，观察其促进细胞生长情况，具体步骤如下：
①将金/钛基底用75％乙醇消毒2.5小时后，置于24孔培养板中，加入1毫升浓度为105个/mL的骨髓间充质干细胞悬液，37℃、5％CO2下静置培养24小时；
②取出金/钛基底，用PBS清洗3次，然后用戊二醛在4℃下固定12小时；
③将固定后的金/钛基底置于饱和FITC溶液中静置30min，然后用PBS清洗3次；
④在激光共聚焦显微镜下，利用FITC通道观察步骤③的金/钛基底表面细胞分布情况及细胞粘附数量，确定最佳促进细胞粘附区域范围。
实施例1
一种用于金基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形金基底利用食人鱼洗液(98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得)处理3分钟，取出金基底，用乙醇和去离子水分别清洗3次。
(2)将步骤(1)的金基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽HHC36溶液，初始浓度为90μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过金基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为30℃，完全蒸发的时间为210分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的金基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金基底。
(5)将步骤(4)金基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面分别培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌，利用Petrifilm大肠菌群检验方法，观察细菌在金基底表面的分布情况，以及每一区域的抗菌效果，确定抗菌区域范围。经确定，其有效抗金黄色葡萄球菌的区域自第5区域开始，抗绿脓杆菌区域自第6区域开始以及抗大肠杆菌的区域自第5区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第6区域为抗菌起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为28.52ng/cm2；经计算，确定生物活性多肽接枝密度为28.52ng/cm2的金基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为225μM，浸泡时间为126分钟，温度为30℃。
(6)取步骤(1)的金基底，浸入1mL浓度为225μM的HHC36多肽溶液中，30℃下静置处理126分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到HHC36多肽接枝的金基底；根据XPS结果与QCM相结合算得HHC36多肽接枝的金基底表面多肽分子的接枝密度为28.53ng/cm2。
(7)在HHC36多肽接枝的金基底表面分别培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，并利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察其表面抑制细菌的生长情况，同时，以未处理的金基底作为对照组；Petrifilm结果表明，相比于对照组，所制得的HHC36多肽接枝的金基底对金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌的抗菌率分别为99.85％，98.99％和99.63％。
实施例2
一种用于金基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形金基底利用食人鱼洗液(98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得)处理3分钟，取出金基底，用乙醇和去离子水分别清洗3次。
(2)将步骤(1)的金基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽HHC36溶液，初始浓度为200μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过金基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为80℃，完全蒸发的时间为50分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的金基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金基底。
(5)将步骤(4)金基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面分别培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌，利用Petrifilm大肠菌群检验方法，观察细菌在金基底表面的分布情况，以及每一区域的抗菌效果，确定抗菌区域范围。经确定，其有效抗金黄色葡萄球菌的区域自第2区域开始，抗绿脓杆菌区域自第2区域开始以及抗大肠杆菌的区域自第2区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第2区域为抗菌起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为28.54ng/cm2。经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为28.54ng/cm2的金基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为250μM，浸泡时间为10分钟，温度为80℃。
(6)取步骤(1)的金基底材料，浸入1mL浓度为250μM的HHC36多肽溶液中，80℃下静置处理10分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到HHC36多肽接枝的金基底；根据XPS结果与QCM相结合算得HHC36多肽接枝的金基底表面多肽分子的接枝密度为28.55ng/cm2。
(7)在HHC36多肽接枝的金基底表面分别培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，并利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察其表面抑制细菌的生长情况，同时，以未处理的金基底作为对照组；Petrifilm结果表明，相比于对照组，所制得的HHC36多肽接枝的金基底对金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌的抗菌率分别为99.99％，99.64％和99.98％。
实施例3
