CN112043863B - 能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体及制备方法。该方法包括以下步骤：利用可逆加成‑裂解链转移聚合(RAFT)技术，结合MEO2MA和OEGMA合成MEO2MA‑co‑OEGMA(MPEG)；利用氢氟酸和浓硝酸对钛基植入体进行预处理，之后将植入体浸入MPEG溶液中进行接枝反应；清洗后，将植入体浸入抗菌多肽溶液中，进行接枝反应，得到能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体。本发明所构建的多功能钛基植入体，能够根据温度变化，选择性地表达防污性能、促细胞粘附性能和杀菌性能，在临床骨科上具有广阔的应用前景。

Description

能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多 功能的钛基植入体及制备方法
技术领域
本发明属于医用技术领域，具体涉及一种能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体及制备方法。
背景技术
骨科植入材料是临床用量最大的高端医疗器械之一，钛基植入体因其优异的力学性能和生物相容性能，被广泛用于治疗一些骨缺损疾病，是目前临床上最常用的骨科植入材料之一。但是，细菌感染一直是临床骨科钛基植入体所普遍面临的难题。利用抗菌多肽对钛基植入体进行表面功能化，能够有效抑制细菌感染。然而，前期的研究发现由于表面抗菌多肽的富集，会产生一定的细胞毒性，限制其应用。如何能够构建根据使用环境的变化，而选择性表达响应生物学功能的钛基植入体，成为研究的焦点。
钛基植入体在使用过程中，周围温度会相应发生变化。在手术过程中，处于室温状态，此时要求植入体具有抗污、防细菌粘附的功能；在植入后，处于生理体温状态，此时要求植入体具有促细胞粘附和组织生长的功能；而在细菌感染发生后，由于细菌分泌蛋白酶、磷脂酶等分子，导致感染部位局部温度升高，此时要求植入体具有杀菌功能。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体及制备方法。
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体。
该方法可以通过利用具有温敏响应效应的改性聚乙二醇(MPEG)，并结合抗菌多肽，来构建能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体的制备方法，包括如下步骤：
(1)利用可逆加成-裂解链转移聚合技术，在搅拌状态下结合MEO2MA和OEGMA进行聚合反应，合成具有不同分子量的MEO2MA-co-OEGMA(MPEG)，其结构式如式1所示：
Figure BDA0002614117820000021
然后将钛基植入体浸泡在氢氟酸中，取出，然后再浸泡在浓硝酸溶液中，取出，清洗，干燥(优选氮气吹干)，得到预处理后的钛基植入体；
(2)将MPEG溶液和硼氢化钠溶液按一定比例混合，配置MPEG反应溶液；将步骤(1)所述预处理后的钛基植入体浸泡在所述MPEG反应溶液中，进行接枝反应(巯基－二氧化钛反应)，取出，用无水乙醇洗涤(3次以上)，得到接枝MPEG的钛基植入体；
(3)将抗菌多肽溶液和硼氢化钠溶液按一定比例混合，配置抗菌多肽反应溶液；将接枝MPEG的钛基植入体浸泡在抗菌多肽反应溶液中，进行巯基－二氧化钛反应(接枝反应)，取出，用无水乙醇清洗(3次以上)，得到所述能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体。
优选地，步骤(1)所述清洗为用去离子水清洗3次。
进一步地，步骤(1)所述氢氟酸的体积分数为1-10％，钛基植入体浸泡在氢氟酸的时间为0.2-2min。
优选地，步骤(1)所述氢氟酸的体积分数为10％，钛基植入体浸泡在氢氟酸的时间为1min。
进一步地，步骤(1)所述浓硝酸的质量分数为65％，钛基植入体浸泡在浓硝酸的时间为5-20min。
优选地，步骤(1)所述浓硝酸的质量分数为65％，钛基植入体浸泡在浓硝酸的时间为10min。
优选地，步骤(1)所述的原子转移自由基聚合合成的MPEG溶液聚合的时间为5～50h；反应温度为30～80℃；恒温搅拌器的转速为250～600rpm；所得到的MPEG数均分子量Mn为3000～80000。
进一步地，所述MPEG的结构式如下所示：
Figure BDA0002614117820000031
进一步地，所述MPEG的数均分子量Mn为3000-80000；m的取值范围为6-82，n的取值范围为6-82。
进一步地，在步骤(2)所述MPEG反应溶液中，MPEG的浓度为10-8000μM，硼氢化钠的浓度为1-240mM。
进一步地，步骤(2)所述接枝反应的温度为20-80℃，接枝反应的时间为0.5-48h。
进一步地，在步骤(3)所述抗菌多肽溶液中，硼氢化钠的浓度为1-100mM，抗菌多肽的浓度为10-5000μM。
进一步地，步骤(3)所述抗菌多肽为HHC36多肽、Tet213多肽、BMAP-27多肽和BuforinⅡ多肽中的一种以上，这些多肽均具有抗菌功能。
所述HHC36多肽的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述HHC36多肽的结构式如式2-1所示。
Figure BDA0002614117820000041
所述Tet213多肽的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述Tet213多肽的结构式如式2-2所示。
Figure BDA0002614117820000051
所述BMAP-27多肽的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述BMAP-27多肽的结构式如式2-3所示。
Figure BDA0002614117820000052
所述BuforinⅡ多肽的序列如SEQ ID NO.4所示。
所述BuforinⅡ多肽的结构式如式2-4所示。
Figure BDA0002614117820000053
进一步地，步骤(3)所述巯基－二氧化钛反应的温度为25-45℃，巯基－二氧化钛反应的时间为0.5-60h。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体。所述“抗污－促细胞粘附－杀菌”分别指代选择性抗污、促细胞粘附和杀菌功能。选择性抗污是指代能选择性地防止细菌等微生物的粘附的同时促进细胞粘附。
本发明借助温敏聚合物分子链能够根据温度变化发生坍塌/伸展构象转变这一特性，构建了能够响应以上温度变化，选择性抗污、促细胞粘附和杀菌功能的钛基植入体。该发明能够有效解决临床应用时钛基植入体面临的细菌感染和抗菌表面所带来的细胞毒性问题，具有广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明的多功能钛基植入体具有优异的抗菌性能和生物相容性能；
(2)本发明的多功能钛基植入体可以在不同的温度下表现出所需的生物功能，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例通过酸腐蚀得到表面具有温敏响应的多功能植入体的制备过程示意图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例中所用的大肠杆菌(ATCC 8739)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538p)、绿脓杆菌(ATCC 15442)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC 43300)均购自广东微生物研究中心。人骨髓间充质干细胞购自ScienCell Research Laboratories,California,USA。
实施例1
一种能响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体的制备方法，包括如下步骤(可参照图1所示)：
