CN109985048A

CN109985048A - 2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮用于炎症反应的治疗

Info

Publication number: CN109985048A
Application number: CN201711479663.6A
Authority: CN
Inventors: 颜光美; 银巍; 李媛; 张静夏; 林穗珍
Original assignee: Guangzhou Cellprotek Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Cellprotek Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: WO2019129182A1; TWI679013B; CN109985048B; TW201929863A

Abstract

本发明公开了2β,3α,5α‑三羟基雄甾‑6‑酮、其氘代物或其药学上可接受的盐在制备治疗患者的炎症反应的药物中的应用。本发明证实了2β,3α,5α‑三羟基雄甾‑6‑酮通过下调炎症通路关键分子NF‑κB的表达来抑制小胶质细胞和巨噬细胞的激活，从而能够用于治疗炎症。

Description

2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮用于炎症反应的治疗

技术领域

本发明涉及2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮的医药新用途，具体涉及2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮在炎症反应的治疗中的应用。

背景技术

巨噬细胞普遍存在于血液、淋巴和组织中，是固有免疫细胞的一种，是机体的重要的参与天然免疫反应的细胞，具有杀灭细菌、吞噬病原菌、抗原递呈和分泌细胞因子等多项功能，在病原微生物与衰老细胞的清除、促进和抑制炎症反应、诱发适应性免疫反应及损伤组织的修复与重构过程中起着重要作用，既可以维持体内平衡状态，也对疾病的形成与治疗过程起重要作用。

不同PAMP（病原相关分子模式）和DAMP（损伤相关分子模式）可激巨噬细胞向不同方向发生极化，形成M1型和M2型巨噬细胞。例如，促炎因子IFN-γ、TNF以及LPS分别通过IFN-γR、TLR等受体及其下游信号通路NF-κB等刺激产生M1型巨噬细胞极化，极化后的巨噬细胞表达大量TNF-α、IL-1、NO、活性氧中间体等促炎因子，具有较强的抗原递呈能力，同时M1 型巨噬细胞促进Th1 型免疫应答，在炎症早期促进炎症反应，杀伤细胞内感染的病原体。而由IL-4、IL-13、免疫复合物、IL-10、糖皮质激素等诱导极化，活化后的M2 型巨噬细胞表达大量IL-10、TGF-β等抑炎因子，具备精氨酸酶1（(Arg1）、CD206、DC-SIGN、甘露醇受体、清道夫受体CD163、CCR2、CXCR1 等多种标志分子表达，M2 型巨噬细胞极化后主要激活Th2型免疫应答，主要参与抗炎反应、促进组织重构、纤维化以及肿瘤发展等病理过程。M1型、M2型巨噬细胞在特定的微环境下可以相互转换。

M1型巨噬细胞极化的巨噬细胞被认为参与了炎症性疾病、寄生虫感染、哮喘、心血管疾病、肿瘤等多种疾病过程，在其中均发挥重要作用。

小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统的一种神经胶质细胞，约占整个胶质细胞的5～10%，小胶质细胞被广泛认为是脑和脊髓中的巨噬细胞，属于单核吞噬细胞族，是中枢神经系统内的主要免疫效应器。

作为常驻中枢神经系统的免疫效应细胞，小胶质细胞及其介导的神经炎症在中枢神经系统的损伤及疾病的转归过程中起着非常重要的作用。正常情况下，小胶质细胞胞体小，具有细长高度分支的突起，分支上有许多棘状突起。生理条件下，小胶质细胞处于静息状态，发挥免疫监视作用。当中枢神经系统受到炎症、感染和外伤等因素刺激时，小胶质细胞能迅速被激活继而介导多种免疫反应。激活的小胶质细胞体积变大、胞体变圆、细胞表面的突起消失，转变为阿米巴样巨噬细胞状态，能够迅速转移并吞噬清除凋亡神经元、突触及细胞碎片等，维持中枢神经系统内环境稳态，延缓神经退行性疾病发展进程。

