CN109970758A - 5-酮基米尔贝霉素晶型及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了5‑酮基米尔贝霉素晶型I和晶型II。这两种晶型可以通过X‑射线粉末衍射(XRPD)谱图，差示扫描量热(DSC)谱图，红外(IR)吸收谱图等来表征。同时本发明还提供5‑酮基米尔贝霉素晶型I和II的制备工艺。通过本发明工艺生产的5‑酮基米尔贝霉素晶型I和晶型II，它们的纯度均高达99.2％以上，收率高、稳定性好。

Description

5-酮基米尔贝霉素晶型及其制备方法
技术领域
本发明涉及制药领域，尤其是兽药领域。更具体地，本发明涉及5-酮基米贝霉素晶型I和晶型II及它们的制备工艺。
背景技术
米尔贝霉素(milbemycins)是由链霉菌产生的十六元环大环内酯类驱虫药物，日本三共株式会社于1967年发现，经过近20年的改良于1986年以米尔贝肟(milbemycinoxime)上市。米尔贝肟对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD50是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。
目前，米尔贝肟都是通过发酵半合成的方法生产。首先，将链霉菌发酵获得的米尔贝霉素A3、A4经过氧化得到中间体5-酮基米尔贝霉素A3、A4，然后所得的中间体再进行肟化得到米尔贝肟A3、A4混合物。EP和USP对米尔贝肟A3和米尔贝肟A4之间的比例都有严格的限制，在生产米尔贝肟过程中，5-酮基米尔贝霉素A3、A4是关键的中间体。因此，确保5-酮基米尔贝霉素A3和5-酮基米尔贝霉素A4间的比例也满足该比例要求，并提高该中间体的纯度和稳定性，对生产出高纯度、A3和A4比例符合要求的米尔贝肟是非常有必要的。
CN108586481公开了5-酮基米尔贝霉素发酵液的提取和5-酮基米尔贝霉素A3和A4的混合物的结晶工艺，但目前还没有关于5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分晶型的报道。现有技术公开的均是5-酮基米尔贝霉素A3、A4的混合物，该混合物在A3、A4比例的稳定性、纯度和质量稳定性等方面还不能令人满意，因此，对5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分进行制备和晶型研究显得非常必要。制备出高纯度、稳定的5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分，将为生产A3、A4比例稳定、纯度高的米尔贝肟打下坚实的基础。
发明内容
本发明的目的之一在于提供5-酮基米尔贝霉素的两种单组分晶型即5-酮基米尔贝霉素A3晶型I(简称为晶型I)和5-酮基米尔贝霉素A4晶型II(简称为晶型II)。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱在以下位置具有特征峰：4.89±0.20°、8.69±0.20°、13.64±0.20°、14.71±0.20°、16.66±0.20°、19.85±0.20°、20.90±0.20°。
进一步地，本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱进一步在以下位置具有特征峰：14.45±0.20°、15.33±0.20°、17.08±0.20°、17.82±0.20°、19.24±0.20°、22.29±0.20°、23.01±0.20°、23.51±0.20°。
更进一步地，本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱进一步在以下位置具有特征峰：12.16±0.20°、17.49±0.20°、22.64±0.20°、25.70±0.20°、26.50±0.20°、28.27±0.20°、29.29±0.20°、31.24±0.20°、33.79±0.20°、42.62±0.20°。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的2θ角度、d值和相对强度数据如下表1所示：
表1
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的XRPD图谱如图1所示。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I，可以用KBr压片测得的红外吸收图谱来表征，根据所述图谱，其在以下位置处有特征峰：2932cm-1、2922cm-1、1727cm-1、1677cm-1、1367cm-1、1219cm-1、1057cm-1、995cm-1、909cm-1。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的红外吸收谱图还在以下位置处有特征峰：3506cm-1、2966cm-1、2874cm-1、2856cm-1、1446cm-1、1379cm-1、1276cm-1、1180cm-1、1167cm-1、1035cm-1、963cm-1、887cm-1、541cm-1、483cm-1。