CN109946368B - 一种反硝化培养装置及反硝化速率测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种反硝化培养装置及反硝化速率测定的方法，该反硝化培养装置包括一底座、若干直管和一转动单元；所述底座上绕底座中心设有一圈固定槽；所述直管底端开口设有可拆卸的橡胶塞，其顶端开口设有可拆卸的盖子；所述盖子内侧固定一金属线的一端，金属线的另一端连接一磁石；当盖子盖住直管顶端开口时，磁石位于直管内；所述转动单元包括一转子、一转动轴、以及一电机；所述转子以可拆卸方式安装于底座中心；所述转动轴垂直底座设置，其两端分别连接转子和电机的输出端。本发明结合了气体流动培养技术和¹⁵N同位素示踪技术，既保证了同位素示踪法较高的灵敏度，又保证了反硝化培养系统的密闭性和气体的扩散性。

Description

一种反硝化培养装置及反硝化速率测定的方法

技术领域

本属于反硝化测定技术领域，具体涉及一种反硝化培养装置及反硝化速率测定的方法。

背景技术

反硝化过程是氮生物地球化学循环的重要环节，被认为是氮损失最重要的途径之一，也是减轻环境氮负荷的重要手段。目前常用的反硝化测定方法主要有以下三种：

1)乙炔抑制法，基于高浓度乙炔能够抑制硝化作用以及N₂O向N₂的还原，从而使得N₂O成为反硝化的终产物，进而间接推算出反硝化速率。但乙炔抑制了硝化作用，低估了反硝化损失量，从而影响了测定结果的准确性。另外，在粘土或饱和沉积物中，乙炔扩散速率很慢，对硝化作用抑制不完全。长期反复使用乙炔会导致反硝化微生物对乙炔的适应，将乙炔作为一种碳源，消耗乙炔，从而导致浓度降低，抑制效果下降。

2)¹⁵N同位素示踪法，¹⁵N同位素示踪法是向土壤中添加¹⁵N标记的NO₃ ^-，然后测定产生的N₂O和N₂的¹⁵N来量化土壤的反硝化速率。这种方法具有较高的灵敏度，得到了广泛的应用，并推动了反硝化过程的研究；但也存在气体扩散受阻等缺点。

3)N₂直接量化法，N₂直接量化法是用密闭系统培养原状土、沉积物和土壤植物生长系统来直接测定反硝化产生的氮气。这种方法采用气体流动培养技术，即在密闭系统中，使用连续流动的He或Ar来清除N₂的背景含量，在不添加抑制剂的情况下，培养原位土柱来测定反硝化产生的N₂O和N₂。但是，这种密闭系统在设计上和建造过程上都非常复杂，系统中的氮气需要在一定时间内完全排除干净，很难保证系统的密闭性。

因此，需要一种更合适的方法来量化反硝化速率。

发明内容

本发明的目的是提供一种反硝化培养装置及反硝化速率测定的方法。

本发明将气体流动培养技术和¹⁵N同位素示踪技术结合，基于气体流动培养技术，设计了一种反硝化培养实验装置，利用所设计的反硝化培养实验装置，再结合¹⁵N同位素示踪技术，来进行反硝化速率测定。

本发明提供的反硝化培养装置，包括一底座、若干直管和一转动单元；

所述底座上绕底座中心设有一圈固定槽，固定槽用来放置直管；

所述直管底端开口设有可拆卸的橡胶塞，其顶端开口设有可拆卸的盖子；所述盖子内侧固定一金属线的一端，金属线的另一端连接一磁石；当盖子盖住直管顶端开口时，磁石位于直管内；

所述转动单元包括一转子、一转动轴、以及一电机；所述转子以可拆卸方式安装于底座中心；所述转动轴垂直底座设置，其两端分别连接转子和电机的输出端；当电机启动，即可带动底座转动。

进一步的，转子通过螺纹连接方式安装于所述底座中心，具体来说：

所述底座中心设有与转子匹配的安装孔，安装孔内壁设有内螺纹；转子的旋转轴上的外螺纹与安装孔的内螺纹通过螺纹啮合方式连接。

本发明提供的反硝化速率测定的方法，利用上述反硝化培养装置实现，包括：

利用直管取沉积物样品，并向直管内注满原水；

将两端封闭的直管插入底座，使底座和直管下部浸入原水内，静置过夜；

向直管内加入¹⁵N-NO₃示踪剂，使底座和直管下部保持浸入原水内，启动电机，进行反硝化培养；

在顶空进样瓶中加入少量抑制微生物生长的抑制剂；

在预设的培养时间点取出直管，用玻璃搅拌棒对管中的沉积物进行搅拌；取搅拌后的沉积物悬浊液，放入已加入抑制剂的顶空进样瓶内，并于1～5度下冷藏10～15天后，注入氦气继续冷藏，在3～6个月内进行测定；