临床和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在帕金森病、HIV脑病、多发性硬化和阿兹海默症等神经退化类疾病的发挥重要作用。同时过多激活或失控的小胶质细胞会引起神经毒性，是促炎因子和氧化应激的重要来源，如一氧化氮（NO)、氧自由基、蛋白水解酶、炎性因子如白介素1（IL-1)、肿瘤坏死因子α（TNF-α)与γ干扰素（INF-γ)等，导致脑组织损伤。同时爆发性分泌大量细胞因子和细胞毒性物质，在损伤所致炎症后期，则以分泌BDNF等神经营养因子为主，有利于神经元的营养及修复。

发明内容

本发明的发明人意外发现，2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮通过下调炎症通路关键分子NF-κB的表达来抑制LPS诱导的小胶质细胞和巨噬细胞的激活，从而能够用于治疗炎。

本发明的一方面提供，2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐在制备治疗患者的炎症反应的药物中的应用。在一些实施方式中，所述炎症反应为NF-κB信号通路介导的炎症反应。在一些实施方式中，所述炎症反应为外周炎症反应或中枢神经系统炎症反应。在一些实施方式中，所述外周炎症反应表现为巨噬细胞极化。在一些实施方式中，所述中枢神经系统炎症反应表现为小胶质细胞的激活。在一些实施方式中，所述药物还包含另一治疗剂。在一些实施方式中，所述患者是人。

本发明的另一方面提供一种治疗患者的炎症反应的方法，该方法包括向该患者施用有效量的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐、或包含2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐的药物组合物。在一些实施方式中，所述炎症反应为NF-κB信号通路介导的炎症反应。在一些实施方式中，所述炎症反应为外周炎症反应或中枢神经系统炎症反应。在一些实施方式中，所述外周炎症反应表现为巨噬细胞极化。在一些实施方式中，所述中枢神经系统炎症反应表现为小胶质细胞的激活。在一些实施方式中，所述患者是人。

本发明的再一方面提供2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐用于患者的炎症反应的治疗。在一些实施方式中，所述炎症反应为NF-κB信号通路介导的炎症反应。在一些实施方式中，所述炎症反应为外周炎症反应或中枢神经系统炎症反应。在一些实施方式中，所述外周炎症反应表现为巨噬细胞极化。在一些实施方式中，所述中枢神经系统炎症反应表现为小胶质细胞的激活。在一些实施方式中，所述患者是人。

本发明的又一方面提供一种减轻或消除患者的炎症反应的方法，所述方法包括向患者施用有效量的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐、或包含2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的又一方面提供一种减轻或消除患者的NF-κB信号通路介导的炎症反应的方法，所述方法包括向患者施用有效量的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐、或包含2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的又一方面提供一种减轻或消除患者的外周炎症反应或中枢神经系统炎症反应的方法，所述方法包括向患者施用有效量的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐、或包含2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的又一方面提供一种减轻或消除的外周炎症反应中巨噬细胞极化的方法，所述方法包括向患者施用有效量的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐、或包含2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的又一方面提供一种减轻或消除的中枢神经系统炎症反应中小胶质细胞的激活的方法，所述方法包括向患者施用有效量的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐、或包含2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

附图说明

图1. 2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮阻断LPS诱导的RAW264.7细胞炎症相关信号通路关键分子NF-κB的磷酸化激活。Western blot 检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的NF-κB的磷酸化。

图2. 免疫荧光（IF）检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS刺激后巨噬细胞中NF-κB p65亚基的核移位。

图3. qRT-PCR检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS刺激后RAW264.7细胞中多种炎症因子（A：IL-6，B：iNOS，C：MCP-1）mRNA水平的表达。

图4. IF检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS刺激后巨噬细胞中NF-κB p65亚基的核移位。

图5. 2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的小胶质细胞BV2的激活。（A）相差显微镜术观察BV2细胞的形态；（B）##：与正常对照组比较P＜0.01；**：与LPS处理组比较P＜0.01。

图6. Western blot 检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮阻断LPS诱导的BV2细胞炎症相关信号通路关键分子NF-κB的磷酸化激活。

图7. IF检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制原代小胶质细胞中LPS诱导的炎症信号通路关键分子NF-kB的入核。

具体实施方式

如本文所用，术语“组合物”指适于给预期动物对象施用以达到治疗目的的制剂，其含有至少一种药物活性组分，例如化合物。任选地，所述组合物还含有至少一种药物学上可接受的载体或赋形剂。