(1)将2.0g2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于80℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合50h，制得数均分子量Mn为80000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)；透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：5mM硼氢化钠，800μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在45℃下反应10h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由10mM硼氢化钠，300μM HHC36多肽组成的抗菌多肽反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在30℃下反应10h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和HHC36抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为9.04％、8.78％、5.96％和6.69％，抗细菌粘附性能分别为90.23％、92.14％、96.92％和98.29％；在37℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为14.8％、19.43％、7.64％和14.15％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高12.5％；在42℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为98.47％，99.45％，97.67％和99.89％。
实施例2
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于80℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合5h，制得数均分子量Mn为5000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：240mM硼氢化钠，8000μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在45℃下反应18h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由50mM硼氢化钠，850μM Tet213多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在37℃下反应10h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和Tet213抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为18.44％、16.35％、14.33％和19.89％，抗细菌粘附性能分别为91.36％、96.29％、94.23％和96.22％；在37℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为29.67％、24.81％、30.28％和31.56％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高10.68％；在42℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为99.34％、98.21％、96.23％和97.47％。
实施例3
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于30℃，250rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合5h，制得数均分子量Mn为3000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：240mM硼氢化钠，8000μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在80℃下反应0.5h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由100mM硼氢化钠，5000μM HHC36多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在45℃下反应0.5h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和HHC36抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为30.21％、35.29％、26.28％和29.67％，抗细菌粘附性能分别为79.84％、80.57％、84.79％和83.01％；在37℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为40.69％、42.85％、39.18％和37.65％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高7.94％；在42℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为99.56％、98.34％、99.87％和97.64％。
实施例4
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于80℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合50h，制得数均分子量Mn为80000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：240mM硼氢化钠，10μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在80℃下反应0.5h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由1mM硼氢化钠，10μM Tet213多肽组成的抗菌反应溶液上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料，在25℃下反应60h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和Tet213抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为3.63％、2.56％、2.89％和3.46％，抗细菌粘附性能分别为60.45％、59.88％、53.88％和62.49％；在37℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为8.45％、10.11％、9.48％和8.28％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高9.01％；在42℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为42.39％、53.48％、45.21％和56.78％。
实施例5
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于60℃，500rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合18h，制得数均分子量Mn为28000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)；透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：1mM硼氢化钠，4500μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在20℃下反应36h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由80mM硼氢化钠，5000μM BMAP-27多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在45℃下反应0.5h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和BMAP-27抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为35.34％、32.45％、28.31％和29.37％，抗细菌粘附性能分别为86.22％、85.29％、89.34％和88.37％；在37℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为38.19％、42.04％、36.48％和40.10％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高8.62％；在42℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为96.45％，97.34％，98.34％和96.89％。
实施例6