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的红外谱图如图2所示。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的差示扫描量热(DSC)图谱在208℃-212℃和258℃-262℃有两个放热峰。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的DSC图谱如图3所示。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的热重分析(TGA)图谱如图4所示。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱在以下位置具有特征峰：5.13±0.20°、9.00±0.20°、12.56±0.20°、15.95±0.20°、18.73±0.20°、19.42±0.20°、20.50±0.20°、22.78±0.20°。
进一步地，本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱进一步在以下位置具有特征峰：14.52±0.20°、15.11±0.20°、16.42±0.20°、22.36±0.20°、23.30±0.20°、25.63±0.20°、26.44±0.20°、27.24±0.20°。
更进一步地，本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱进一步在以下位置具有特征峰：28.34±0.20°、29.40±0.20°、30.35±0.20°、32.15±0.20°、34.70±0.20°、41.64±0.20°。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的2θ角度、d值和相对强度数据如下表2所示：
表2
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的XRPD图谱如图5所示。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，可以用KBr压片测得的红外吸收图谱表征，根据所述图谱，其在以下位置处有特征峰：3510cm-1、2921cm-1、1677cm-1、1372cm-1、1243cm-1、1165cm-1、990cm-1。
本发明所述5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的红外吸收谱图还在以下位置处有特征峰：2956cm-1、2873cm-1、1459cm-1、1436cm-1、1334cm-1、1103cm-1、1061cm-1、964cm-1、948cm-1、907cm-1、887cm-1、858cm-1、820cm-1、543cm-1、487cm-1、459cm-1。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的红外谱图如图6所示。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的差示扫描量热(DSC)图谱在218℃-222℃和258℃-262℃有两个放热峰。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的DSC图谱如图7所示。
本发明所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的TGA图谱如图8所示。
本发明另一目的还在于提供一种制备5-酮基米尔贝霉素A3晶型I和5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的方法，该方法包括如下步骤：
步骤(1)：将5-酮基米尔贝霉素粗提液加载至反相制备柱，以体积浓度为60％-90％的甲醇溶液进行洗脱，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3收集液和5-酮基米尔贝霉素A4收集液；
步骤(2)：分别将步骤(1)的5-酮基米尔贝霉素A3收集液和5-酮基米尔贝霉素A4收集液浓缩至甲醇体积浓度为45％-55％，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3甲醇浓缩液和5-酮基米尔贝霉素A4甲醇浓缩液，再用正庚烷萃取，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3正庚烷萃取液和5-酮基米尔贝霉素A4正庚烷萃取液，将其分别进行浓缩，搅拌结晶，过滤，干燥，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3晶型I和5-酮基米尔贝霉素A4晶型II。