一种用于金基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形金基底利用食人鱼洗液(98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得)处理3分钟，取出金基底，用乙醇和去离子水分别清洗3次。
(2)将步骤(1)的金基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽HHC36溶液，初始浓度为20μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过金基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为50℃，完全蒸发的时间为120分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的金基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金基底。
(5)将步骤(4)金基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面分别培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌，利用Petrifilm大肠菌群检验方法，观察细菌在金基底表面的分布情况，以及每一区域的抗菌效果，确定抗菌区域范围。经确定，其有效抗金黄色葡萄球菌的区域自第8区域开始，抗绿脓杆菌区域自第8区域开始以及抗大肠杆菌的区域自第8区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第8区域为抗菌起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为28.50ng/cm2；经计算，确定生物活性多肽接枝密度为28.50ng/cm2的金基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为100μM，浸泡时间为96分钟，温度为50℃。
(6)取步骤(1)的金基底，浸入1mL初始浓度为100μM的HHC36多肽溶液中，50℃下静置处理96分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到HHC36多肽接枝的金基底；根据XPS结果与QCM相结合算得HHC36多肽接枝的金基底表面多肽分子的接枝密度为28.51ng/cm2。
(7)在HHC36多肽接枝的金基底表面分别培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，并利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察其表面抑制细菌的生长情况，同时，以未处理的金基底作为对照组；Petrifilm结果表明，相比于对照组，所制得的HHC36多肽接枝的金基底对金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌的抗菌率分别为99.10％，98.64％和99.52％。
实施例4
一种用于金基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形金基底利用食人鱼洗液(98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得)处理3分钟，取出金基底，用乙醇和去离子水分别清洗3次。
(2)将步骤(1)的金基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽RGD溶液，初始浓度为180μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过金基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为80℃，完全蒸发的时间为50分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的金基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金基底。
(5)将步骤(4)金基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在金基底表面的分布情况，确定细胞分布最佳区域范围。经确定，其有效促骨髓间充质干细胞粘附的区域自第3个区域开始以及有效促血管内皮细胞粘附的区域自第3个区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第3区域为最佳促细胞黏附起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为36.94ng/cm2；经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为36.94ng/cm2的金基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为257.1μM，浸泡时间为15分钟，温度为80℃。
(6)取步骤(1)的金基底材料，浸入1mL浓度为257.1μM的RGD多肽溶液中，80℃下静置处理15分钟；取出后，利用丙酮、乙醇和去离子水分别清洗3次，得到RGD多肽接枝的金基底；根据XPS结果与QCM相结合算得RGD多肽接枝的金基底表面多肽分子的接枝密度为36.95ng/cm2。
(7)在RGD多肽接枝的金基底表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后，利用FITC对其进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜进行观察；同时，以未处理的金基底材料作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞数量为对照组的1.85和1.94倍。
实施例5
一种用于金表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形金基底材料利用食人鱼洗液(98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得)处理3分钟，取出金基底材料，用乙醇和去离子水分别清洗3次。
(2)将步骤(1)的金基底材料竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽RGD溶液，初始浓度为10μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过金基底材料。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为45℃，完全蒸发的时间为150分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的金基底材料，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金基底。