术语“药学上可接受的”表示所述物质不具有这样的特性，即考虑到将被治疗的疾病或病症以及各自的施用途径，该特性将会使理性谨慎的医学从业者避免给患者服用该物质。例如，对于可注射物来说，通常要求这样的物质是基本无菌的。

在本文中，术语“治疗有效量”和“有效量”表示所述物质和物质的量对于预防、减轻或改善疾病或病症的一种或多种症状，和/或延长接受治疗的对象的存活是有效的。

本文使用的“治疗”包括给予本申请的化合物或其药学上可接受的盐，以减轻疾病或病症的症状或并发症，或消除疾病或病症。本文使用的术语“减轻”用于描述病症的迹象或症状的严重性降低的过程。症状可减轻而没有消除。在一种实施方案中，给予本申请的药物组合物导致消除迹象或症状。

β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮及其药学上可接受的盐

2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮在本文也称为“YC-10”或“本发明的化合物”，结构式如式(I)所示。业已证实，YC-10具有抗肿瘤及神经保护作用。

（式I）

本发明的化合物可以被配制为药学上可接受盐的形式或者为药学上可接受盐的形式。预期的药学上可接受的盐形式包括，但不限于，单、双、三、四等盐。药学上可接受盐在它们被施用的量和浓度下是无毒的。在不阻止其发挥生理效应的情况下，通过改变化合物的物理特性，这样的盐的制备可以便于药理学应用。在物理性质上有用的改变包括降低熔点以便经粘膜给药，以及增加溶解度以便施用更高浓度的药物。

药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如那些含硫酸盐、氯化物、氢氯化物、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己氨基磺酸盐和奎尼酸盐的盐。药学上可接受的盐可以从酸获得，所述酸例如盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己氨基磺酸、延胡索酸和奎尼酸。

当酸性官能团例如羧酸或酚存在时，药学上可接受的盐也包括碱加成盐，例如那些含有苄星青霉素、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙醇胺、叔丁胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌的盐。使用合适的相应的碱可以制备此类盐。

通过标准技术，可以制备药学上可接受的盐。例如，将游离碱形式的化合物溶解在合适的溶剂中，例如含有适宜酸的水性溶液或水-醇溶液中，然后蒸发溶液进行分离。在另一个实例中，通过使游离碱和酸在有机溶剂中反应来制备盐。

因此，例如，如果特定化合物是碱，则可以通过本领域可得的任何合适方法制备所需的药学上可接受的盐，例如，用无机酸或有机酸处理游离碱，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸和类似酸，所述有机酸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidyl acid) 如葡糖醛酸或半乳糖醛酸、α-羟基酸如柠檬酸或酒石酸、氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸、芳香酸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸如对甲苯磺酸或乙磺酸或类似物。

同样，如果特定化合物是酸，则可以通过任何合适方法制备所需的药学上可接受的盐，例如，用无机碱或有机碱处理游离酸，所述无机碱或有机碱例如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物或类似物。合适的盐的示范性例子包括有机盐，其衍生自氨基酸(如L-甘氨酸、L-赖氨酸和L-精氨酸)、氨、伯胺、仲胺和叔胺，以及环胺(如羟乙基吡咯烷、哌啶、吗啉和哌嗪)，以及无机盐，其衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂。

化合物的药学上可接受的盐可以作为络合物存在。络合物的例子包括8-氯茶碱络合物(类似于，例如，茶苯海明：苯海拉明8-氯茶碱(1:1)络合物；晕海宁)和各种包含环糊精的络合物。

本发明还预期包括使用该化合物的药学上可接受的氘代化合物或其他非放射性取代化合物。氘代是将药物活性分子基团中的一个或多个或全部氢替换成同位素氘，因其无毒无放射性，又比碳氢键稳定约6~9倍，可以封闭代谢位点而延长药物的半衰期，从而降低治疗剂量，同时又不影响药物的药理活性，而被认为是一种优良的修饰方法。