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于65℃，450rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合36h，制得数均分子量Mn为54000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：1mM硼氢化钠，10μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在20℃下反应48h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由1mM硼氢化钠，10μM HHC36多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在25℃下反应60h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和HHC36抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为4.01％、2.06％、4.51％和3.45％，抗细菌粘附性能分别为49.81％、50.11％、38.06％和43.69％；在37℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为8.23％、8.33％、7.51％和8.25％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高8.89％；在42℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为45.19％，54.88％，49.13％和56.29％。
实施例7
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于55℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合20h，制得数均分子量Mn为32000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：1mM硼氢化钠，4000μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在20℃下反应48h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由60mM硼氢化钠，5000μM Tet213多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在45℃下反应0.5h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和Tet213抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为28.01％、30.81％、21.89％和25.89％，抗细菌粘附性能分别为84.59％、86.24％、89.05％和90.19％；在37℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为37.34％、40.18％、35.89％和37.18％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高8.62％；在42℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为95.82％，94.18％，97.39％和96.25％。
实施例8
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于65℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合40h，制得数均分子量Mn为65000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：240mM硼氢化钠，10μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在75℃下反应0.5h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由1mM硼氢化钠，10μM BuforinⅡ多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在25℃下反应50h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和BuforinⅡ抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为4.66％、3.77％、3.83％和4.10％，抗细菌粘附性能分别为66.93％、70.14％、62.46％和63.55％；在37℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为9.10％、9.45％、10.44％和9.28％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高9.98％；在42℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为52.58％，58.59％，51.24％和58.29％。
实施例9
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于70℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合5h，制得数均分子量Mn为4600的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：240mM硼氢化钠，8000μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在50℃下反应24h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由60mM硼氢化钠，1000μM BMAP-27多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在30℃下反应20h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和BMAP-27抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为20.11％、19.56％、18.11％和21.35％，抗细菌粘附性能分别为92.34％、94.84％、93.21％和95.63％；在37℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为30.22％、28.89％、31.28％和34.11％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高9.94％；在42℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为99.78％、98.67％、97.06％和98.38％。
实施例10
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于80℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合50h，制得数均分子量Mn为80000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：200mM硼氢化钠，20μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在70℃下反应0.5h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由2mM硼氢化钠，10μM BMAP-27多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在25℃下反应60h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和BMAP-27多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为3.84％、2.68％、3.01％和3.10％，抗细菌粘附性能分别为65.68％、68.21％、60.46％和61.33％；在37℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为8.79％、9.38％、10.14％和8.98％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高9.86％；在42℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为48.24％，53.89％，47.24％和54.22％。