(5)将步骤(4)金基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在金基底表面的分布情况，确定细胞分布最佳区域范围。经确定，其有效促骨髓间充质干细胞粘附的区域自第9个区域开始以及有效促血管内皮细胞粘附的区域自第9个区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第9区域为最佳促细胞黏附起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为36.91ng/cm2；经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为36.91ng/cm2的金基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为100μM，浸泡时间为135分钟，温度为45℃。
(6)取步骤(1)的金基底，浸入1mL浓度为100μM的RGD多肽溶液中，45℃下静置处理135分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到RGD多肽接枝的金基底；根据XPS结果与QCM相结合算得RGD多肽接枝的金基底表面多肽分子的接枝密度为36.92ng/cm2。
(7)在RGD多肽接枝的金基底表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后，利用FITC对其进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜进行观察；同时，以未处理的金基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞数量为对照组的1.83和1.91倍。
实施例6
一种用于金基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形金基底利用食人鱼洗液(98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得)处理3分钟，取出金基底，用乙醇和去离子水分别清洗3次。
(2)将步骤(1)的金基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽RGD溶液，初始浓度为90μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过金基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为30℃，完全蒸发的时间为210分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的金基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金基底。
(5)将步骤(4)金基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在金基底表面的分布情况，确定细胞分布最佳区域范围。经确定，其有效促骨髓间充质干细胞粘附的区域自第3个区域开始以及有效促血管内皮细胞粘附的区域自第3个区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第3区域为最佳促细胞黏附起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为36.90ng/cm2；经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为36.90ng/cm2的金基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为128.6μM，浸泡时间为63分钟，温度为30℃。
(6)取步骤(1)的金基底，浸入1mL浓度为128.6μM的RGD多肽溶液中，30℃下静置处理63分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到RGD多肽接枝的金基底；根据XPS结果与QCM相结合算得RGD多肽接枝的金基底表面多肽分子的接枝密度为36.90ng/cm2。
(7)在RGD多肽接枝的金基底表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后，利用FITC对其进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜进行观察；同时，以未处理的金基底材料作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞数量为对照组的1.81和1.89倍。
实施例7
一种用于钛基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形钛基底利用丙酮、乙醇和去离子水分别清洗3次；然后经5M氢氧化钠在60℃下处理24h，再用去离子水清洗3遍，然后经0.5mg/mL硅烷偶联剂在50℃下处理12h，再用95％乙醇清洗三遍，氮气吹干，制得含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底。
(2)将步骤(1)的钛基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽HHC36溶液，初始浓度为20μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过钛基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为30℃，完全蒸发的时间为210分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的钛基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的钛基底。
(5)将步骤(4)钛基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面分别培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌，利用Petrifilm大肠菌群检验方法，观察细菌在钛基底表面的分布情况，以及每一区域的抗菌效果，确定抗菌区域范围。经确定，其有效抗金黄色葡萄球菌的区域自第5区域开始，有效抗绿脓杆菌区域自第6区域开始以及有效抗大肠杆菌是第5个区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第6区域为抗菌起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为22.66ng/cm2；经计算，确定生物活性多肽接枝密度为22.66ng/cm2的钛基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为50μM，浸泡时间为126min，浸泡温度为30℃。
(6)取步骤(1)的钛基底，浸入1mL浓度为50μM的HHC36多肽溶液中，30℃下静置处理126分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到HHC36多肽接枝的钛基底；根据XPS结果与QCM相结合算得HHC36多肽接枝的钛基底表面多肽分子的接枝密度为22.67ng/cm2。