药物组合物

在本发明中，“药物组合物”是指包含YC-10和药学上可接受的载体的组合物，其中化合物和药学上可接受的载体以混合形式存在于组合物中。所述组合物一般将被用于人类对象的治疗。然而，它们也可以被用于治疗在其它动物对象中的相似的或相同的病症。在本文中，术语“对象”、“动物对象” 和类似术语指人和非人类脊椎动物，例如哺乳动物，如非人类灵长类，竞技动物和商业动物，例如马、牛、猪、绵羊、啮齿类动物，和宠物(如狗和猫)。

合适的剂型，部分地取决于用途或给药的途径，例如经口、经皮、经粘膜、吸入或通过注射(肠胃外)。此类剂型应当使该化合物能够到达靶细胞。其它因素在本领域中是熟知的，包括需要考虑的事项，诸如毒性和延迟化合物或组合物发挥其效应的剂型。

载体或赋形剂可以被用于生产组合物。所述载体或赋形剂可以被选择为促进化合物的给药。载体的例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、葡萄糖或蔗糖)、或淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理相容性溶剂。生理上相容性溶剂的例子包括注射用水(WFI)无菌溶液、盐溶液和葡萄糖。

可以通过不同的路径施用组合物或组合物的组分，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、经口、经粘膜、直肠、经皮或吸入。在一些实施方式中，优选注射剂或冻干粉针剂。对口服而言，例如，化合物可以被配制为常规口服剂型，例如胶囊、片剂，以及液体制剂，例如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。

可以获得口服用途的药物制剂，例如通过将组合物或其组分与固体赋形剂组合，任选研磨所形成的混合物，以及在加入合适的辅剂之后(如需要)加工颗粒的混合物，从而获得片剂或糖衣丸。合适的赋形剂特别是，填料例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；纤维素制剂，例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP：聚维酮(povidone))。如果需要，可以加入崩解剂，例如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或它们的盐，例如藻酸钠。

作为选择，可以使用注射(肠胃外给药)，例如肌内的、静脉内的、腹膜内的和/或皮下的。对于注射而言，本发明的组合物或其组分被配制为无菌液体溶液，优选在生理相容的缓冲液或溶液中，例如盐水溶液、Hank溶液或Ringer溶液。另外，组合物或其组分可以被配制为固体形式，并在使用之前一刻被再溶解或悬浮。也可以生产冻干粉形式。

给药也可以通过经粘膜、局部或经皮方式。对于经粘膜、局部或经皮给药，在配方中使用适合待穿透的屏障的穿透剂。这样的穿透剂在本领域中是普遍已知的，包括，例如，对于经粘膜给药，胆汁盐和梭链孢酸衍生物。另外，去垢剂可以用于促进穿透。经粘膜给药，例如，可以通过鼻喷雾或栓剂(经直肠或阴道)。

通过标准程序可以确定待施用的各种组分的有效量，考虑的因素例如所述化合物IC₅₀、所述化合物的生物半衰期、对象的年龄、大小和体重以及与对象有关的病症。这些因素和其它因素的重要性对本领域普通技术人员而言是熟知的。一般而言，剂量将在被治疗的对象的大约0.01mg/kg至50mg/kg之间，优选在0. lmg/kg至20mg/kg之间。可以使用多次剂量。

本发明的组合物或其组分还可以与治疗相同疾病的其他治疗剂结合使用。这种结合使用包括在不同时间施用这些化合物以及一种或多种其他治疗剂，或同时使用这种化合物和一种或多种其他治疗剂。在一些实施方式中，可对本发明的一种或多种化合物或结合使用的其他治疗剂的剂量进行修改，例如，通过本领域技术人员已知的方法降低相对于单独使用的化合物或治疗剂的剂量。

要理解的是，结合使用或联用包括与其他疗法、药物、医学程序等一起使用，其中该其他疗法或程序可在不同于本发明的组合物或其组分的时间(例如，在短期内(如几个小时，如1、2、3、4-24小时)或在较长时间内(如1-2天、2-4天、4-7天、1-4周)或在与本发明的组合物或其组分相同的时间被施用。结合使用还包括与一次或不频繁施用的疗法或医学程序(如手术)一起使用，并伴随本发明的组合物或其组分在该其他疗法或程序之前或之后的短期或较长时间段内的施用。在一些实施方式中，本发明用于递送本发明的组合物或其组分和一种或多种其他药物治疗剂，它们通过相同或不同给药途径递送。

