CN109971718A - 获得高阳性率car-t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及获得高阳性率CAR‑T细胞的方法，该方法包括使用CD28抗体和该CAR‑T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原孵育所述CAR‑T细胞的步骤。采用本发明的方法，初始可获得中等阳性比例的CAR‑T细胞，有助于其增殖，而且由于对特异性抗原的记忆，群体中的CAR‑T细胞比例会越来越高，最终获得大量高阳性率的CAR‑T细胞。

Description

获得高阳性率CAR-T细胞的方法
技术领域
本发明涉及获得高阳性率CAR-T细胞的方法。
背景技术
癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前常用的治疗手段效果十分有限，仍需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。
针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得了令人瞩目的临床疗效。自2011年，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JCO分别发表相同题目“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(Nature.2011；480(7378):480；J ClinOncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究热潮。
嵌合抗原受体T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗的重要分支之一，在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。2017年8月，美国FDA批准了诺华的tisagenlecleucel嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗用于治疗儿童和年轻成年患者急性淋巴细胞性白血病(ALL)，成为第一个批准上市的CAR-T药物。紧接着同年10月，美国FDA又宣布批准了Kite Pharma的CAR-T疗法Yescarta上市，治疗罹患特定类型的大B细胞淋巴瘤成人患者。CAR-T药物的陆续获批使得CAR-T治疗迈上了一个新的台阶。
嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的抗体单链可变区(single-chain fragment variable，scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)”在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体系统将其导入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为嵌合型抗原受体T细胞(即CAR-T细胞)。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。
但是，目前CAR-T细胞治疗总体疗效仍不尽如人意，尤其是针对实体瘤。其中转染效率低，难以获得高阳性率的CAR-T细胞是一个很重要的原因。对于PBMC的转染来说，无论是病毒载体还是PB转座酶等非病毒载体，其转染效率都很难突破50％，通常只能达到20％左右。一般必须通过准备大量的细胞才能保证足够量的CAR-T阳性细胞。
为了提高CAR-T的阳性率，科研人员经过了大量的实验摸索。通常情况下，T细胞转染CAR基因后会通过CD3/CD28抗体包被或者CD3/CD28抗体磁珠刺激T细胞活化，但是这种刺激方法对于T细胞是广谱性的，无论是否转染进CAR基因，都会被活化。由于竞争生长，CAR-T细胞比例可能会被不断稀释，最终获得的T细胞群体中，CAR-T比例很低。
为了解决这一问题，有人尝试用特异性抗原来活化转染CAR基因后的T细胞，该方法是用特异性抗原与scFv的结合作为T细胞活化的第一信号，并将信号转导至CAR-T细胞胞内共刺激区，激活第二信号来活化T细胞，这样虽然能获得很高阳性比例的CAR-T细胞，但是其增殖很慢，很难获得大量的目的细胞。原因可能是由于T细胞集群效应，T细胞增殖旺盛时通常会聚集成团，细胞相互之间会分泌一些细胞因子来促进增殖，由于转染效率不高，导致初始的CAR-T细胞量不够，增殖很慢。
发明内容
本发明提供一种制备CAR-T细胞的方法，所述方法包括使用CD28抗体和该CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原孵育所述CAR-T细胞的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述抗原是所述CAR-T细胞表达的CAR的单链抗体特异性结合的抗原。
在一个或多个实施方案中，所述抗原与CD28抗体的用量比为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1。
在一个或多个实施方案中，所述CAR以间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白为靶点。
在一个或多个实施方案中，所述抗原为间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述CAR-T细胞经表达所述CAR的非病毒载体转染。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括：
(1)采用表达所述CAR的非病毒载体转染宿主T细胞；
(2)转染4～8小时后使所述T细胞与所述CD28抗体和该CAR靶向的抗原孵育。
在一个或多个实施方案中，孵育时还加入刺激因子IL-2。
本发明还提供一种用于制备CAR-T细胞的组合物，所述组合物含有CD28抗体和待制备的CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原。
在一个或多个实施方案中，所述抗原是待制备的CAR-T细胞表达的CAR的单链抗体特异性结合的抗原。
在一个或多个实施方案中，所述组合物中所述抗原与CD28抗体的用量比为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1。
在一个或多个实施方案中，所述抗原为间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白。
在一个或多个实施方案中，所述组合物中CD28抗体的浓度为2～8ug/ml，抗原的浓度为1～10ug/ml。
在一个或多个实施方案中，所述组合物还含有IL-2，优选地，组合物中所述IL-2的含量为50～1000U/ml。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有CD28抗体和抗原，所述抗原为待制备的CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体所靶向。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还含有IL-2。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还含有将嵌合抗原受体表达框整合入宿主细胞基因组的载体。
在一个或多个实施方案中，所述载体是转座子载体，优选地，所述转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。
在一个或多个实施方案中，所述载体在5’LTR和3’LTR之间是嵌合抗原受体的表达框，包括启动子序列、嵌合抗原受体的编码序列以及polyA加尾信号序列。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还含有转染试剂和/或仪器。
本发明还提供CD28抗体与抗原的组合在促进CAR-T细胞增殖中的应用，其中，所述抗原是所述CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体所靶向的抗原。
在一个或多个实施方案中，所述应用中，所述抗原与CD28抗体的用量比为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1。
在一个或多个实施方案中，所述抗原为间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白。
附图说明
图1：CAR基因的结构示意图。
图2：PBMC通过电穿孔法转染meso3CAR基因，分别在antiCD3/antiCD28、以及mesothelin/antiCD28刺激下，其CAR-T阳性率比较。