(7)在HHC36多肽接枝的钛基底表面分别培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，并利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察其表面抑制细菌的生长情况，同时，以未处理的钛基底作为对照组；Petrifilm结果表明，相比于对照组，所制得的HHC36多肽接枝的钛基底对金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌的抗菌率分别为99.85％，98.45％和99.67％。
实施例8
一种用于钛基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形钛基底利用丙酮、乙醇和去离子水分别清洗3次；然后经5M氢氧化钠在60℃下处理24h，再用去离子水清洗3遍，然后经0.5mg/mL硅烷偶联剂在50℃下处理12h，再用95％乙醇清洗三遍，氮气吹干，制得含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底。
(2)将步骤(1)的钛基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽HHC36溶液，初始浓度为200μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过钛基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为80℃，完全蒸发的时间为50分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的钛基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的钛基底。
(5)将步骤(4)钛基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面培养金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌，利用Petrifilm大肠菌群检验方法，观察细菌在钛基底表面的分布情况，以及每一区域的抗菌效果，确定抗菌区域范围。经确定，其有效抗金黄色葡萄球菌的区域自第3区域开始，有效抗绿脓杆菌区域自第3区域开始以及有效抗大肠杆菌是第2个区域开始，至浓度最高的第10区域。因此，筛选第3区域为抗菌起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为22.64ng/cm2。经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为22.64ng/cm2的钛基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为285.7μM，浸泡时间为15分钟，温度为80℃。
(6)取步骤(1)的钛基底，浸入1mL浓度为285.7μM的HHC36多肽溶液中，80℃下静置处理15分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到HHC36多肽接枝的钛基底；根据XPS结果与QCM相结合算得HHC36多肽接枝的钛基底表面多肽分子的接枝密度为22.64ng/cm2。
(7)在HHC36多肽接枝的钛基底表面分别培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，并利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察其表面抑制细菌的生长情况，同时，以未处理的钛基底材料作为对照组；Petrifilm结果表明，相比于对照组，所得样品对金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌的抗菌率为99.74％，98.23％和99.32％。
实施例9
一种用于钛基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形钛基底利用丙酮、乙醇和去离子水分别清洗3次；然后经5M氢氧化钠在60℃下处理24h，再用去离子水清洗3遍；然后经0.5mg/mL硅烷偶联剂在50℃下处理12h，再用95％乙醇清洗三遍，氮气吹干，制得含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底。
(2)将步骤(1)的钛基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽HHC36溶液，初始浓度为50μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过钛基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为60℃，完全蒸发的时间为120分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的钛基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的钛基底。
(5)将步骤(4)钛基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，利用Petrifilm大肠菌群检验方法，观察细菌在钛基底表面的分布情况，以及每一区域的抗菌效果，确定抗菌区域范围。经确定，其有效抗金黄色葡萄球菌的区域自第4区域开始，有效抗绿脓杆菌区域自第4区域开始以及有效抗大肠杆菌是第3个区域开始，至浓度最高的第10区域。因此，筛选第4区域为抗菌起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为22.69ng/cm2。经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为22.69ng/cm2的钛基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为83.3μM，浸泡时间为48分钟，温度为60℃。
(6)取步骤(1)的钛基底，浸入1mL浓度为83.3μM的HHC36多肽溶液中，60℃下静置处理48分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到HHC36多肽接枝的钛生物材料；根据XPS结果与QCM相结合算得HHC36多肽接枝的钛基底表面多肽分子的接枝密度为22.69ng/cm2。
(7)在HHC36多肽接枝的钛基底表面培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，并利用Petrifilm方法观察其表面抑制细菌的生长情况，同时，以未处理的钛基底材料作为对照组；Petrifilm结果表明，相比于对照组，所得样品对金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌的抗菌率为99.99％，98.74％和99.86％。