取出顶空进样瓶内气体，利用质谱仪测定气体的δ¹⁵N值；

根据δ¹⁵N值，利用¹⁵N同位素示踪法计算反硝化速率。

作为优选，抑制剂为ZnCl₂抑制剂。

进一步的，所述对搅拌后的沉积物悬浮液取样，具体为：

采用针筒进行取样。

进一步的，所述取出顶空进样瓶内气体，利用质谱仪测定N₂的δ¹⁵N值，具体为：

采用带三通阀的针管取样器，采用置换方式将顶空进样瓶内气体导进针管取样器；

将针管取样器中气体导入质谱仪测定δ¹⁵N值。

和现有技术相比，本发明具有如下特点和有益效果：

本发明反硝化培养实验装置基于气体流动培养技术设计，利用本发明进行反硝化培养时，使直管绕底座中心转动，且利用磁石对直管内水体进行扰动，避免了反硝化培养过程中气体扩散受阻的问题，还可以更充分地模拟野外水体环境。

将本发明装置和¹⁵N同位素示踪法结合来量化反硝化速率，可保证同位素示踪法的高灵敏度，也将获得更准确的反硝化速率数据。

本发明反硝化速度测定方法结合了气体流动培养技术和¹⁵N同位素示踪技术，在一定程度上促进了水生生态系统反硝化的研究。本发明既保证了同位素示踪法较高的灵敏度，又保证了反硝化培养系统的密闭性和气体的扩散性。

附图说明

图1为实施例中底座的俯视结构示意图；

图2为实施例中直管的结构示意图；

图3为实施例中带磁石的盖子的结构示意图；

图4为实施例中支撑座的结构示意图；

图5为实施例所测定的氮气δ¹⁵N值随培养时间的变化曲线。

图中，1-底座，2-固定槽，3-直管，4-盖子，5-磁石，6-金属线，7-安装孔，8-主板，9-挡板，10-固定通道。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明和/或现有技术中的技术方案，下面将对照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施方式。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

本实施例将提供一种反硝化培养装置。

参见图1～3，所示为本实施例反硝化培养装置，包括一底座1、若干直管3和一转动单元。底座1上绕底座中心设有一圈固定槽2，固定槽2用来放置直管3。本实施例中，直管管径4.7cm，管长29cm；固定槽数量为16，使用时，固定槽可插满或不插满直管。直管3底端开口设有可拆卸的橡胶塞，直管3顶端开口设有带磁石5的可拆卸盖子4，具体来说，磁石5通过一金属线6与盖子4内表面固定连接。所述转动单元包括一转子、一转动轴、以及一电机，转子安装于底座中心，转动轴一端连接转子，另一端连接电机。电机启动，驱动转动轴转动，转动轴带动转子转动，从而带动底座转动。电机启动，使电机周围产生变化的磁力场，受磁力影响的磁石小幅度摆动，即可对直管中水体实现扰动。

本实施例中，转动轴和插入固定槽的直管等高，这样磁力场可以更好的影响磁石。

本实施例中，转子通过螺纹连接方式安装于所述底座中心，具体来说：在底座中心设有与转子匹配的安装孔7，安装孔7内壁设有内螺纹；转子的旋转轴上的外螺纹与安装孔7的内螺纹通过螺纹啮合方式连接。

实施例2

本实施例将提供利用实施例1装置的一种反硝化培养方法，具体步骤如下：

第一步，土柱取样。

取下直管底端橡胶塞，将直管底端插入原样土柱中，土柱深入直管约6cm，取出直管并用橡胶塞塞紧直管底端。本实施例中，共采集3个样点，每个样点采集5个土柱，最后一个样点采集6个土柱。采集完土柱的16个直管依次插入底座上的固定槽，并标记编号。从直管顶端向直管内注满原水，盖好盖子，带回实验室，等待进一步的反硝化培养。

第二步，反硝化培养前的预处理。

在实验室内，将底座连同直管一起放入水槽中，水槽中倒入采集回来的原水，使直管部分浸入原水内，静置过夜。第二天一早，观察直管内原水水位是否下降到盖子以下，如果没有明显下降，则可开始后面的反硝化培养实验；如果水位下降到盖子以下，则需向直管内注满原水后，再继续后面的反硝化培养实验。

第三步，反硝化培养实验。

将转子安装于底座中心处，并利用转动轴将转子与电机相连，仍然保持底座置于水槽中，水槽中盛有原水。启动电机，电机驱动转子转动，并带动16根直管以每分钟60–70转的速度进行转动。而直管顶端端口的盖子，其所带的磁石受电机磁力影响，开始慢慢对直管中的水体进行扰动，从而可充分模拟野外水体环境。

该支撑座与水槽尺寸匹配，包括一主板8、以及设于主板8两端垂直向下的两档板9，主板8放置于水槽上，两挡板9正好与水槽外壁接触，从而可避免主板移动。在主板中心设有与电机尺寸匹配的固定通道10，使得电机置于固定通道内，并将主板置于水槽上，即可对底座进行固定。