图3：特异性抗原与CD28抗体不同配比条件下CAR-T细胞阳性率。
图4A：RTCA检测不同阳性率的meso3CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤。
图4B：不同阳性率的meso3CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤率统计。
图5：流式检测meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2-CAR五种CAR-T在antiCD3/antiCD28、以及相对应抗原/antiCD28刺激下阳性细胞比例。
图6A-6B：特异性抗原与CD28抗体组合制备的meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2-CAR五种CAR-T细胞中记忆T群体比例。图中，Tem为效应记忆T细胞；Tcm为中枢记忆T细胞；Tm为总的记忆T细胞，即Tem与Tcm之和。
图7：特异性抗原与CD28抗体组合以及单独特异性抗原制备的meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2-CAR五种CAR-T细胞增殖情况。
具体实施方式
本发明人经过大量实验和创造性的劳动，建立了成熟的获得高阳性率CAR-T细胞的制备方法，实现了对肿瘤细胞株更有效地杀伤。具体而言，本发明通过特异性抗原与CD28抗体的组合来制备CAR-T细胞，初始会获得中等阳性比例的CAR-T细胞，有助于其增殖，而且由于对特异性抗原的记忆，群体中的CAR-T细胞比例会越来越高，最终获得大量高阳性率的CAR-T细胞。
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。本文未解释的其它术语，其具有本领域通用含义。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单链抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable，Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80，CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”和“靶向”具有类似的含义。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”或者“患者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型。
“抗原”通常指能诱发免疫反应的物质。本文中的抗原尤其指嵌合抗原受体所靶向的抗原，尤其是与嵌合抗原受体中的单链抗体特异性结合的抗原。
本发明提供一种制备CAR-T细胞的方法，所述方法包括使用CD28抗体和该CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原孵育所述CAR-T细胞的步骤。
CD28抗体为是本领域周知的CD28抗体，尤其是本领域常用于CAR-T细胞的增殖培养的CD28抗体。
针对不同CAR-T细胞，用于孵育的抗原不同。具体而言，该抗原应是该CAR-T细胞所表达的CAR所靶向的抗原，尤其是该CAR中的单链抗体能特异性结合的抗原。
本文中，感兴趣的嵌合抗原受体可针对如下抗原中的一种或多种：Her2、CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1，β1,4-乙酰基-氨基半乳糖基转移酶1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL(前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(α-胎蛋白)、MUC1(mucin 1，细胞表面相关)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3(又称ST8SIA1，ST8α-N-乙酰基-神经酰胺α-2,8-唾液酸转换酶1)、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、β2-MG(β-2-微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)。
在某些实施方案中，感兴趣的嵌合抗原受体为针对Her2、CD19、EGFR、间皮素或粘蛋白(Muc1)的嵌合抗原受体。应理解的是，除非另有说明，否则本文所述的各种抗原均是本领域周知的抗原，其序列为本领域所周知。
因此，适用于本发明的抗原可以是其特异性抗体(如单链抗体，scFv)可被用来构建嵌合抗原受体以制备相应的CAR-T细胞的抗原，包括但不限于前文所列的抗原，尤其包括Her2、CD19、EGFR、间皮素和Muc1。
可使已有的CAR-T细胞与CD28抗体和相应的抗原一同孵育。在某些实施方案中，可先构建CAR-T细胞，然后在将构建得到的CAR-T细胞与CD28抗体及相应的抗原共同孵育。因此，在某些实施方案中，本发明制备CAR-T细胞的方法还包括构建CAR-T细胞的步骤。
可采用本领域常规的方法制备CAR-T细胞，包括使用合适的重组质粒转染合适的T细胞。
重组质粒中通常含有嵌合抗原受体的编码序列。适用于本发明的CAR通常含有任选的信号肽序列、特异性识别所述抗原的氨基酸序列、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。信号肽可以是分泌型信号肽或膜结合型信号肽。合适的信号肽包括CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽和轻链信号肽。示例性的CD8信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:7第1-21位氨基酸残基所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:2第1-66位碱基序列所示或如SEQ ID NO:8第1-63位碱基序列所示。
嵌合抗原受体中特异性识别抗原的氨基酸序列通常为抗体，尤其是单链抗体。可采用本领域周知的技术制备针对某抗原的单链抗体。在某些实施方案中，嵌合受体抗原中的单链抗体可选自针对前文所述任一种抗原的单链抗体，尤其是针对Her2、CD19、EGFR、间皮素或Muc1的单链抗体。在某些实施方案中，针对间皮素的单链抗体的氨基酸序列如SEQID NO:1第23-272位氨基酸残基所示；针对EGFR的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第23-263位氨基酸残基所示；针对Her2的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第23-264位氨基酸残基所示；针对CD19的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第22-263位氨基酸残基所示；针对粘蛋白的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:9第23-269位氨基酸残基所示。这些单链抗体相应的编码序列可分别如SEQ ID NO:2、4、6、8和10中相应部分所示。
铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。合适的铰链区可选自CD8的胞外铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种。铰链区优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区。示例性的IgG4 FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第273-500位氨基酸残基所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:2第817-1500位碱基序列所示。示例性的CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第264-318位氨基酸残基所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:4第789-954位碱基序列所示。
跨膜区可以是CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种。示例性的CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第501-528所示，其编码序列优选如SEQ ID NO:2第1501-1584位碱基所示。示例性的CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3第319-344位氨基酸残基所示，其编码序列优选如SEQ IDNO:4第955-1032位碱基序列所示。
胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10(DAP10)的胞内结构域。示例性的CD28的胞内结构域的氨基酸序列如SEQID NO:1第529-569位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:2第1585-1707位碱基所示。示例性的CD137/4-1BB的胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:7第333-374位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:8第996-1122位碱基序列所示。
胞内信号域优选为免疫受体酪氨酸活化基序，可以是CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域。示例性的CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第570-681位氨基酸残基所述，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:2第1708-2043所示。
形成嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
可采用PCR扩增法获得嵌合抗原受体的编码序列。具体而言，可根据目标序列设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
示例性的嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:2、4、6、8和10所示。
获得嵌合抗原受体的编码序列后，可采用常规的方法将其克隆到合适的载体中。通常，载体中含有相应的启动子序列和polyA加尾信号序列。若载体中不含有这些序列使，可采用本领域常规的方法将这些序列连接到嵌合抗原受体的编码序列。优选的载体是非病毒载体，更优选是可将嵌合抗原受体的表达框整合到宿主细胞的基因组中的载体(也称为整合载体)中，尤其是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’LTR和3’LTR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。在5’LTR和3’LTR之间是CAR的表达框，包括相应的启动子序列、CAR的编码序列以及polyA加尾信号序列。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。
在某些实施方案中，使用CN 201510638974.7所公开的pNB328载体作为骨架载体，构建含有嵌合抗原受体的编码序列的重组质粒。
构建得到重组质粒后，可采用本领域常规的转染方法进行转染，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述载体转染感兴趣的细胞中。
感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。在某些实施方案中，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，T细胞为原代培养T细胞。
转染至少4小时后，例如转染后4～8小时或6～8小时，将所得细胞与本发明所述的CD28和抗原孵育，同时加入刺激因子IL-2。以质量计，抗原与CD28抗体的用量比通常为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1。在某些实施方案中，CD28抗体的浓度为2～8ug/ml，例如5ug/ml；抗原的浓度为1～10ug/ml，例如2.5～10ug/ml，或5～10ug/ml。IL-2的浓度通常为50～1000U/ml。孵育条件为常规的孵育条件，例如37℃、5％CO2气氛。
如此培养一段时间，例如7天以上，可获得CAR-T细胞阳性率在50％以上的T细胞混合物。在某些实施方案中，采用本发明的方法可获得CAR-T细胞阳性率在80％以上的T细胞混合物。
本发明还提供一种用于制备CAR-T细胞的组合物，所述组合物含有CD28抗体和待制备的CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原。优选地的是，所述抗原是待制备的CAR-T细胞表达的CAR的单链抗体特异性结合的抗原。
抗原可以是前文所述的任意一种抗原。在某些实施方案中，抗原为间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白。
组合物中所述抗原与CD28抗体的用量比为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1。在某些实施方案中，组合物中CD28抗体的浓度为2～8ug/ml，抗原的浓度为1～10ug/ml。
在某些实施方案中，组合物中还可含有IL-2。优选地，组合物中所述IL-2的含量为50～1000U/ml。
组合物还可含有合适的溶剂。在某些实施方案中，溶剂是PBS。
本发明某些方面还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有CD28抗体和本文所述的抗原。试剂盒中所述CD28抗体和抗原可单独包装，也可以混合物的形式存在。因此，在某些实施方案中，本发明的试剂盒含有本文所述的组合物。在某些实施方案中，试剂盒中还含有IL-2。
试剂盒还可含有将嵌合抗原受体表达框整合入宿主细胞基因组的载体。载体可以是本文所述的载体，优选地，载体是转座子载体；更优选地，转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。
在某些实施方案中，载体是空白载体。本领域技术人员可利用该空白载体构建含有嵌合抗原受体的编码序列的重组载体，再使用试剂盒中所含的CD28抗体和相应的抗原，用于制备相应的CAR-T细胞。空白载体可以是例如本文所述的pNB328载体或其它本领域常规用于构建CAR的载体。此时，试剂盒中还可含有合适的试剂，用于利用该空白载体构建重组载体。
在某些实施方案中，载体是含有CAR的编码序列的载体。此时，试剂盒中所含的抗原应是能被该CAR的单链抗体特异性结合或识别的抗原。
在某些实施方案中，试剂盒还可含有转染试剂和/或仪器。
本发明还提供本文所述的CD28抗体与抗原的组合在促进CAR-T细胞增殖中的应用。优选地，所述应用中，以质量计，所述抗原与CD28抗体的用量比为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1。优选地，所述抗原为间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1：重组质粒的构建
委托上海捷瑞生物公司合成meso3CAR、EGFRCAR、HER2CAR、MUC1CAR和CD19CAR的基因序列，分别如SEQ ID NO:2、4、6、8和10所示，其结构模式如图1所示，其中，mesoCAR和CD19CAR的铰链区为IgG4 CH2CH3铰链区，另外三种CAR的铰链区为CD8α铰链区。
将上述基因序列分别装入pNB328载体EcoRI和SalI酶切位点之间，构建出的重组质粒分别命名为pNB328-meso3CAR、pNB328-EGFR-CAR、pNB328-HER2-CAR、pNB328-MUC1-CAR和pNB328-CD19CAR。
pNB328载体的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。
实施例2：比较antiCD3/antiCD28与mesothelin/antiCD28两种方法制备的meso3CAR T细胞阳性率
1、meso3CAR T细胞构建：外周血单核细胞(PBMCs)由Ficoll分离法分离获得。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清。加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；取两个1.5ml离心管，每管加入5×106个细胞，编号a、b，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，a、b管按比例加入电转试剂共100ul，并加入6ug实施例1构建得到的重组质粒pNB328-meso3CAR，重悬混匀细胞；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪(来自Lonza公司)，选取U-014程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中(含2％FBS的AIM-Ⅴ培液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养。