优选地，所述步骤(1)中反相制备柱的填料为C18或C8，粗提液上柱结束后，以体积浓度为60％-90％的甲醇溶液进行洗脱，根据制备液相出峰情况收集各流份，再根据各流份的HPLC分析结果，将5-酮基米尔贝霉素A3纯度高的部分合并得到5-酮基米尔贝霉素A3收集液，将5-酮基米尔贝霉素A4纯度高的部分合并得到5-酮基米尔贝霉素A4收集液。
优选地，所述步骤(2)中萃取所用的正庚烷与5-酮基米尔贝霉素A3甲醇浓缩液的体积比为1:1～2:1；所述步骤(2)中萃取所用的正庚烷与5-酮基米尔贝霉素A4甲醇浓缩液的体积比为1:1～2:1。
优选地，所述步骤(2)中，将5-酮基米尔贝霉素A3正庚烷萃取液浓缩至5-酮基米尔贝霉素A3的浓度为50g/L～150g/L；将5-酮基米尔贝霉素A4正庚烷萃取液浓缩至5-酮基米尔贝霉素A4的浓度为50g/L～150g/L。
优选地，所述步骤(2)中搅拌时间为20～30小时。
优选地，所述步骤(2)中结晶的温度为10-30℃
优选地，所述步骤(2)中干燥的温度为30～40℃，干燥的时间2～3小时。
其中，步骤(1)中所述5-酮基米尔贝霉素粗提液是通过以下方法制备得到的：
方法1：
步骤(a)：采用板框过滤收集5-酮基米尔贝霉素发酵液中的菌丝体，用体积浓度为80％-100％的甲醇或者乙醇浸泡该菌丝体，过滤得5-酮基米尔贝霉素的甲醇或者乙醇提取液，浓缩，得到5-酮基米尔贝霉素浓缩液，用正庚烷萃取该浓缩液，得到5-酮基米尔贝霉素正庚烷萃取液；
步骤(b)：将步骤(a)的5-酮基米尔贝霉素正庚烷萃取液浓缩至油状浓缩液，再用甲醇或乙醇溶解该浓缩液、过滤得到5-酮基米尔贝霉素粗提液。
或者
方法2：
将5-酮基米尔贝霉素粗品溶于体积浓度为60％以上的甲醇水溶液或体积浓度为60％以上的乙醇水溶液，得到5-酮基米尔贝霉素粗提液，其中所述5-酮基米尔贝霉素粗品可采用常规的合成法(例如CN105949217公开的合成法)制备得到；
优选地，所述方法1步骤(a)中所述5-酮基米尔贝霉素发酵液是采用CN103789339公开的方法，利用链霉菌F2-18(参见文献黄隽,林甲檀,周敏等.吸水链霉菌HS023milF基因敲除构建产5-酮基米尔贝霉素基因工程菌.《微生物学报》,2015,55(1):107-113)发酵制备得到的。
优选地，所述方法1步骤(a)中使用体积浓度为80％-100％乙醇浸泡时，体积浓度为80％-100％乙醇与菌丝体的比为4:1～10:1，单位为L/Kg，更优选为5:1。
优选地，所述方法1步骤(a)中使用体积浓度为80％-100％甲醇浸泡时，体积浓度为80％-100％甲醇与菌丝体的比为4:1～10:1，单位为L/Kg，更优选为5:1。
优选地，所述方法1步骤(a)中所述5-酮基米尔贝霉素浓缩液中乙醇或甲醇的体积浓度为45-55％。
优选地，所述方法1步骤(a)中正庚烷萃取时，正庚烷与5-酮基米尔贝霉素浓缩液的体积比为1:1～2:1。
优选地，所述方法2中所用的甲醇或乙醇的体积浓度为95％以上。
优选地，所述方法2中所述粗提液中5-酮基米尔贝霉素的浓度为20～100g/L。
优选地，所述本发明所述浓缩可采用减压浓缩，负压为0.08～0.1Mpa。
本发明的发明人经过大量研究发现5-酮基米尔贝霉素A3晶型I和5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，填补了现有技术中没有关于5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分晶型的空白。本发明的晶型I和Ⅱ稳定性好，室温下放置几个月，未发现转晶现象。工艺简单，易于实行产业化。生产出5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分晶体，可以方便地按照米尔贝肟成品质量标准中关于A3和A4比例的要求，先将5-酮基米尔贝霉素A3、A4按比例混合，再进行肟化，进而生产出比例稳定的更高质量的米尔贝肟。也可以直接以5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分晶体为原料生产米尔贝肟A3单组分或米尔贝肟A4单组分，用来调整米尔贝肟成品中组分的比例，确保成品中米尔贝肟A3和米尔贝肟A4之间的比例符合要求。
本发明中所述的5-酮基米尔贝霉素为含5-酮基米尔贝霉素A3和5-酮基米尔贝霉素A4的十六元环大环内酯化合物，其结构如下：
其中，当R＝CH3时为5-酮基米尔贝霉素A3(简称为A3)：当R＝CH2CH3时为5-酮基米尔贝霉素A4(简称为A4)。
本发明中的常温和室温都是指10℃～30℃。
附图说明
图1为实施例9所得5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的X-射线粉末衍射图谱。
图2为实施例9所得5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的红外吸收图谱。
图3为实施例9所得5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的DSC图谱。