实施例10
一种用于钛基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形钛基底利用乙醇和去离子水分别清洗3次，然后经5M氢氧化钠在60℃下处理24h，再用去离子水清洗3遍，然后经0.5mg/mL硅烷偶联剂在50℃下处理12h，再用95％乙醇清洗三遍，氮气吹干，制得含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底。
(2)将步骤(1)的金基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽RGD溶液，初始浓度为100μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过钛基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为80℃，完全蒸发的时间为50分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的钛基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的钛基底。
(5)将步骤(4)钛基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在钛基底表面的分布情况，确定细胞分布最佳区域范围。经确定，其有效促骨髓间充质干细胞粘附的区域自第3个区域开始以及促进血管内皮细胞粘附自第3个区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第3区域为最佳促细胞黏附起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为28.51ng/cm2；经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为28.51ng/cm2的钛基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为142.85μM，浸泡时间为15分钟，温度为80℃。
(6)取步骤(1)的钛基底，浸入1mL浓度为142.85μM的RGD多肽溶液中，80℃下静置处理15分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到RGD多肽接枝的钛基底；根据XPS结果与QCM相结合算得RGD多肽接枝的钛基底表面多肽分子的接枝密度为28.52ng/cm2。
(7)在RGD多肽接枝的钛基底表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后，利用FITC对其进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜进行观察；同时，以未处理的钛基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞数量为对照组的1.85和1.94倍。
实施例11
一种用于钛基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形钛基底利用乙醇和去离子水分别清洗3次，然后经5M氢氧化钠在60℃下处理24h，再用去离子水清洗3遍，然后经0.5mg/mL硅烷偶联剂在50℃下处理12h，再用95％乙醇清洗三遍，氮气吹干，制得含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底。
(2)将步骤(1)的钛基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽RGD溶液，初始浓度为1μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过钛基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为30℃，完全蒸发的时间为210分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的钛基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的钛基底。
(5)将步骤(4)钛基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在钛生物材料表面的分布情况，确定细胞分布最佳区域范围。经确定，其有效促骨髓间充质干细胞粘附的区域自第9个区域开始以及促进血管内皮细胞粘附自第8个区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第9区域为最佳促细胞黏附起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为28.53ng/cm2；经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为28.53ng/cm2的钛基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为10μM，浸泡时间为189分钟，温度为30℃。
(6)取步骤(1)的钛基底，浸入1mL浓度为10μM的RGD多肽溶液中，30℃下静置处理189分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到RGD多肽接枝的钛基底；根据XPS结果与QCM相结合算得RGD多肽接枝的钛基底表面多肽分子的接枝密度为28.54ng/cm2。
(7)在RGD多肽接枝的钛基底表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后，利用FITC对其进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜进行观察；同时，以未处理的钛基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞数量为对照组的1.87和1.95倍。
实施例12
一种用于钛基底表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形钛基底利用乙醇和去离子水分别清洗3次，然后经5M氢氧化钠在60℃下处理24h，再用去离子水清洗3遍，然后经0.5mg/mL硅烷偶联剂在50℃下处理12h，再用95％乙醇清洗三遍，氮气吹干，制得含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底。
(2)将步骤(1)的钛基底竖直固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽RGD溶液，初始浓度为20μM，溶剂为乙醇，使其刚好没过钛基底。
(3)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，蒸发温度为50℃，完全蒸发的时间为120分钟，蒸发过程示意图如图1所示。
(4)取出步骤(3)的钛基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的钛基底。