2、抗体或抗原包被方法：将CD3与CD28抗体或间皮素抗原与CD28抗体以5ug/ml的浓度加到PBS中，充分混匀，以1ml每孔的量加入六孔板中，4℃过夜或37℃放置4小时。使用时弃掉液体。
3、培养及扩增：CAR-T细胞电转六小时后将两个孔的细胞加到一起，混匀后分成两份，一份放入antiCD3/antiCD28抗体包被的六孔板中，另一份放入间皮素抗原与CD28抗体包被的六孔板中，5×106～1×107个细胞/孔，并加入刺激因子IL-2(500U/ml)，37℃，5％CO2培养4～5天，观察T细胞的生长情况，获得表达meso3CAR基因的T细胞。
4、CAR-T细胞阳性率检测：分别收集第7天、第15天的细胞流式检测阳性率。具体操作方法：收集细胞，每管1×106，加入1ug一抗meso-Biotin(在间皮素抗原上加上生物素标记)，4℃孵育30分钟。生理盐水洗两遍，加入1ul二抗链霉素-PE，4℃孵育30分钟。生理盐水洗两遍，上机检测。以只加二抗为阴性对照，结果如图2所示。
实施例3：比较不同抗原与CD28抗体配比条件下CAR-T细胞阳性率
分别用1ug、2.5ug、5ug、10ug的间皮素抗原与相同量的CD28抗体(5ug/ml)包板，4℃冰箱过夜。如实施例2所述构建meso3CAR T细胞。电转好的细胞分别在不同的配比条件下培养，在第15天检测CAR T细胞阳性率，检测方法如实施例2所述，结果如图3所示。
实施例4：比较不同阳性率的meso3CAR T细胞对肿瘤细胞株的杀伤作用
采用实时无标记细胞功能分析仪检测不同阳性率的meso3CAR T细胞对肿瘤细胞株的杀伤作用。具体而言，选取间皮素高表达的卵巢癌细胞株SKOV3作为靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测不同阳性率(10％、30％、50％、70％和90％，不同阳性率的meso3CAR T细胞可以通过在高阳性率的meso3CAR T细胞中加入转入pNB328空载体的Mock T细胞来调整)的meso3CAR T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；
(2)靶细胞铺板：卵巢癌细胞SKOV3(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入各种阳性率的效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，开始step 3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。
结果发现，meso3CAR T细胞阳性率越高其杀伤结果越强，具体如图4A和4B所示。
实施例5：比较antiCD3/antiCD28与特异性抗原/antiCD28两种方法制备的meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2CAR五种CAR-T细胞阳性率比较
采用实施例2所述的方法，使用的质粒分别为pNB328-meso3CAR、pNB328-EGFR-CAR、pNB328-MUC1-CAR、pNB328-CD19CAR、pNB328-HER2-CAR分别构建meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2CAR五种CAR-T细胞。
分别用antiCD3/antiCD28以及特异性抗原/antiCD28包板对相应的CAR-T进行培养扩增，扩增的方法与实施例2所述的方法相同。所述特异性抗原分别是间皮素抗原、EGFR、粘蛋白、CD19以及Her2，各抗原的浓度均为5ug/ml，CD28抗体的浓度为5ug/ml。
在第15天收集各种CAR-T细胞，流式检测其阳性率，检测方法与实施例2所述相同。使用的一抗分别为meso-Biotin、EGFR-Biotin、MUC1-Biotin、CD19-Biotin、Her2-Biotin。
结果显示，各种CAR-T细胞在特异性抗原与CD28抗体组合的制备条件下其阳性率都显著升高，具体如图5所示。
实施例6：比较antiCD3/antiCD28与特异性抗原/antiCD28两种方法制备的meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2CAR五种CAR-T细胞中记忆T细胞比例
如实施例2所述构建meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2CAR五种CAR-T细胞，并如实施例5所述培养及扩增这五种CAR-T细胞。在第15天，收集细胞，使用CD45RO、CCR7抗体，流式检测记忆T比例。
结果如图6A、6B所示，选择性扩增体系下的CAR-T细胞会产生更高比例的记忆T细胞。
实施例7：特异性抗原与CD28抗体组合以及单独特异性抗原两种制备条件下的meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2-CAR五种CAR-T细胞增殖情况
如实施例4所述构建meso3CAR、EGFR-CAR、MUC1CAR、CD19CAR、Her2CAR五种CAR-T细胞。分别在特异性抗原与CD28抗体(浓度均为5ug/ml)组合以及单独特异性抗原(浓度为10ug/ml)两种制备条件下培养。初始细胞量一致，计算第15天的细胞数，进行统计。
结果显示，特异性抗原与CD28抗体组合制备条件下的CAR-T细胞扩增效率显著升高，具体如图7所示。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 获得高阳性率CAR-T细胞的方法
<130> 179824
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 681
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg
115 120 125
Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser
180 185 190
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp
245 250 255
Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
260 265 270
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
275 280 285
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
290 295 300
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
305 310 315 320
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
325 330 335
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr
340 345 350
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
355 360 365
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
370 375 380
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
385 390 395 400
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
405 410 415
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
420 425 430
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
435 440 445
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
450 455 460
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
465 470 475 480
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
485 490 495
Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
500 505 510
