CN109966480A - 重组人溶菌酶的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药的技术领域，尤其涉及重组人溶菌酶的新应用。本发明提供了重组人溶菌酶在体外降解人乳头瘤病毒的核酸中的应用。本发明发现重组人溶菌酶在体外能降解人乳头瘤病毒的核酸，并且简述作用呈现剂量关系和时效关系。

Description

重组人溶菌酶的新应用

技术领域

本发明属于生物医药的技术领域，尤其涉及重组人溶菌酶的新应用。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papilomavirus,HPV)是一种具有种属特异性的嗜上皮类病毒，为闭环双链的小DNA病毒，包含约8000bp，无包膜，分类学上属乳头瘤病毒科(Papovaviridae)下的乳头瘤病毒属，其基因组包含8个早期开放读码框架(E:1-8)、2个晚期读码框架(L:1-2)及1个非编码调控区，晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。L1是衣壳的主要蛋白，分子量约57kDa。L1是所有乳头状瘤病毒最为保守的基因，L1蛋白可诱导人的机体产生中和反应，并起免疫保护作用，具有B细胞特异抗原表位。乳头瘤病毒具有高度的宿主特异性，人类是HPV的单纯宿主，主要感染受损的皮肤和黏膜，病毒在感染组织中的滴度较低，目前HPV体外降解的药物具有来源少、毒副作用大的技术缺陷。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于公开了一种安全性强的，能有效的在体外降解HPV的药物。

重组人溶菌酶在体外降解人乳头瘤病毒的核酸中的应用。

需要说明的是，溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)又称细胞壁质酶(Murami dase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-Acetyl muramide Glycanohydralase)。1922年英国细菌学家A.Fleming发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，人溶菌酶由130个氨基酸残基组成，有4个S-S键，分子量为14700，等电点为10.1～10.3，最适温度为50℃，最适pH值为6～7，其化学性质非常稳定，在pH1.2～11.3范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也很稳定，在pH4～7、100℃处理1min不失活，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下对热稳定性较差。人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺、白血球、肝、肾、淋巴组织中。

作为优选，所述应用包括以下步骤：

将重组人溶菌酶溶液与人乳头瘤病毒的核酸溶液混合，所述重组人溶菌酶在体外对所述人乳头瘤病毒的核酸进行降解。

具体的，重组人溶菌酶溶液的溶剂为生理盐水或药学上可接受的溶剂；人乳头瘤病毒的核酸溶液的溶剂为生理盐水或药学上可接受的溶剂。

作为优选，所述重组人溶菌酶选自人溶菌酶、重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2、以及重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶中的一种或多种。

作为优选，所述人乳头瘤病毒的核酸量以拷贝数计算，降解1个拷贝的所述人乳头瘤病毒的核酸，所述重组人溶菌酶的添加量不低于0.6U。

作为优选，所述重组人溶菌酶的活性为5000～～300000U/ml

需要说明的是，酶活力单位(U，active unit)定义为：1个酶活力单位是指在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

其中，所述人溶菌酶为天然存在的人溶菌酶。

作为优选，所述人乳头瘤病毒选自HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV5、HPV6、HPV7、HPV8、HPV10、HPV11、HPV12、HPV13、HPV14、HPV15、HPV16、HPV17、HPV18、HPV20、HPV30、HPV31、HPV32、HPV33、HPV34、HPV35、HPV36、HPV38、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV53和HPV54中的一种或多种。

作为优选，所述重组人溶菌酶溶液与所述人乳头瘤病毒的核酸溶液混合的时间为1-7天。

本发明还公开了重组人溶菌酶在制备治疗人乳头瘤病毒感染的产品的应用。

作为优选，所述重组人溶菌酶选自人溶菌酶、重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2、以及重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶中的一种或多种。

其中，所述人溶菌酶为天然存在的人溶菌酶。

作为优选，所述重组人溶菌酶的活性为5000～300000U/ml，所述人乳头瘤病毒的核酸量以拷贝数计算，降解1个拷贝的所述人乳头瘤病毒的核酸，所述重组人溶菌酶的添加量不低于0.6U。

更为优选的，所述重组人溶菌酶的活性为6000-100000U/ml。

需要说明的是，以上为单独使用重组人溶菌酶自制体外降解人乳头瘤病毒的核酸的用量。

优选的，所述重组人溶菌酶纯度为90％～99％。

本发发明还提供了一种体外降解人乳头瘤病毒的核酸的组合物，包括重组人溶菌酶；

所述重组人溶菌酶选自人溶菌酶、重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2、以及重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶中的一种或多种。