(5)将步骤(4)钛基底按照步骤所述竖直方向自上而下划分为10个区域，并在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在钛基底表面的分布情况，确定细胞分布最佳区域范围。经确定，其有效促骨髓间充质干细胞粘附的区域自第4个区域开始以及促进血管内皮细胞粘附自第4个区域开始，至浓度最高的第10区域；因此，筛选第4区域为最佳促细胞黏附起始区域。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为28.50ng/cm2；经计算，确定制得生物活性多肽接枝密度为28.50ng/cm2的钛基底，其制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为33.33μM，浸泡时间为48分钟，温度为50℃。
(6)取步骤(1)的钛基底，浸入1mL浓度为33.33μM的RGD多肽溶液中，50℃下静置处理48分钟；取出后，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到RGD多肽接枝的金基底；根据XPS结果与QCM相结合算得RGD多肽接枝的钛基底表面多肽分子的接枝密度为28.50ng/cm2。
(7)在RGD多肽接枝的钛基底表面培养骨髓间充质干细胞，24小时后，利用FITC对其进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜进行观察；同时，以未处理的钛基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞数量为对照组的1.81和1.91倍。
对比例1正交试验
传统用于金基底表面改性的生物活性多肽接枝密度正交筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形金基底利用食人鱼洗液(98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得)处理3分钟，取出金基底材料，用乙醇和去离子水分别清洗3次。
(2)将步骤(1)的金基底平铺固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽HHC36溶液，浓度设为10、20、30、50、100、120、150、和200μM，溶剂为乙醇，使其没过金基底。控制浸泡时间为20、50、60、75、100、150和200min不等，温度为50、60、70和80℃不等；共计224个样品。
(3)取出步骤(2)的金基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到不同生物活性多肽接枝密度的金基底。
(4)将步骤(3)金生物材料在其表面培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，利用Petrifilm大肠菌群检验方法，观察细菌在金生物材料表面的分布情况，以及每一条件下的抗菌效果，通过以上实验确定金基底确定促进最佳抗菌效果，经确定最佳接枝密度下的制备工艺条件为浸泡浓度为100μM，浸泡时间为100min，温度为50℃。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为28.52ng/cm2；同时，以未处理的金基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面抗金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌分别为99.43％，98.82％和99.59％。因此最佳制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为100μM，浸泡时间为100分钟，温度为50℃。
对比例2正交试验
传统用于金基底表面改性的生物活性多肽接枝密度正交筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形金基底利用食人鱼洗液(98％浓硫酸和30％过氧化氢按照体积比7:3混合制得)处理3分钟，取出金基底，用乙醇和去离子水分别清洗3次。
(2)将步骤(1)的金基底材料平铺固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽RGD溶液，浓度设为10、50、100、120、150和200μM，溶剂为乙醇，使其没过金基底材料。控制浸泡时间为20、50、60、75、100、130和200min不等，温度为45、60、70和80℃不等。共计224个样品。
(3)取出步骤(2)的金基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到不同生物活性多肽接枝密度的金基底。
(4)将步骤(3)金基底在其表面分别培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在金基底表面的粘附分布情况，通过以上实验确定钛基底促进最佳细胞粘附效果起始区域，经确定最佳接枝密度下的制备工艺条件为浸泡浓度为100μM，浸泡时间为130min，温度为45℃。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为36.91ng/cm2；同时，以未处理的金基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面干细胞数量和内皮细胞分别为对照组的1.82和1.90倍。因此最佳制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为100μM，浸泡时间为130分钟，温度为45℃。
对比例3正交试验
传统用于钛基底表面改性的生物活性多肽接枝密度正交筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形钛基底利用乙醇和去离子水分别清洗3次，然后经5M氢氧化钠在60℃下处理24h，再用去离子水清洗3遍，然后经0.5mg/mL硅烷偶联剂在50℃下处理12h，再用95％乙醇清洗三遍，氮气吹干，制得含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底。
(2)将步骤(1)的钛基底平铺固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽HHC36溶液，浓度设为10、20、30、50、100、120、150和200μM，溶剂为乙醇，使其没过钛基底。控制浸泡时间为20、50、60、75、100、130和200min不等，温度为30、40、50、60、70和80℃不等。共计336个样品。
(3)取出步骤(2)的钛基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到不同生物活性多肽接枝密度的钛基底。