任何给药途径的结合施用包括通过相同给药途径将本发明的组合物或其组分和一种或多种其他药物治疗剂以任何制剂形式一起递送，包括两种化合物化学地相连且它们在施用时保持各自治疗活性的制剂。在一个方面，该其他药物疗法可与本发明的组合物或其组分共同施用。通过共同施用的结合使用包括施用共制剂(co-formulation)或化学上连接的化合物的制剂，或在短期内(例如，一个小时内、2小时内、3小时内、直至24小时内)施用两种或多种独立制剂形式的化合物，它们以相同或不同的途径给药。

独立制剂的共同施用包括经由一个装置的递送的共同施用，例如相同吸入装置、相同注射器等，或相对彼此短期内由不同装置施用。通过相同给药途径递送的本发明的化合物和一种或多种额外的药物疗法的共制剂包括将材料一起制备从而它们可通过一个装置被施用，包括不同化合物组合在一种制剂中，或化合物被修饰从而使得它们在化学上连接在一起但仍保持各自的生物学活性。这种化学上连接的化合物可包括将两个活性成分分开的连接体，该连接体在体内基本维持，或在体内可能降解。

实施例

实施例1.

2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的外周巨噬细胞的炎症反应

1. 细胞：小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，购自ATCC；原代培养腹腔巨噬细胞。

2. 主要试剂：

2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮由广州市赛普特医药科技股份有限公司合成；HP-β-CD，购自西安德立生物科技有限公司；脂多糖LPS (Escherichiacoli 0111:B4,Sigma, Cat.L2630)；抗体：anti-p65 (Santa Cruz. sc-8008)； Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1)Rabbit mAb（CST，Cat.3033）；p38抗体（CST, USA，Cat. 9212,）(1:1000)；p-p38抗体（Thr180/Tyr 182）(CST, USA，Cat. 9216,)(1:1000)；Dulbacco’s Modified Eagle Medium（Gibco，Cat. 10013608R）；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）(Gibco, Cat.10091148）；TRIzol® Reagent（Life，15596-018）。

3. 主要设备：细胞超净台（Thermo，MSC-ADVANTAGE）； CO₂细胞培养箱（Thermo3111，USA）；倒置相差/荧光显微镜（Olympus IX71，Japan）；台式低温高速离心机（Eppendrof，German）；化学发光成像仪（Bio-Rad，USA）；垂直板电泳仪（Bio-Rad Mini-Protein II cells，USA）；转移电槽（Bio-Rad Mini Tran-Biot Transfer Cell, USA ）

2. 实验方法

Western blot 检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的NF-κB的磷酸化。

巨噬细胞细胞系RAW264.7给予不同浓度（0.1μM、0.5μM、2.5μM、10μM）的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮或者阳性药物地塞米松（DXMS）1 μM预处理30min后，加入100 ng/ml LPS刺激30min后，收集蛋白进行Western blot检测。其中羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）为2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮溶剂。具体为M-PER试剂提取细胞总蛋白, BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品20μg ,加入5×SDS 蛋白上样缓冲液，煮沸 5 min 后, 以10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；分离的蛋白用湿转法转移到PVDF膜，之后用5% 脱脂奶粉室温封闭1h；加稀释后的一抗，4°C孵育过夜；TBST 洗涤3 次, 每次5 min, 加入相应二抗, 室温震荡孵育1 h，TBST洗涤3次,每次5min。化学发光法显色拍照。

（免疫荧光）检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的巨噬细胞中NF-κBp65亚基的核移位。

巨噬细胞系RAW264.7给予2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮不同浓度（0.1μM、0.5μM、2.5μM）预处理30min后，加入100 ng/ml LPS刺激。30min后 4%多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光试验检测p65的亚细胞定位。HP-β-CD为2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮溶剂。（蓝色为DAPI染色显示细胞核，绿色为p65蛋白）。

逆转录PCR扩增(RT-PCR)：

细胞处理：RAW264.7给予不同浓度（0.1μM、0.5μM、2.5μM、10μM）的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮或者阳性药物地塞米松（DXMS）1 uM预处理30min后，加入100 ng/ml LPS刺激6小时后，提取总RNA进行检测炎症因子的检测。HP-β-CD为2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮溶剂。