更为优选的，所述体外降解人乳头瘤病毒的核酸的组合物还能包括药学上可接受的助剂或具有体外降解人乳头瘤病毒的核酸功能的药物。

作为优选，所述重组人溶菌酶的活性为5000～300000U/ml，所述重组人溶菌酶的用量为5000～100000U/ml/。

优选的，所述重组人溶菌酶纯度为90％～99％。

本发明还公开了体外降解人乳头瘤病毒的核酸的组合物在制备治疗人乳头瘤病毒感染的产品的应用。

本发明提供的体外降解人乳头瘤病毒的核酸的组合物可以制备成针剂、喷雾剂、膏剂或凝胶剂进行使用。

本发明的目的针对现有技术中体外降解人乳头瘤病毒的核酸的药物具有来源少、毒副作用大的技术问题。本发明发现人溶菌酶在体外对HPV核酸具有降解效果，结果证明，随着人溶菌酶的添加单位越高，在体外降解HPV核酸的作用越大，随着人溶菌酶在体外与HPV核酸的作用时间越长，其降解HPV核酸的效果越好，重组人溶菌酶在体外降解HPV核酸效果与现有的体外降解HPV核酸药物相当，而人溶菌酶是人源物质，其毒副作用十分低，且能通过基因工程和发酵技术制备，其制备工艺成熟。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明实施例4的HPV6型的标准曲线(X轴为起始拷贝数的对数值，Y轴为Ct值)；

图2示本发明实施例4的HPV11型标准曲线(X轴为起始拷贝数的对数值，Y轴为Ct值)。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

其中，重组人溶菌酶的提供单位为广州奇龙生物科技有限公司，批号为20181101，纯度为99.17％，活性为250000U/ml。5-氟尿嘧啶(5-FU)的提供单位为上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度为99％，公司编号为F100149，5-氟尿嘧啶为胸苷酸合成酶抑制药，是尿嘧啶5位上的氢被氟取代的衍生物。5-FU具有在体外降解DNA的作用。

仪器使用情况：BSC-1000-Ⅱ-B2生物安全柜(苏州市华宇净化设备有限公司)、ESJ780-4电子天平(深圳市新朗普电子科技有限公司)、HH-1恒温水浴锅(江苏维纳太科仪器有限公司)、7500荧光定量PCR仪(ThermoFisher)。

实施例1

本实施例为人乳头瘤病毒的核酸样本的获取与制备，具体步骤如下：

于吉林大学白求恩第一医院完成尖锐湿疣样本采集和相关的处理和提取。共采集尖锐湿疣样本4个，准确称量样本质量后用玻璃匀浆器匀浆，加入适量生理盐水配置成6mg/ml的离体混悬液，备用。

实施例2

本实施例为确定实施例1的HPV分型实验，具体步骤和结果如下：

取实施例1的200μL离体混悬液，使用Takara公司的病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒(Code No.9766)提取HPV病毒DNA；使用中山大学达安基因股份有限公司的人乳头瘤病毒核酸检测及基因分型试剂盒(PCR-反向点杂交法)确定HPV亚型，分型结果如图1和图2所示。

实施例1的离体混悬液的HPV分型检测结果表明，4种尖锐湿疣中，2种为6型HPV病毒、2种为11型HPV病毒。

实施例3

本实施例为重组人溶菌酶和5-氟尿嘧啶的给药与分组处理，具体步骤和结果如下：

吸取25μL的重组人溶菌酶原液(表1和表2标记为样品组1，活性为250000U/ml)和25μL实施例1的离体混悬液(浓度为2.5×10⁵拷贝数/ml)至200μL EP管中振摇均匀，使重组人溶菌酶与混悬液充分混合作用，并置于37℃培养箱中培养，另设倍比稀释的重组人溶菌酶样品液(表1和表2标记为样品组2和样品组3)和阳性对照(5％质量浓度的5-氟尿嘧啶)、缓冲液对照(表1和表2标记为空白组)，其中，样品组2为样品组1稀释1倍，样品组3为样品组2稀释1倍。设重复孔，在24小时、72小时、120小时、168小时后，使用Takara公司的病毒RNA/DNA快速纯化试剂盒(Code No.9766)提取HPV病毒DNA，得到空白组的HPV DNA、阳性对照组的HPV DNA、样品组1组的HPV DNA、样品组2组的HPV DNA、样品组3组的HPV DNA。