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
515 520 525
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
530 535 540
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
545 550 555 560
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
565 570 575
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
580 585 590
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
595 600 605
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
610 615 620
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
625 630 635 640
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
645 650 655
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
660 665 670
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675 680
<210> 2
<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgagcgagg tgcagctggt ggagtccggg ggaggcctgg tccagcctgg gggatccctg 120
agactctcct gcgcagcctc tggattcgac ctcggtttct acttttacgc ctgttgggtc 180
cgccaggctc cagggaaggg cctggagtgg gtctcatgca tttatactgc tggtagtggt 240
agcacgtact acgcgagctg ggcgaaaggc cgattcacca tctccagaga caattcgaag 300
aacacgctgt atctgcaaat gaacagtctg agagccgagg acacggccgt gtattactgt 360
gcgagatcta ctgctaatac tagaagtact tattatctta acttgtgggg ccaaggcacc 420
ctggtcaccg tctcctcagg cggaggcgga tcaggtggtg gcggatctgg aggtggcgga 480
agcgacatcc agatgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtggg agacagagtc 540
accatcactt gccaggccag tcagaggatt agtagttact tatcctggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag ttcccaagct cctgatctat ggtgcatcca ctctggcatc tggggtcccc 660
tcgcggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 720
cctgaagatg ttgccactta ctactgtcag agttatgctt attttgatag taataattgg 780
catgctttcg gcggagggac caaggtggag atcaaagagt ccaaatatgg tcccccatgc 840
ccaccatgcc cagcacctcc cgtggccgga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc 900
aaggacactc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc 960
caggaagacc ccgaggtcca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaggt gcataatgcc 1020
aagacaaagc cgcgggagga gcagttccag agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1080
gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 1140
ctcccgtcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agagccacag 1200
gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1260
ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1320
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1380
agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga atgtcttctc atgctccgtg 1440
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacaca cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 1500
cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 1560
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 1620
atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 1680
ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 1740
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1800
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1860
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1920
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1980
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 2040
cgctga 2046
<210> 3
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile
20 25 30
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly
50 55 60
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
85 90 95
Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
115 120 125
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
165 170 175
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
195 200 205
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys
260 265 270
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
325 330 335
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
340 345 350
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
355 360 365
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370 375 380
Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
385 390 395 400
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
405 410 415
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
420 425 430
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
435 440 445
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
450 455 460
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
465 470 475 480
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
485 490 495
Arg
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<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
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gtcagtttct cctgcagggc cagtcagagt attggcacaa acatacactg gtatcagcaa 180
agaacaaatg gttctccaag gcttctcata aagtatgctt ctgagtctat ctctgggatc 240
ccttccaggt ttagtggcag tggatcaggg acagatttta ctcttagcat caacagtgtg 300
gagtctgaag atattgcaga ttattactgt caacaaaata ataactggcc aaccacgttc 360
ggtgctggga ccaagctgga gctgaaaggt ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc 420
ggtggcgggt cgcaggtgca gctgaagcag tcaggacctg gcctagtgca gccctcacag 480
agcctgtcca tcacctgcac agtctctggt ttctcattaa ctaactatgg tgtacactgg 540
gttcgccagt ctccaggaaa gggtctggag tggctgggag tgatatggag tggtggaaac 600
acagactata atacaccttt cacatccaga ctgagcatca acaaggacaa ttccaagagc 660
caagttttct ttaaaatgaa cagtctgcaa tctaatgaca cagccatata ttactgtgcc 720
agagccctca cctactatga ttacgagttt gcttactggg gccaagggac tctggtcact 780
gtctcttcgt tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960
atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020
tactgcaacc acaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 1080
ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 1140
gcagcctatc gctccagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1200
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gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1320
gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1380
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<211> 498
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala
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275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
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Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
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Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
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Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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<212> DNA
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<400> 6
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
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Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
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275 280 285
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
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Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
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100 105 110
Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
165 170 175
Phe Ser Gly Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Ile Tyr Tyr
195 200 205
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
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225 230 235 240
Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Gly Asp Asn Tyr Tyr Glu Tyr Phe
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Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys
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275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
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Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
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Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
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Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