RNA抽提与扩增：1)总RNA的抽提：按照Trizol抽提试剂说明书进行。细胞处理到指定时间点后，吸掉培养基，用PBS清洗2遍洗净培养基。加入1ml Triol充分吹打裂解细胞（以下试剂均按1ml Trizol计算）。加入200ul氯仿，剧烈手摇混匀后室温静置3min。4°C 12000g离心15min，取上层水相400ul到新管中，加入400ul异丙醇，手摇轻柔混匀，室温静置20min。4°C 12000g离心10min，弃上清。加入500ul预冷的75%乙醇，4°C 7500g离心10min，小心弃上清。风干后加适量DEPC水溶解RNA沉淀。2) RNA定量：使用Nanodrop 2000核酸定量仪对RNA进行定量，并测定260/280nm波长下的OD比值，比值在1.8-2.0范围内视为质量较好。3)逆转录反应：每个反应体系RNA总量为2ug，oligo dT 1ul，使用DEPC水调整反应体系为13ul。离心混匀后置于65°C预变性5min。预变性后立刻放于冰上，加入RT Reaction Buffer 4ul，dNTP 2ul，Reverse Transcriptase 1ul。离心混匀后进行逆转录反应。逆转录反应条件为：42°C 60min – 70°C 10min – 4°C。4) PCR扩增反应参数：PCR扩增反应体系为：Taq酶预混液5ul，cDNA 1ul，primer 2ul， ddH2O 2ul。循环参数为：Holding stage：95°C 15min；Cycling stage（40 cycles）： 95°C 10s - 56°C 20s - 72°C 30s；Melt Curve stage：95°C 15s - 60°C 60s - 95°C 15s - 60°C 60s。

IF检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的原代腹腔巨噬细胞中NF-κBp65亚基的核移位。

原代腹腔巨噬细胞给予不同浓度（0.1μM、0.5μM、2.5μM）2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮或者DXMS（地塞米松）1 uM预处理30min后，加入100 ng/ml LPS刺激30min 后，用4%多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光试验检测p65的亚细胞定位。其中HP-β-CD为2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮溶剂。（蓝色为DAPI，绿色为p65蛋白）。

实验结果：

2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮对外周巨噬细胞系RAW264.7中LPS诱导的炎症信号通路关键分子NF-kB的激活具有负性调控作用，并对其下游促炎因子的表达具有抑制作用。

如图1所示，RAW264.7细胞给予LPS刺激后NF-κB被磷酸化激活，而2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮可剂量依赖性地抑制这种上调变化。

图2所示，免疫荧光显示，在LPS刺激30分钟后，2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮可阻断RAW264.7细胞中LPS刺激引起的NF-κB p65亚基的核移位。

同时，qRT-PCR结果显示（图3），2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮可显著抑制LPS诱导引起的IL-6、iNOS、以及MCP-1的mRNA表达水平的上调。

β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制原代腹腔巨噬细胞中LPS诱导的炎症信号通路关键分子NF-kB的入核。

如图4所示，在原代分离培养的腹腔巨噬细胞中给予LPS刺激后NF-κB被磷酸化激活入核，而2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮可显著抑制LPS刺激引起的NF-κB p65亚基的核移位。

实施例2.

2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的中枢小胶质细胞的炎症反应

1)细胞：小鼠小胶质细胞系BV2，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；原代培养小胶质细胞。

主要试剂：

HP-β-CD，购自西安德立生物科技有限公司；2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮由广州市赛普特医药科技股份有限公司合成；脂多糖LPS (Escherichiacoli 0111:B4,Sigma, Cat.L2630)；抗体：anti-p65 (Santa Cruz. sc-8008)； Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1)Rabbit mAb（cell signaling technology，Cat.3033）；p38抗体（CST, USA，Cat. 9212,）(1:1000)；p-p38抗体（Thr 180/Tyr 182）(CST, USA， Cat. 9216,)(1:1000)；Dulbacco’sModified Eagle Medium（Gibco，Cat. 10013608R）；胎牛血清（FBS）(Gibco, Cat.10091148）；TRIzol® Reagent（Life，15596-018）。