实施例4

本实施例为重组人溶菌酶和5-氟尿嘧啶体外降解HPV核酸的效应，具体步骤和结果如下：

使用HPV(6/11型)核酸检测试剂盒进行HPV6/11型荧光PCR标准曲线的制作及检测。

(1)取HPV阴性质控品与阳性质控品吸10μL到1.5ml离心管中，在离心管中加入50μLDNA提取液后在微型混匀器上充分混匀，100℃恒温加热10分钟后12000rpm离心5分钟，备用；

(2)取HPV6/11 PCR反应管，分别加入质控提取液上清及DNA提取液5μL；

(3)PCR反应管在6000rpm瞬时离心，放入PCR仪，按下列程序扩增：

Stage1：50℃反应2min；

Stage2：93℃反应3min；

Stage3：93℃反应15s，然后55℃反应20s，该步骤进行10个循环；

Stage4：93℃反应15s，然后55℃反应45s，该步骤进行30个循环；

荧光素设置：HPV6/11——FAM、TAMRA；

荧光信号收集：Stage4：55℃—45s；

以阳性质控品为模板进行实时荧光定量PCR建立标准曲线，HPV6型的标准曲线如图1所示，HPV11型的标准曲线如图2所示，结果从标准曲线图中可以看出，HPV6型及HPV11型的线性关系良好。

对实施例3的空白组的HPV DNA、阳性对照组的HPV DNA、样品组1组的HPV DNA、样品组2组的HPV DNA、样品组3组的HPV DNA进行重组人溶菌酶和5-氟尿嘧啶体外降解HPV6和HPV11核酸效果检测，结果如表1和表2所述。

表1 对HPV6型的荧光PCR检测结果

表2 对HPV11型的荧光PCR检测结果

从表1和表2中所列实验结果可以看出，重组人溶菌酶在体外对HPV核酸具有降解效果。对比样品组之间数据数据可以发现，稀释后(样品组2和样品组3)的重组人溶菌酶降解HPV核酸的效果降低；随着处理时间的增加，重组人溶菌酶对HPV核酸的体外降解效果逐渐增加，在第5天时达到最佳效果；高浓度组(样品组1)重组人溶菌酶，所展示的效果与阳性药物5-氟尿嘧啶组(阳性对照组)相似；同时重组人溶菌酶对HPV11型核酸的降解效果稍强于对HPV6型核酸的降解效果。

综上所述，重组人溶菌酶在体外对HPV核酸具有降解能力，效果与阳性药物5-氟尿嘧啶接近。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.重组人溶菌酶在体外降解人乳头瘤病毒的核酸中的用途。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

将重组人溶菌酶溶液与人乳头瘤病毒的核酸溶液混合，所述重组人溶菌酶在体外对所述人乳头瘤病毒的核酸进行降解。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述重组人溶菌酶选自人溶菌酶、重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2、以及重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶中的一种或多种。

4.根据权利要求1至3任意一项所述的应用，其特征在于，所述人乳头瘤病毒的核酸量以拷贝数计算，降解1个拷贝的所述人乳头瘤病毒的核酸，所述重组人溶菌酶的添加量不低于0.6U。

5.根据权利要求1至3任意一项所述的应用，其特征在于，所述人乳头瘤病毒选自HPV1、HPV2、HPV3、HPV4、HPV5、HPV6、HPV7、HPV8、HPV10、HPV11、HPV12、HPV13、HPV14、HPV15、HPV16、HPV17、HPV18、HPV20、HPV30、HPV31、HPV32、HPV33、HPV34、HPV35、HPV36、HPV38、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV53和HPV54中的一种或多种。

6.根据权利要求1至3任意一项所述的应用，其特征在于，所述重组人溶菌酶溶液与所述人乳头瘤病毒的核酸溶液混合的时间为1-7天。

7.重组人溶菌酶在制备治疗人乳头瘤病毒感染的产品的应用。

8.一种体外降解人乳头瘤病毒的核酸的组合物，其特征在于，包括重组人溶菌酶；

所述重组人溶菌酶选自人溶菌酶、重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)2、以及重组人溶菌酶的N端氨基带有(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述重组人溶菌酶的活性为5000U～300000U/ml，所述人乳头瘤病毒的核酸量以拷贝数计算，降解1个拷贝的所述人乳头瘤病毒的核酸，所述重组人溶菌酶的添加量不低于0.6U。

10.权利要求8或9所述的体外降解人乳头瘤病毒的核酸的组合物在制备治疗人乳头瘤病毒感染的产品的应用。