CN109939125A - 一种抗氧化剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗氧化剂及其制备方法与应用，属于医用纳米材料技术领域。该抗氧化剂是通过对纳米抗氧化剂进行亲水改性制得，且抗氧化剂的水动力学直径不超过10nm。该纳米抗氧化剂的粒径为1‑2nm，具有良好的抗氧化作用，并且能有效地在肾部位聚集，进而清除肾部位中的活性氧。该抗氧化剂的制备方法包括：采用亲水材料对纳米抗氧化剂进行亲水改性。该方法简单、易操作，适于工业化生产。将上述抗氧化剂用于清除活性氧，具有较佳效果，并且其在肾脏具有较长的滞留时间，可清除肾脏过量的活性氧，缓解急性肾损伤症状，对于医学急性肾损伤的治疗具有重要价值和意义。

Description

一种抗氧化剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医用纳米材料技术领域，具体而言，涉及一种抗氧化剂及其制备方法与应用。

背景技术

急性肾损伤(AKI)是指肾功能急速下降，导致血清肌酐升高，尿液排出量减少，及尿素和其他含氮废物滞留。发病率约5000人每100万，每年大约有170万人因此死亡。

过量的活性氧(ROS)能够氧化脂质，核酸以及蛋白，触发氧化应激以及炎症反应，被认为与急性肾损伤紧密相关。目前，除了透析和肾移植，临床没有特定AKI治疗手段。清除ROS，改善氧应急，被认为是治疗急性肾损伤比较有效的办法。然而，目前尚无有效治疗AKI的纳米抗氧剂。

发明内容

本发明的第一目的包括提供一种抗氧化剂，该抗氧化剂的水动力学直径不超过10nm，具有良好的抗氧化作用，并且能有效地在肾部位聚集，进而清除肾部位中的活性氧。

本发明的第二目的包括提供一种上述抗氧化剂的制备方法，该方法简单、易操作，适于工业化生产。

本发明的第三目的包括提供一种上述抗氧化剂的应用，例如可将其用于清除活性氧，具体的可以是缓解急性肾损伤症状。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：

本发明提出一种抗氧化剂，该是通过对纳米抗氧化剂进行亲水改性制得的，且抗氧化剂的水动力学直径不超过10nm。

在一些实施方式中，上述纳米抗氧化剂为纳米氧化物，优选为纳米氧化铈。

在一些实施方式中，亲水改性采用亲水材料进行，优选地，亲水材料为PEG化磷脂。

在一些实施方式中，纳米抗氧化剂的粒径为1-2nm。

在一些实施方式中，上述纳米抗氧化剂的纳米颗粒为萤石立方相。

此外，本发明还提出了一种上述抗氧化剂的制备方法，包括以下步骤：采用亲水材料对纳米抗氧化剂进行亲水改性。

在一些优选的实施方式中，用PEG化磷脂对纳米氧化铈进行亲水改性。

此外，本发明还提出了一种上述抗氧化剂的应用，该抗氧化剂可用于清除活性氧，其中，活性氧包括双氧水、羟自由基和超氧阴离子中的至少一种。

在一些实施方式中，上述抗氧化剂用于清除肾脏中过量的活性氧。

进一步地，上述抗氧化剂可用于制备用于治疗急性肾损伤相关疾病的药物。

本申请提供的抗氧化剂及其制备方法与应用的有益效果包括：

本申请提供的抗氧化剂的水动力学直径不超过10nm，具有良好的多重清除活性氧的功能，并且其尺寸小，能有效地在肾部位聚集，进而清除肾部位中的活性氧。其制备方法简单、易操作，适于工业化生产。将上述抗氧化剂用于清除活性氧，具有较佳效果，并且其在肾脏具有较长的滞留时间，可清除肾脏过量的活性氧，缓解急性肾损伤症状，对于医学急性肾损伤的治疗具有重要价值和意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请实施例1提供的氧化铈疏水纳米颗粒分散于氯仿中的TEM图谱；

图2为本申请实施例1提供的氧化铈疏水纳米颗粒的XRD图谱；

图3为本申请实施例1提供的氧化铈亲水纳米颗粒分散于水中的TEM图谱；

图4为本申请实施例1提供的抗氧化剂清除双氧水的效率；

图5为本申请实施例1提供的抗氧化剂清除超氧阴离子的效率；

图6为本申请实施例1提供的抗氧化剂在AKI小鼠体内分布情况图；

图7为本申请实施例1提供的抗氧化剂治疗AKI小鼠的肾功能指标；

图8为本申请实施例1提供的抗氧化剂治疗AKI小鼠的组织切片图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本申请实施例提供的抗氧化剂及其制备方法与应用进行具体说明。