主要设备：

细胞超净台（Thermo，MSC-ADVANTAGE）；CO2细胞培养箱（Thermo 3111，USA）；倒置相差/荧光显微镜（Olympus IX71，Japan）；台式低温高速离心机（Eppendrof，German）；化学发光成像仪（Bio-Rad，USA）；垂直板电泳仪（Bio-Rad Mini-Protein II cells，USA）；转移电槽（Bio-Rad Mini Tran-Biot Transfer Cell, USA ）

2. 实验方法

2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的小胶质细胞BV2的激活。（图5）

取处于对数生长期的BV2细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，调节细胞浓度，接种于6孔板上。24h后，用2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮预处理1小时，然后加入LPS（终浓度为100ng/ml）；只加LPS处理为阳性对照；未加任何处理组为阴性对照。处理24h后，相差显微镜下观察阿米巴样细胞并计数，数据进行统计分析。

检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮阻断LPS诱导的BV2细胞炎症相关信号通路关键分子NF-κB的磷酸化激活

处于对数生长期时的BV2细胞调整细胞密度接种于6 孔板，随机分为空白对照组 (未加药物)、LPS组、不同浓度（0.1 μM、0.5μM、2.5 μM、10 μM）的2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮组以及DXMS（地塞米松）阳性对照组。细胞接种24小时后先用2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮或者DXMS预处理30min，然后加入终浓度100ng/ml LPS刺激30min，M-PER试剂提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取蛋白样品20μg，加入5×SDS 蛋白上样缓冲液，煮沸 5 min 后, 以10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；之后用湿转法转移到PVDF膜，以5% 脱脂奶粉室温封闭1h；加稀释后的一抗，4°C孵育过夜；TBST洗涤3次，每次5 min, 加入相应二抗, 室温震荡孵育1 h，TBST洗涤3次，每次5min。化学发光法显色拍照。

检测2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制LPS诱导的原代小胶质细胞中NF-κB p65亚基的核移位。

原代小胶质细胞给予2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮不同浓度或者DXMS（地塞米松）0.5 uM预处理30min后，加入100 ng/ml LPS刺激。30min 后4%多聚甲醛固定细胞进行免疫荧光试验检测p65的亚细胞定位。其中HP-β-CD为2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮溶剂。（蓝色为DAPI，绿色为p65蛋白，红色为小胶质细胞标记物Iba-1蛋白）。

实验结果：

2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮通过下调炎症信号通路关键分子NF-κB而抑制LPS诱导的小胶质细胞系BV2的激活。

如图5所示， BV2细胞给予LPS刺激24小时后，细胞呈现明显的激活形态，而2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮可剂量依赖性地减少激活形态的细胞数量。

如图6所示，BV2细胞给予LPS刺激后NF-κB被磷酸化激活，而2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮可剂量依赖性地抑制这种上调变化；与单加LPS刺激组比较，0.5μM 2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮已经显著抑制LPS刺激后NF-kB p65亚基Ser536磷酸化，同时p65总蛋白也有显著下调。

β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮抑制原代小胶质细胞中LPS诱导的炎症信号通路关键分子NF-kB的入核。

如图7所示，在原代分离培养的小胶质细胞中给予LPS刺激后NF-κB被磷酸化激活入核，而2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮可显著抑制LPS刺激引起的NF-κB p65亚基的核移位。

我们的实验结果显示，2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮通过下调炎症通路关键分子NF-κB的表达来抑制LPS诱导的小胶质细胞和巨噬细胞的激活，强烈提示2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮具有拮抗炎症反应的作用。

Claims

1.2β,3α,5α-三羟基雄甾-6-酮、其氘代物或其药学上可接受的盐在制备治疗患者的炎症反应的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述炎症反应为NF-κB信号通路介导的炎症反应。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述炎症反应为外周炎症反应或中枢神经系统炎症反应。

4.根据权利要求3所述的应用，其中所述外周炎症反应表现为巨噬细胞极化。

5.根据权利要求3所述的应用，其中所述中枢神经系统炎症反应表现为小胶质细胞的激活。

6.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物还包含另一治疗剂。

7.根据权利要求1所述的应用，其中所述患者是人。