(4)将步骤(3)钛基底在其表面培养金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌，利用Petrifilm方法，观察细菌在钛基底表面的分布情况，以及每一条件下的抗菌效果，通过以上实验确定钛基底确定促进最佳抗菌效果，经确定最佳接枝密度下的制备工艺条件为浸泡浓度为50μM，浸泡时间为130min,温度为30℃。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为22.68ng/cm2；同时，以未处理的钛基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面对金黄色葡萄球菌，绿脓杆菌和大肠杆菌的抗菌率分别为达到99.94％，98.62％和99.73％。因此最佳制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为50μM，浸泡时间为130分钟，温度为30℃。
对比例4正交试验
传统用于钛基底表面改性的生物活性多肽接枝密度正交筛选方法，步骤如下：
(1)将尺寸为1cm x 1cm x 2mm的方形钛基底利用丙酮、乙醇和去离子水分别清洗3次，然后经5M氢氧化钠在60℃下处理24h，再用去离子水清洗3遍，然后经0.5mg/mL硅烷偶联剂在50℃下处理12h，再用95％乙醇清洗三遍，氮气吹干，制得含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底。
(2)将步骤(1)的钛基底平铺固定于容器中，加入1mL的生物活性多肽RGD溶液，浓度设为10、20、30、50、100、120、150、180和200μM，溶剂为乙醇，使其没过钛基底。控制浸泡时间为20、50、60、75、100、150和190min不等，温度为30、40、50、60、70和80℃不等。共计378个样品。
(3)取出步骤(2)的钛基底，利用乙醇和去离子水分别清洗3次，得到不同生物活性多肽接枝密度的钛基底。
(4)将步骤(3)钛基底在其表面培养骨髓间充质干细胞和血管内皮细胞，24小时后利用FITC进行荧光标记，通过激光共聚焦显微镜，观察细胞在钛基底表面的粘附分布情况，通过以上实验确定钛基底最佳促进细胞粘附效果，经确定最佳接枝密度下的制备工艺条件为为浸泡浓度为10μM，浸泡时间为190min,温度为30℃。根据XPS结果与QCM相结合算得该区域的多肽分子接枝密度为28.55ng/cm2；同时，以未处理的钛基底作为对照组；结果表明，处理之后的样品表面干细胞数量和内皮细胞数量分别为对照组的1.89和1.96倍。因此最佳制备参数为：生物活性多肽溶液的浓度为10μM，浸泡时间为190分钟，温度为30℃。
综上实施例和对比例可以看出，相比于传统的正交实验方法，本发明所述方法可以快速确定制备物活性多肽接枝改性功能化金/钛生物材料的制备参数，包括生物活性多肽的最佳接枝密度、制备过程中浸泡金/钛材料所需的时间、温度以及生物活性多肽溶液的浓度。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基底材料竖直没入并固定于浓度为10～200μmol/L含巯基的生物活性多肽溶液中；所述基底材料为金基底材料或含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底材料；
(2)将生物活性多肽溶液中的溶剂完全蒸发，取出基底材料，清洗，得到生物活性多肽接枝密度梯度化的金/钛生物材料；
(3)通过在步骤(2)的金/钛生物材料表面培养细菌和/或细胞并观察其生长情况，确定生物活性多肽的最佳接枝密度区域；
(4)测定生物活性多肽的最佳接枝密度；
步骤(2)所述完全蒸发的时间控为50～210min；步骤(2)所述蒸发方式为加热和/或抽气；
步骤(2)所述生物活性多肽溶液的溶剂为无水乙醇。
2.根据权利要求1所述的一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述的生物活性多肽溶液中的生物活性多肽为RGD多肽或HHC36多肽。
3.根据权利要求2所述的一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述的生物活性多肽溶液为浓度为10～180μmol/L的RGD多肽溶液或浓度为20～200μmol/L的HHC36多肽溶液。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，其特征在于，所述加热温度为30～80℃，所述抽气的装置为万向抽气罩或通风橱。
5.根据权利要求1或2或3所述的一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，其特征在于，步骤(4)所述测定生物活性多肽的最佳接枝密度的方法为：通过XPS技术与QCM相结合的方法测定步骤(3)所述最佳接枝密度区域对应的接枝密度。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述细菌通过利用Petrifilm大肠菌群检验方法观察其生长情况；所述细胞通过利用FITC荧光标记，并利用激光共聚焦显微镜观察其生长情况。
7.根据权利要求6所述的一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，其特征在于，所述细菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌中的一种以上；所述细胞为骨髓间充质干细胞或血管内皮细胞。
8.根据权利要求1或2或3所述的一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述金基底材料在使用前经过食人鱼洗液处理2～5min，然后再用丙酮、乙醇和水分别清洗1～3次；
所述含双键的硅烷偶联剂修饰的钛基底材料在使用前经过无水乙醇和水各超声清洗15min，然后氮气吹干，
步骤(2)所述清洗为：取出的基底材料用丙酮、乙醇和水分别清洗1～3次。
CN201910211589.2A 2019-03-20 2019-03-20 一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法 Active CN109988814B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910211589.2A CN109988814B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910211589.2A CN109988814B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109988814A CN109988814A (zh) 2019-07-09
CN109988814B true CN109988814B (zh) 2022-08-16

Family

ID=67129206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910211589.2A Active CN109988814B (zh) 2019-03-20 2019-03-20 一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109988814B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112043863B (zh) * 2020-08-02 2021-09-21 华南理工大学 能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体及制备方法