基于上述可实现反硝化速率测定实验，一种具体的反硝化速率测定方法为：

在进行第三步反硝化培养实验之前，从直管上端向直管内加入¹⁵N-NO₃示踪剂，并以¹⁵N-NO₃示踪剂加入时间为起始点。在第三步进行反硝化培养实验过程中，在培养0、1.5、2.5、4.5、6小时时，取直管内的土柱样品，搅拌取出的土柱样品至均匀。向顶空进样瓶中加入ZnCl₂抑制剂，用来抑制土柱样品中的微生物生长。用针筒重复取样3次，分别放入3个加入抑制剂的12.5ml的顶空进样瓶中，所有取样放入冰箱冷藏2周后，注入氦气，继续冷藏，在3～6个月内进行测定。

之后从冰箱取出顶空进样瓶，于室温静置。最后，采用带三通阀的针管取样器(1ml)，采用置换方式将顶空进样瓶内气体导进针管取样器，随后将针管取样器中气体导入质谱仪，测定氮气δ¹⁵N值。根据所测定的氮气δ¹⁵N值，利用¹⁵N同位素示踪技术即可获得本次反硝化速率。

图5所示为本实施例获得的δ¹⁵N值，从图中可以看出，氮气中δ¹⁵N值与培养时间T具有显著的相关性，相关系数r²为0.925，检验值p<0.01。因此可以确定，采用本发明反硝化培养实验装置，所测定的δ¹⁵N值数据具有更高的灵敏度，据此计算得到的反硝化速率数据也将更准确。

本发明基于所测定的δ¹⁵N值，利用¹⁵N同位素示踪法来量化反硝化速率。为便于理解，下面将提供本发明量化反硝化速率的机理。

当利用质谱仪测定出氮气中的δ¹⁵N值数据后，根据测定氮气中δ¹⁵N值过程中产生的²⁸N₂、²⁹N₂和³⁰N₂的锋面面积，来计算出反硝化速率D_n。

反硝化速率计算方法如下：

D₁₅＝p(²⁹N₂)+2p(³⁰N₂) (1)

式(1)～(2)中，p(²⁹N₂)、p(³⁰N₂)分别表示²⁹N₂、³⁰N₂的产生率，单位：μmol m^-2h^-1；D₁₄、D₁₅分别表示¹⁴NO₃ ^-、¹⁵NO₃ ^-的反硝化速率，单位：μmol N m^-2h^-1。

式(3)中，D_W表示水中的反硝化速率，单位：μmol N m^-2h^-1；[¹⁴NO₃ ^-]_W、[¹⁵NO₃ ^-]_W、分别表示水中¹⁴NO₃ ^-、¹⁵NO₃ ^-的含量。

D_n＝D₁₄-D_W (4)

式(4)中，D_n表示由硝化作用产生的NO₃ ^-的反硝化速率，单位：μmol N m^-2h^-1。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.利用反硝化培养装置的反硝化速率测定的方法，其特征是：

所述反硝化培养装置包括一底座、若干直管和一转动单元；

所述底座上绕底座中心设有一圈固定槽，固定槽用来放置直管；

所述直管底端开口设有可拆卸的橡胶塞，其顶端开口设有可拆卸的盖子；所述盖子内侧固定一金属线的一端，金属线的另一端连接一磁石；当盖子盖住直管顶端开口时，磁石位于直管内；

所述转动单元包括一转子、一转动轴、以及一电机；所述转子以可拆卸方式安装于底座中心；所述转动轴垂直底座设置，其两端分别连接转子和电机的输出端；当电机启动，即可带动底座转动；

所述方法包括：

利用直管取沉积物样品，并向直管内注满原水；

将两端封闭的直管插入底座，使底座和直管下部浸入原水内，静置过夜；

向直管内加入¹⁵N-NO₃示踪剂，使底座和直管下部保持浸入原水内，启动电机，进行反硝化培养；

在顶空进样瓶中加入少量抑制微生物生长的抑制剂；

在预设的培养时间点取出直管，用玻璃搅拌棒对管中的沉积物进行搅拌；取搅拌后的沉积物悬浊液，放入已加入抑制剂的顶空进样瓶内，并于1～5度下冷藏10～15天后，注入氦气继续冷藏，在3～6个月内进行测定；

取出顶空进样瓶内气体，利用质谱仪测定气体的δ¹⁵N值；

根据δ¹⁵N值，利用¹⁵N同位素示踪法计算反硝化速率。

2.如权利要求1所述的反硝化速率测定的方法，其特征是：

所述抑制剂为ZnCl₂抑制剂。

3.如权利要求1所述的反硝化速率测定的方法，其特征是：

所述对搅拌后的沉积物悬浮液取样，具体为：

采用针筒进行取样。

4.如权利要求1所述的反硝化速率测定的方法，其特征是：

所述取出顶空进样瓶内气体，利用质谱仪测定N₂的δ¹⁵N值，具体为：

采用带三通阀的针管取样器，采用置换方式将顶空进样瓶内气体导进针管取样器；

将针管取样器中气体导入质谱仪测定δ¹⁵N值。

5.如权利要求1所述的反硝化速率测定的方法，其特征是：

所述转子通过螺纹连接方式安装于所述底座中心，具体来说：

所述底座中心设有与转子匹配的安装孔，安装孔内壁设有内螺纹；转子的旋转轴上的外螺纹与安装孔的内螺纹通过螺纹啮合方式连接。