660 665 670
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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gacaatgcca agaacaccct gtacctgcaa atgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc 720
atgtattact gtgcaagact tgggggggat aattactacg aatacttcga tgtctggggc 780
gcagggacca cggtcaccgt ctcctccgag tccaaatatg gtcccccatg cccaccatgc 840
ccagcacctc ccgtggccgg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 900
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 960
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020
ccgcgggagg agcagttcca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1140
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1200
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1380
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa acccttttgg 1500
gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct tgctatagct tgctagtaac agtggccttt 1560
attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc acagtgacta catgaacatg 1620
actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 1680
ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1740
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1800
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1860
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1920
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1980
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgc 2034

Claims (12)

1.一种制备CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使用CD28抗体和该CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原孵育所述CAR-T细胞的步骤；优选地，所述抗原是所述CAR-T细胞表达的CAR的单链抗体特异性结合的抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以质量计，所述抗原与CD28抗体的用量比为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体靶向如下抗原：Her2、CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY、EpCAM、间皮素、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG和PROGRP；优选靶向间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述CAR-T细胞经表达所述CAR的非病毒载体转染；
优选地，所述非病毒载体是转座子载体，优选含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)采用表达所述CAR的非病毒载体转染宿主T细胞；和
(2)转染4～8小时后使所述T细胞与所述CD28抗体和该CAR靶向的抗原孵育；
优选地，孵育时还加入刺激因子IL-2。
6.一种用于制备CAR-T细胞的组合物，其特征在于，所述组合物含有CD28抗体和待制备的CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原；优选地，所述抗原是待制备的CAR-T细胞表达的CAR的单链抗体特异性结合的抗原。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述抗原选自：Her2、CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY、EpCAM、间皮素、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG和PROGRP；优选靶向间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白。
8.如权利要求6或7所述的组合物，其特征在于，以质量计，所述组合物中所述抗原与CD28抗体的含量比为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1
优选地，所述组合物中CD28抗体的浓度为2～8ug/ml，抗原的浓度为1～10ug/ml；
优选地，所述组合物还含有IL-2，优选地，IL-2的浓度为300～1000U/ml。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有CD28抗体和抗原，所述抗原为待制备的CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体所靶向；优选地，所述抗原选自：Her2、CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY、EpCAM、间皮素、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG和PROGRP；优选靶向间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有：
IL-2；
用于将嵌合抗原受体表达框整合入宿主细胞基因组的载体，其中，所述载体为空载体或含有所述表达框的载体；优选地，所述载体是转座子载体，优选地，所述转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体；和/或
转染试剂和/或仪器。
11.CD28抗体与抗原的组合在促进CAR-T细胞增殖中的应用，其中，所述抗原是所述CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体所靶向的抗原；
优选地，所述抗原选自：Her2、CD19、CD20、CEA、GD2、FR、PSMA、PMEL、CA9、CD171/L1-CAM、IL-13Rα2、MART-1、ERBB2、NY-ESO-1、MAGE家族蛋白、BAGE家族蛋白、GAGE家族蛋白、AFP、MUC1、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11Rα、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA、FSA、PSA、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY、EpCAM、间皮素、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC、AFU、EBV-VCA、POA、β2-MG和PROGRP；优选靶向间皮素、EGFR、Her2、CD19或粘蛋白；
优选地，所述应用中，以质量计，所述抗原与CD28抗体的用量比为1：5～3：1，优选为1：2到2：1，更优选为1：1。
12.采用权利要求1-5中任一项所述的方法制备得到的CAR-T细胞群。
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