CN114668893B (zh) * 2022-03-11 2023-05-23 华南理工大学 一种基于表面图案化实验平台高通量制备神经修复材料的方法
CN115054737B (zh) * 2022-06-27 2023-06-06 中国科学院金属研究所 一种促内皮化的镍钛合金血管支架表面涂层及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106924805A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 傅亚 诱导内皮细胞迁移运动的peg密度梯度表面的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106924805A (zh) * 2015-12-30 2017-07-07 傅亚 诱导内皮细胞迁移运动的peg密度梯度表面的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gradient biomaterials and their influences on cell migration;Jindan Wu等;《Interface focus》;20120321;第2卷;337-355页 *
Gradient immobilization of a cell adhesion RGD peptide on thermal responsive surface for regulating cell adhesion and detachment;Linhui Li等;《Colloids and surfaces B: Biointerfaces》;20101008;第85卷;12-18页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109988814A (zh) 2019-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109988814B (zh) 一种用于金/钛表面改性的生物活性多肽接枝密度高通量筛选方法
Bonartsev et al. Biosynthesis, biodegradation, and application of poly (3-hydroxybutyrate) and its copolymers-natural polyesters produced by diazotrophic bacteria
CN111808756A (zh) 一种用于处理餐饮油脂废水的微生物菌剂及处理方法
CN108795289B (zh) 一种纳米化钛表面负载Si、Cu-TiO2抗菌型生物活性膜层的制备方法
CN102108130A (zh) 疏水性医用高分子材料的表面生物功能化方法
CN111632192B (zh) 兼具抗菌、促成骨分化及矿化的载碘钛合金植入物及其制备方法
CN112569403A (zh) 一种基于聚多巴胺/氧化石墨烯/胶原纳米膜生物活性缓释涂层构建方法
CN110292654B (zh) 一种负载抗菌多肽的钛合金表面胶原涂层及其制备方法
CN110873795B (zh) 一种生物芯片及其制备和应用
Hirano et al. Effect of sterilization and water rinsing on cell adhesion to titanium surfaces
CN107648674B (zh) 具有抗菌及促进骨整合功能的金属植入物及其制备方法
Liu et al. Magnesium bioactive glass hybrid functionalized polyetheretherketone with immunomodulatory function to guide cell fate and bone regeneration
CN114989475B (zh) 一种生物功能化表面改性的聚醚醚酮材料的制备方法和产品应用
CN110882424A (zh) 一种口腔引导骨再生屏障膜
Sasmazel et al. Functionalization of nonwoven PET fabrics by water/O2 plasma for biomolecule mediated cell cultivation
Ma et al. Enhanced osteogenic activities of polyetheretherketone surface modified by poly (sodium p‐styrene sulfonate) via ultraviolet‐induced polymerization
EP3027234B1 (en) Osteoinductive materials
CN110885849B (zh) 一种重组载体、宿主细胞及稻曲病菌效应蛋白的应用
CN102743788B (zh) 促细胞生长的抗生物污染的材料表面处理方法
Ke et al. Bioactive surface modification on amide-photografted poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)
RU2754927C1 (ru) Способ иммобилизации микроорганизмов на монтмориллонитовые глины
CN113117158B (zh) 表面变性蛋白生物功能化修饰的材料及其制备方法和应用
JPS6384475A (ja) 食酢の製造法
El-Alfy et al. Treatment of cotton fabrics to inhibit bacterial effect of some microorganisms part I: Using separate nano antibacterial agents
CN111150886B (zh) 一种内皮化生物心脏瓣膜及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220831

Address after: Building 31, Chuangzhi, No. 63, Chuangqi Road, Shilou Town, Panyu District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510006

Patentee after: Guangzhou Huarui Medical Instrument Co.,Ltd.

Address before: 510640 No. five, 381 mountain road, Guangzhou, Guangdong, Tianhe District

Patentee before: SOUTH CHINA University OF TECHNOLOGY

TR01 Transfer of patent right