本申请提供的抗氧化剂是通过对纳米抗氧化剂进行亲水改性制得的。其中，抗氧化剂的水动力学直径不超过10nm，该水动力学直径指颗粒在水中运动时，其表面粘附电子偶极层，导致水中颗粒直径高于TEM下的直径。其检测方法可参考光散射测量(DLS)。发明人发现，通过亲水改性后所得的本申请的抗氧化剂具有上述范围的水动力学直径，能够比较容易地通过肾小球过滤系统，从而有效地在肾部位聚集，清除活性氧，缓解肾损伤症状。

在一些实施方式中，上述抗氧化剂的水动力学直径例如可以为10nm、8nm、6nm、4nm或2nm等，也可以为9nm、7nm、5nm、3nm或1nm等，此外，还可以为不超过10nm范围内的其它任一直径值。在一些优选的实施方式中，抗氧化剂的水动力学直径优选为5-6nm。在本申请中，纳米抗氧化剂可以为纳米氧化物，优选为纳米氧化铈。

本申请中，纳米抗氧化剂，如纳米氧化铈的粒径可以为1-2nm，如1nm、1.2nm、1.5nm、1.8nm或2nm等。该粒径下的纳米氧化铈的尺寸较小，能够较为方便地在肾脏聚集，有利于治疗急性肾损伤。

本申请中，亲水改性采用亲水材料进行。优选地，亲水材料为PEG化磷脂，以该物质作为亲水材料可以大大提高纳米颗粒血液循环时间，避免被肝/脾等网状内皮系统吞噬，尽可能的将颗粒运送至病灶区域。该PEG化磷脂由磷脂和聚乙二醇合成而得，具体的，该物质可直接购买得到。

本申请中，上述纳米抗氧化剂，如纳米氧化铈的纳米颗粒为萤石立方相。

此外，本申请还提供了一种上述抗氧化剂的制备方法，其可包括以下步骤：采用亲水材料对纳米抗氧化剂进行亲水改性。

作为参考地，亲水改性可包括以下步骤：将纳米氧化铈分散液与PEG化磷脂溶液混合，随后除去溶剂。

其中，纳米氧化铈分散液可以是将氧化铈疏水纳米颗粒与溶剂形成，PEG化磷脂溶液可以是将PEG化磷脂与氯仿混合得到。可参考地，上述溶剂例如可以但不限于包括氯仿。

在一些实施方式中，纳米氧化铈分散液的浓度为10-15mg/mL，如10mg/mL、12mg/mL或15mg/mL等。

在一些实施方式中，PEG化磷脂溶液的浓度为18-22mg/mL，如18mg/mL、20mg/mL或22mg/mL等。

作为可选地，纳米氧化铈分散液与PEG化磷脂溶液混合可以是于纳米氧化铈分散液中加入PEG化磷脂溶液。在一些实施方式中，纳米氧化铈分散液与PEG化磷脂溶液的体积比为(2.5-3.5)：1，优选为3:1。

在本申请中，可以但不仅限于采用旋蒸方式除去溶剂。当采用旋蒸方式进行时，旋蒸过程中真空度例如可以控制为-0.025MPa至-0.03MPa(如-0.025MPa、-0.028MPa或-0.03MPa等)。旋蒸过程中转速可以控制为80-120r/min，如80r/min、90r/min、100r/min、110r/min或120r/min等。

在一些实施方式中，在除去上述溶剂后，还可将剩余的物质与去离子水混合并超声分散。作为可选地，超声分散例如可以于功率为220-260W(如220W、240W或260W等)的条件下进行8-12min(如8min、10min或12min等)。

本申请中，纳米氧化铈的制备方法可以包括：将含有Ce³⁺的前驱体水溶液进行热解，热解温度为240-250℃。优选地，热解时间为20-30min。

在一些实施方式中，纳米氧化铈的制备方法包括：将含有Ce³⁺的前驱体水溶液、油胺和十八烯混合，在保护气氛下加热除水，随后进行上述热解。

可参考地，可以将Ce³⁺的前驱体水溶液与油胺和十八烯的混合液混合，在保护气氛下，第一次加热并除去水，随后第二次加热，分离出固体颗粒。

在一些实施方式中，上述Ce³⁺的前驱体水溶液例如可以包括Ce³⁺的卤化盐或Ce³⁺的硝酸盐。

混合时控制Ce³⁺、油胺和十八烯的摩尔比为1:3:(10-20)，如1:3:10、1:3:15或1:3:20等。

在一些实施方式中，上述Ce³⁺的前驱体水溶液与油胺和十八烯的混合液于10-25℃(可理解为室温)的条件下混合。在一些优选地实施方式中，上述混合过程中还伴有搅拌。混合时间可以为1-3h，以使Ce³⁺的前驱体水溶液与油胺和十八烯的混合液充分混合均匀。