图4为实施例9所得5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的TGA图谱。
图5为实施例10所得5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的X-射线粉末衍射图谱。
图6为实施例10所得5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的红外吸收图谱。
图7为实施例10所得5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的DSC图谱。
图8为实施例10所得5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的TGA图谱。
具体实施方式
本发明所用的5-酮基米尔贝霉素发酵液是按照中国发明专利CN108586481中的实施例1发酵得到。
本发明所涉及的X-射线粉末衍射仪器及测试条件为：X-衍射仪器型号Rigaku D/max-2115Cu靶；操作方法：扫描速度3°/min，扫描步宽0.01°。
本发明所涉及的红外分光光度仪及测试条件为：红外分光光度仪型号：BRWKERVECTOR 22；操作方法：采用KBr压片法，扫描范围400～4000cm-1。
本发明涉及的DSC检测仪及测试条件为：DSC检测仪型号为：NETZSCH DSC214；操作方法：升温速率10℃/min，温度范围：25℃～300℃。
本发明涉及的TGA检测仪及测试条件为：TGA检测仪型号：PerkinElmer TGA400；操作方法：升温速率10℃/min，温度范围：30℃～280℃。
本发明涉及的液相(HPLC)测试条件为：色谱柱为：Hypersil OSD2-C18，4.6mm×150mm；流动相为乙腈：水＝85:15；检测波长：250nm；流速：1.0ml/min；柱温：室温；进样量：10μl。
本发明所述乙醇或甲醇溶液的百分浓度(％)为体积百分比浓度。
实施例1：正庚烷萃取液的制备
将5-酮基米尔贝霉素发酵液(按照专利CN108586481中的实施例1发酵得到)35L通过板框过滤后，得到14.56Kg菌丝体，菌丝体再用70L体积浓度为95％的乙醇进行浸泡，板框过滤后，滤液负压0.09Mpa浓缩，至乙醇体积浓度为50％，此时体积约50L。再用50L正庚烷萃取，得正庚烷萃取液40L。
实施例2：5-酮基米尔贝霉素粗提液的制备
取实施例1所得正庚烷萃取液20L于38℃，-0.09Mpa进行浓缩，浓缩至油状物。再加入0.3L体积浓度为95％的甲醇进行溶解、过滤得5-酮基米尔贝霉素粗提液0.37L，其中含5-酮基米尔贝霉素A3和5-酮基米尔贝霉素A4总浓度为95g/L，即A3和A4总质量为35.15g。
实施例3：5-酮基米尔贝霉素粗提液的制备
取实施例1所得正庚烷萃取液20L于38℃，-0.095Mpa进行浓缩，浓缩至油状物。再加入0.6L体积浓度为95％的甲醇进行溶解、过滤得5-酮基米尔贝霉素粗提液0.7L，其中含5-酮基米尔贝霉素A3和5-酮基米尔贝霉素A4总浓度为50g/L，即A3和A4总质量为35.15g。
实施例4：5-酮基米尔贝霉素粗提液的制备
取化学合成法制得的5-酮基米尔贝霉素粗品(按照专利CN105949217实施例2的化学合成方法制得)30g，采用1.5L体积浓度为80％的甲醇水溶液溶解，得到5-酮基米尔贝霉素粗提液1.5L，其中5-酮基米尔贝霉素A3和5-酮基米尔贝霉素A4总浓度约为20g/L。
实施例5：5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分的制备
取实施例2中所得的5-酮基米尔贝霉素粗提液100mL(其中5-酮基米尔贝霉素A3和5-酮基米尔贝霉素A4的总量共计9.5g)，加载到C18制备柱(100*250mm)，采用体积浓度90％甲醇进行洗脱，根据洗脱液紫外出峰情况分瓶收集，再根据各流分的HPLC结果确定5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分收集液。得到5-酮基米尔贝霉素A3收集液2.4L，其中5-酮基米尔贝霉素A3的浓度为0.534g/L，5-酮基米尔贝霉素A3的质量为1.28g；和5-酮基米尔贝霉素A4收集液6.8L，其中5-酮基米尔贝霉素A4的浓度为0.97g/L，5-酮基米尔贝霉素A4的质量为6.6g。
实施例6：5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分的制备
取实施例3中的5-酮基米尔贝霉素粗提液200mL，(其中5-酮基米尔贝霉素A3和5-酮基米尔贝霉素A4的总量共计10g)，加载到C18制备柱(100*250mm)，采用体积浓度70％甲醇进行洗脱，根据洗脱液紫外出峰情况分瓶收集，再根据各流分的HPLC结果确定5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分收集液。得到5-酮基米尔贝霉素A3收集液3.8L，其中5-酮基米尔贝霉素A3的浓度为0.43g/L，5-酮基米尔贝霉素A3的质量为1.63g；和5-酮基米尔贝霉素A4收集液7L，其中5-酮基米尔贝霉素A4的浓度为0.93g/L，5-酮基米尔贝霉素A4的质量为6.5g。