实施例11
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于30℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合38h，制得数均分子量Mn为31000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：1mM硼氢化钠，3000μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在25℃下反应40h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由100mM硼氢化钠，5000μM BuforinⅡ多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在40℃下反应1h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和BuforinⅡ抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为40.25％、41.36％、36.34％和38.49％，抗细菌粘附性能分别为88.92％、89.47％、90.20％和91.26％；在37℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为50.37％、52.10％、42.19％和46.24％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高9.18％；在42℃下对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为98.56％，99.34％，98.69％和97.89％。
实施例12
(1)将2.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.4g寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)与20mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)混合，在N2状态下置于80℃，600rpm的磁力搅拌器上，加入引发剂4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(AIBN)，聚合6h，制得数均分子量Mn为6000的M(EO)2MA-co-OEGMA(MPEG)。透析，旋干。
(2)将钛基材料依次通过乙醇和去离子水各进行超声清洗15min，然后分别利用浓度为体积比10％的氢氟酸处理1min和质量分数65％浓硝酸处理10min，清洗，氮气吹干。
(3)将步骤(1)中所述的MPEG溶解于无水乙醇中，配置反应溶液，其组成为：220mM硼氢化钠，8000μM MPEG溶液。
(4)将600μL上述反应溶液加入到经酸处理的钛基材料上，反应溶液浸没经过酸处理的钛基材料，在55℃下反应30h，得到MPEG接枝的钛基材料。
(5)利用无水乙醇清洗(4)中所得样品3次，氮气吹干。
(6)配置由80mM硼氢化钠，900μM BuforinⅡ多肽组成的抗菌反应溶液，将400μL该溶液加入到MPEG接枝的钛基材料上，抗菌多肽反应溶液浸没所述MPEG接枝的钛基材料，在37℃下反应10h。
(7)利用无水乙醇清洗(6)中所得样品3次，氮气吹干，得到基于MPEG和BuforinⅡ抗菌多肽的钛基植入体。
(8)通过琼脂板计数法和结晶紫定量试验显示，相比于无改性的钛基植入体，(7)所得的钛基植入体，在25℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的杀菌率分别为24.89％、22.16％、20.34％和22.69％，抗细菌粘附性能分别为94.33％、96.17％、94.36％和95.24％；在37℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为32.44％、35.52％、34.89％和35.67％，CCK-8检测试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)结果显示改性表面骨髓间充质干细胞的活性提高10.24％；在42℃下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌率分别为99.86％、98.94％、97.59％和99.16％。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体及制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Cys Pro Ala Pro Ala Pro Lys Arg Trp Trp Lys Trp Trp Arg Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(人工合成)
<400> 2
Lys Arg Trp Trp Lys Trp Trp Arg Arg Cys
1 5 10
<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(人工合成)
<400> 3
Gly Arg Phe Lys Arg Phe Arg Lys Lys Phe Lys Lys Leu Phe Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ser Pro Val Ile Pro Leu Leu His Leu
20 25
<210> 4
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(人工合成)
<400> 4
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys
20

Claims (9)

1.一种能响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将钛基植入体浸泡在氢氟酸中，取出，然后再浸泡在浓硝酸溶液中，取出，清洗，干燥，得到预处理后的钛基植入体；
(2)将MPEG溶液和硼氢化钠溶液混合均匀，得到MPEG反应溶液；将步骤(1)所述预处理后的钛基植入体浸泡在所述MPEG反应溶液中，进行巯基－二氧化钛反应，取出，清洗，得到接枝MPEG的钛基植入体；
(3)将抗菌多肽溶液和硼氢化钠溶液混合均匀，得到抗菌多肽反应溶液；将接枝MPEG的钛基植入体浸泡在抗菌多肽反应溶液中，进行巯基－二氧化钛反应，取出，清洗，得到所述能响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体；
步骤(2)所述MPEG的结构式如下所示：
Figure FDA0003154402590000011
其中，m的取值范围为6-82，n的取值范围为6-82；所述MPEG的数均分子量Mn为3000-80000。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述氢氟酸的体积分数为1-10％，钛基植入体浸泡在氢氟酸的时间为0.2-2min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述浓硝酸的质量分数为65％，钛基植入体浸泡在浓硝酸的时间为5-20min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)所述MPEG反应溶液中，硼氢化钠溶液的浓度为1-240mM，MPEG的浓度为10-8000μM。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述巯基－二氧化钛反应的温度为20-80℃，巯基－二氧化钛反应的时间为0.5-48h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)所述硼氢化钠溶液中，硼氢化钠的浓度为1-100mM，抗菌多肽的浓度为10-5000μM。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述抗菌多肽为HHC36多肽、Tet213多肽、BMAP-27多肽和BuforinⅡ多肽中的一种以上。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述巯基－二氧化钛反应的温度为25-45℃，巯基－二氧化钛反应的时间为0.5-60h。
9.一种由权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的能够响应温度变化选择性表达“抗污－促细胞粘附－杀菌”多功能的钛基植入体。
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