作为可选地，上述保护气氛可以但不仅限于包括氩气气氛，通过加入保护气体以除去空气，从而保护十八烯，避免其氧化。

在一些实施方式中，上述第一次加热(加热除水)的温度例如可以为100-120℃，如100℃、105℃、110℃、115℃或120℃等。通过第一次加热，以促进前驱体溶解并去除水。在一些优选的实施方式中，加热除水过程中还可对加热体系进行搅拌。加热除水的保温时间可以为1-2h。

在一些实施方式中，加热除水过程由室温以升温速率为25-35℃/h升温至100-120℃。优选地，升温速率为30℃/h。将加热除水的升温速率控制在25-35℃/h，以缓慢的去除溶液体系中的水，并逐步形成铈的配体，利于高温热解。

在一些实施方式中，上述第二次加热的温度例如可以为240-250℃(如240℃、245℃或250℃等)，第二次加热的时间可以为20-30min(如20min、25min或30min等)。第二次加热也优选在保护气氛下进行，通过第二次加热，体系发生高温热解反应，溶液颜色由淡黄色变成深黄色。

发明人发现，通过将第二次加热的温度控制在240-250℃且加热时间控制在20-30min，可针对性地得到粒径为1-2nm的呈萤石立方相的氧化铈纳米颗粒。

进一步地，第二次加热后，冷却至室温，可采用离心分离方式分离出固体颗粒，即得到氧化铈的疏水纳米颗粒。可参照地，离心分离前，可向冷却后的体系中加入18-22mL的无水乙醇，搅拌25-35min。

进一步地，可将分离得到的疏水纳米颗粒进行清洗，清洗过程可依次用环己烷和乙醇进行。

承上，本申请通过采用高温热解法制备得到粒径为1-2nm的呈萤石立方相的氧化铈疏水纳米颗粒，进而再通过PEG化磷脂对其改性，使其呈现出亲水特性，从而能够较易地通过肾小球过滤系统，在肾部位聚集，以清除活性氧。

此外，本申请还提供了一种抗氧化剂的应用，例如可将其用于清除活性氧。其中，活性氧包括双氧水、羟自由基和超氧阴离子中的至少一种。

在一些实施方式中，上述抗氧化剂可用于清除肾脏中过量的活性氧，也即上述抗氧化剂可用于治疗急性肾损伤。通过测试，上述抗氧化剂在肾脏具有较长的滞留时间(可达1天以上)，能有效清除肾脏过量的活性氧，缓解急性肾损伤症状，对于医学急性肾损伤的治疗具有重要价值和意义。

进一步地，上述抗氧化剂可用于制备用于治疗急性肾损伤相关疾病的药物。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

分别称取1mmol(430mg)的Ce(NO₃)₃·6H₂O和3mmol油胺(802mg)加入4g十八烯，室温下搅拌2小时；通入15min氩气以除去反应瓶中空气；在氩气气氛保护下，缓慢加热(升温速率控制为30℃/小时)，升温至120℃，保温1小时以除去体系中的水。随后接好冷凝管，升温至240℃，保温进行高温热解反应20分钟；反应结束，自然降至室温。向反应体系中加入20mL无水乙醇，室温下搅拌30分钟，然后进行离心分离。对收集的固体依次用环己烷和乙醇进行超声清洗3次。用20mL氯仿分散所得产物(氧化铈疏水纳米颗粒)。

取氧化铈疏水纳米颗粒氯仿溶液3mL，加入1mL的PEG化磷脂氯仿溶液中(含PEG化磷脂20mg)，于60℃的条件下旋蒸1h。旋蒸条件：抽真空-0.03MPa，100r/min。而后加入5mL去离子水超声分散，超声功率为240W，超声时间为10min，得到抗氧化剂。

实施例2

分别称取1mmol(430mg)的Ce(NO₃)₃·6H₂O和3mmol油胺(802mg)加入10mmol的十八烯，室温下搅拌1小时；通入15min氩气以除去反应瓶中空气；在氩气气氛保护下，缓慢加热(升温速率控制为25℃/小时)，升温至100℃，搅拌并保温1.5小时以除去体系中的水。随后接好冷凝管，升温至245℃，保温进行高温热解反应30分钟；反应结束，自然降至室温。向反应体系中加入18mL无水乙醇，室温下搅拌35分钟，然后进行离心分离。对收集的固体依次用环己烷和乙醇进行超声清洗3次。按1mL：10mg的比例将氧化铈疏水纳米颗粒分散于氯仿中。