实施例7：5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分的制备
取实施例4中的5-酮基米尔贝霉素粗提液500mL(其中5-酮基米尔贝霉素A3和5-酮基米尔贝霉素A4的总量共计10g)，加载到C18制备柱(100*250mm)，采用体积浓度60％甲醇进行洗脱，根据洗脱液紫外出峰情况分瓶收集，再根据各流分的HPLC结果确定5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分收集液。得到5-酮基米尔贝霉素A3收集液4.9L，其中5-酮基米尔贝霉素A3的浓度为0.34g/L，5-酮基米尔贝霉素A3的质量为1.67g；和5-酮基米尔贝霉素A4收集液8.6L，其中5-酮基米尔贝霉素A4的浓度为0.77g/L，5-酮基米尔贝霉素A4的质量为6.68g。
实施例8：5-酮基米尔贝霉素A3、A4单组分正庚烷萃取液的制备
将实施例5、6、7中得到的5-酮基米尔贝霉素A3收集液混合，混合液体积为11.1L，其中5-酮基米尔贝霉素A3质量为4.58g，HPLC色谱纯度92.8％；将实施例5、6、7中得到的5-酮基米尔贝霉素A4收集液混合，混合液体积为22.4L，其中5-酮基米尔贝霉素A4质量为19.78g，HPLC色谱纯度88.3％。分别减压浓缩，A3混合液浓缩至6.2L，甲醇度51％；A4混合液浓缩至10.5L，甲醇度47％。各加入正庚烷6.5L和11L分别进行萃取，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3正庚烷萃取液6.0L，其中5-酮基米尔贝霉素A3为3.89g；5-酮基米尔贝霉素A4正庚烷萃取液10.6L，其中5-酮基米尔贝霉素A4为17.41g。
实施例9：5-酮基米尔贝霉素A3晶型I的制备
取实施例8中5-酮基米尔贝霉素A3正庚烷萃取液6L，浓缩至26mL，其中5-酮基米尔贝霉素A3的浓度为150g/L，常温下搅拌结晶20小时，结晶液再进行抽滤，并用正庚烷淋洗湿晶体滤饼，所得湿晶体再于40℃、负压0.09Mpa下烘干3小时，得到2.18g 5-酮基米尔贝霉素A3晶体，该晶体HPLC色谱纯度为99.6％。取样进行X-射线粉末衍射、DSC、TGA、红外分析，确认为5-酮基米尔贝霉素A3晶型I，其X-射线粉末衍射图谱如图1所示，红外吸收图谱如图2所示，DSC图谱如图3所示，TGA图谱如图4所示。
实施例10：5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的制备
取实施例8中5-酮基米尔贝霉素A4正庚烷萃取液6L，浓缩至98.5mL，其中5-酮基米尔贝霉素A4的浓度为100g/L，常温下搅拌结晶25小时，结晶液再进行抽滤，并用正庚烷淋洗湿晶体滤饼，所得湿晶体再于40℃、负压0.09Mpa下烘干3小时，得到5.9g 5-酮基米尔贝霉素A4晶体，该晶体HPLC色谱纯度为99.2％。取样进行X-射线粉末衍射、DSC、TGA、红外分析，确认为5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，其X-射线粉末衍射图谱如图5所示，红外吸收图谱如图6所示，DSC图谱如图7所示，TGA图谱如图8所示。
实施例11：5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的制备
取实施例8中5-酮基米尔贝霉素A4正庚烷萃取液4.5L，浓缩至148mL，其中5-酮基米尔贝霉素A4的浓度为50g/L，常温下搅拌结晶30小时，结晶液再进行抽滤，并用正庚烷淋洗湿晶体滤饼，所得湿晶体再于40℃、负压0.095Mpa下烘干3小时，得到3.9g 5-酮基米尔贝霉素A4晶体，该晶体HPLC色谱纯度为99.5％。经X-射线粉末衍射、DSC、TGA、分析确认为5-酮基米尔贝霉素A4晶型II。
实施例12：晶型I和II的稳定性试验
将实施例9、10得到的晶型I和II，每种晶型留样3袋，每袋0.1g分装，都采用双层PE袋加一层铝箔袋封装。放置于药品稳定性试验箱(温度：40℃，湿度75％)进行加速试验。分别于1个月、2个月、3个月不同放置周期时间点取样，经XRPD、HPLC检测，数据见表3。
表3
通过上述试验数据可以得出，通过本发明工艺制备的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I和5-酮基米尔贝霉素A4晶型II具有较高的纯度，且稳定性很好。
以上所述仅是本发明的优选实施方案，本发明的保护范围不局限于上述实施例，凡本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种5-酮基米尔贝霉素A3晶型I，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱在以下位置具有特征峰：4.89±0.20°、8.69±0.20°、13.64±0.20°、14.71±0.20°、16.66±0.20°、19.85±0.20°、20.90±0.20°。