取氧化铈疏水纳米颗粒氯仿溶液2.5mL，加入1mL的PEG化磷脂-氯仿溶液中(含PEG化磷脂18mg)，于60℃的条件下旋蒸1h。旋蒸条件：抽真空-0.025MPa，80r/min。而后加入5mL去离子水超声分散，超声功率为220W，超声时间为12min，得到抗氧化剂。

实施例3

分别称取1mmol(430mg)的Ce(NO₃)₃·6H₂O和3mmol油胺(802mg)加入20mmol的十八烯，室温下搅拌3小时；通入15min氩气以除去反应瓶中空气；在氩气气氛保护下，缓慢加热(升温速率控制为35℃/小时)，升温至110℃，搅拌并保温2小时以除去体系中的水。随后接好冷凝管，升温至250℃，保温进行高温热解反应25分钟；反应结束，自然降至室温。向反应体系中加入22mL无水乙醇，室温下搅拌25分钟，然后进行离心分离。对收集的固体依次用环己烷和乙醇进行超声清洗3次。按1mL：12.5mg的比例将氧化铈疏水纳米颗粒分散于氯仿中。

取氧化铈疏水纳米颗粒氯仿溶液3.5mL，加入1mL的PEG化磷脂-氯仿溶液中(含PEG化磷脂22mg)，于60℃的条件下旋蒸1h。旋蒸条件：抽真空-0.03MPa，120r/min。而后加入5mL去离子水超声分散，超声功率为260W，超声时间为8min，得到抗氧化剂。

试验例1

以实施例1所得的抗氧化剂为例，对其进行经以下测试：

1、外观测试：所得的抗氧化剂为棕黄色，能够稳定的分散在水相中。

2、将实施例1中的2mg氧化铈疏水纳米颗粒分散于1mL氯仿中，其TEM(透射电镜)图谱如图1所示，由图1可见：所制得的氧化铈疏水纳米颗粒为圆形，尺寸2nm左右。

3、测定实施例1中氧化铈疏水纳米颗粒的XRD图谱，其结果如图2所示，由图2可见：所制得的氧化铈疏水纳米颗粒为萤石立方相。

4、为实施例1中2mg的氧化铈亲水纳米颗粒分散于2mL水中，其TEM图谱如图3所示，由图3可见：所制得的氧化铈亲水纳米颗粒为圆形，分散均一。

5、该抗氧化剂的水动力学直径为5-6nm。

试验例2：体外清除活性氧试验

1、清除双氧水

1.1实验材料及仪器：实施例1所制得的抗氧化剂。

1.2实验方法：清除双氧水实验通过red双氧水/过氧化氢酶试剂盒(Molecular Probes,Inc.,USA)检测，根据试剂盒说明使用，测试不同浓度抗氧化剂材料清除活性氧效率。

1.3实验结果

其结果如图4所示，由图4显示的抗氧化剂清除双氧水效率可以看出，抗氧化剂具有高效的清除双氧水性能，清除效率和浓度相关。约63.8％的双氧水在抗氧化剂浓度0.3mM下可以被清除。

2、清除超氧阴离子

2.1实验材料及仪器：实施例1所制得的抗氧化剂。

2.2实验方法：清除超氧阴离子实验通过SOD试剂盒(Sigma-Aldrich,USA)检测，根据试剂盒说明使用，测试不同浓度抗氧化剂材料清除超氧阴离子效率。

2.3实验结果

其结果如图5所示，由图5显示的抗氧化剂清除超氧阴离子效率可以看出，抗氧化剂具有较高的清除超氧阴离子性能，清除效率和浓度相关，抗氧化剂浓度为0.3mM时，清除率高达30.2％。

试验例3：改善小鼠急性肾损伤实验

1、体分布

1.1实验材料及仪器：实施例1所制得的抗氧化剂。

1.2实验动物：昆明鼠(4-6周)，平均体重20g，购自南昌大学医学院动物科技部。

1.3实验方法：小鼠用水合氯醛进行腹腔麻醉后，尾静脉注射超小氧化铈纳米抗氧化剂。(剂量为1mg/kg)，注射30分钟及24小时后取出各器官，做元素分析，观察体分布情况。