2.根据权利要求1所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱进一步在以下位置具有特征峰：14.45±0.20°、15.33±0.20°、17.08±0.20°、17.82±0.20°、19.24±0.20°、22.29±0.20°、23.01±0.20°、23.51±0.20°。
3.根据权利要求1或2所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱进一步在以下位置具有特征峰：12.16±0.20°、17.49±0.20°、22.64±0.20°、25.70±0.20°、26.50±0.20°、28.27±0.20°、29.29±0.20°、31.24±0.20°、33.79±0.20°、42.62±0.20°。
4.一种5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱在以下位置具有特征峰：5.13±0.20°、9.00±0.20°、12.56±0.20°、15.95±0.20°、18.73±0.20°、19.42±0.20°、20.50±0.20°、22.78±0.20°。
5.根据权利要求4所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱进一步在以下位置具有特征峰：14.52±0.20°、15.11±0.20°、16.42±0.20°、22.36±0.20°、23.30±0.20°、25.63±0.20°、26.44±0.20°、27.24±0.20°。
6.根据权利要求4或5所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II，其特征在于，使用Cu-Kα辐射，以2θ角度表示的X-射线粉末衍射图谱进一步在以下位置具有特征峰：28.34±0.20°、29.40±0.20°、30.35±0.20°、32.15±0.20°、34.70±0.20°、41.64±0.20°。
7.一种制备根据权利要求1-3任一项所述的5-酮基米尔贝霉素A3晶型I以及根据权利要求4-6任一项所述的5-酮基米尔贝霉素A4晶型II的方法，该方法包括如下步骤：
步骤(1)：将5-酮基米尔贝霉素粗提液加载至反相制备柱，以体积浓度为60％-90％的甲醇溶液进行洗脱，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3收集液和5-酮基米尔贝霉素A4收集液；
步骤(2)：分别将步骤(1)的5-酮基米尔贝霉素A3收集液和5-酮基米尔贝霉素A4收集液浓缩至甲醇体积浓度为45％-55％，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3甲醇浓缩液和5-酮基米尔贝霉素A4甲醇浓缩液，再用正庚烷萃取，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3正庚烷萃取液和5-酮基米尔贝霉素A4正庚烷萃取液，将其分别进行浓缩，搅拌结晶，过滤，干燥，分别得到5-酮基米尔贝霉素A3晶型Ⅰ和5-酮基米尔贝霉素A4晶型II。
8.根据权利要求7的方法，所述步骤(1)中反相制备柱的填料为C18或C8。
9.根据权利要求7或8的方法，所述步骤(2)中萃取所用的正庚烷与5-酮基米尔贝霉素A3甲醇浓缩液的体积比为1:1～2:1；所述步骤(2)中萃取所用的正庚烷与5-酮基米尔贝霉素A4甲醇浓缩液的体积比为1:1～2:1。
10.根据权利要求7～9任一项的方法，所述步骤(2)中，将5-酮基米尔贝霉素A3正庚烷萃取液浓缩至5-酮基米尔贝霉素A3的浓度为50g/L～150g/L；将5-酮基米尔贝霉素A4正庚烷萃取液浓缩至5-酮基米尔贝霉素A4的浓度为50g/L～150g/L。
11.根据权利要求7～10任一项的方法，所述步骤(2)中搅拌时间为20～30小时；结晶的温度为10-30℃；干燥的温度为30～40℃，干燥的时间2～3小时。
12.根据权利要求7～11任一项的方法，步骤(1)中所述5-酮基米尔贝霉素粗提液是通过以下方法制备得到的：
方法1：
步骤(a)：采用板框过滤收集5-酮基米尔贝霉素发酵液中的菌丝体，用体积浓度为80％-100％的甲醇或者乙醇浸泡该菌丝体，过滤得5-酮基米尔贝霉素的甲醇或者乙醇提取液，浓缩，得到5-酮基米尔贝霉素浓缩液，用正庚烷萃取该浓缩液，得到5-酮基米尔贝霉素正庚烷萃取液；
步骤(b)：将步骤(a)的5-酮基米尔贝霉素正庚烷萃取液浓缩至油状浓缩液，再用甲醇或乙醇溶解该浓缩液、过滤得到5-酮基米尔贝霉素粗提液；
或者
方法2：
将5-酮基米尔贝霉素粗品溶于体积浓度为60％以上的甲醇水溶液或体积浓度为60％以上的乙醇水溶液，得到5-酮基米尔贝霉素粗提液。
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