1.4实验结果：

其结果如图6所示，由图6显示的抗氧化剂在AKI小鼠体内分布图可以看出：上述抗氧化剂在肾脏具有较高的聚集量，30分钟后高达21.1％Ce ID/g，1天后肾部仍有15.5％CeID/g的聚集量。

2、AKI动物模型

2.1实验方法：昆明小鼠禁水禁食15个小时后，50％的甘油通过肌肉内注射至小鼠后肢(8mL/kg)，随后小鼠不再禁水禁食。

3、肾功能评估

3.1实验材料

实施例1所制得的抗氧化剂。

3.2实验方法：AKI模型诱发2小时后，尾静脉注入抗氧化剂(1mg/kg)，同时选取尾静脉注入PBS作为对照组。24小时后，采取小鼠血样进行肾功能指标检测。同时将不同组小鼠肾摘除进行常规的H&E染色来观察病例变化。

3.3实验结果：

其结果如图7和图8所示，由图7显示的AKI小鼠治疗组及对照组的肾功能指标血清肌酸酐(CRE，图7中标记为B)和血液尿素氮(BUN，图7中标记为A)可以看出：PBS对照组小鼠肾指标远高于正常值，说明肾损伤严重。而纳米氧化铈可以有效降低CRE和BUN指标至正常值。预示着抗氧化剂可以有效清除AKI小鼠肾部活性氧，改善AKI症状。

由图8显示的AKI小鼠治疗组及对照组的肾组织切片可以看出：对照组小鼠肾部出现了明显的肾小管损伤及堵塞，而抗氧化剂治疗组则明显改善，表现为较低的病理损伤。病理切片提供了直接的证据，表明抗氧化剂可以保护肾不受损伤。

综上所述，本申请提供的抗氧化剂的水动力学直径不超过10nm，具有良好的多重清除活性氧的功能，并且其尺寸小，能有效地在肾部位聚集，进而清除肾部位中的活性氧。其制备方法简单、易操作，适于工业化生产。将上述抗氧化剂用于清除活性氧，具有较佳效果，并且其在肾脏具有较长的滞留时间，可清除肾脏过量的活性氧，缓解急性肾损伤症状，对于医学急性肾损伤的治疗具有重要价值和意义。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗氧化剂，其特征在于，所述抗氧化剂是通过对纳米抗氧化剂进行亲水改性制得的，且所述抗氧化剂的水动力学直径不超过10nm，优选为5-6nm；

优选地，所述纳米抗氧化剂为纳米氧化物，更优选为纳米氧化铈；

优选地，所述亲水改性采用亲水材料进行，更优地，所述亲水材料为PEG化磷脂；

优选地，所述纳米抗氧化剂的粒径为1-2nm；

优选地，所述纳米抗氧化剂的纳米颗粒为萤石立方相。

2.如权利要求1所述的抗氧化剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用亲水材料对纳米抗氧化剂进行亲水改性；

优选地，用PEG化磷脂对纳米氧化铈进行亲水改性。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，亲水改性包括以下步骤：将纳米氧化铈分散液与PEG化磷脂溶液混合，随后除去溶剂；

优选地，所述溶剂包括氯仿；

优选地，所述纳米氧化铈分散液的浓度为10-15mg/mL；

优选地，所述PEG化磷脂溶液的浓度为18-22mg/mL；

优选地，混合时，所述纳米氧化铈分散液与所述PEG化磷脂溶液的体积比为(2.5-3.5)：1。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，采用旋蒸方式除去所述溶剂；

优选地，旋蒸过程中真空度为-0.025MPa至-0.03MPa，和/或转速为80-120r/min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括：除去所述溶剂后再与去离子水混合并超声分散。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，超声分散于功率为220-260W的条件下进行8-12min。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纳米氧化铈的制备方法包括：将含有Ce³⁺的前驱体水溶液进行热解，热解温度为240-250℃；

优选地，热解时间为20-30min；

优选地，所述纳米氧化铈的制备方法包括：将含有Ce³⁺的前驱体水溶液、油胺和十八烯混合，在保护气氛下加热除水，随后进行所述热解；

优选地，所述Ce³⁺的前驱体水溶液包括Ce³⁺的卤化盐或Ce³⁺的硝酸盐；

优选地，混合时控制Ce³⁺、所述油胺和所述十八烯的摩尔比为1:3:(10-20)；

优选地，在10-25℃和搅拌条件下进行混合，更优选地，混合时间为1-3h；

优选地，所述保护气氛包括氩气气氛。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，加热除水的温度为100-120℃；

优选地，加热除水时的升温速率为25-35℃/小时；

优选地，加热除水的保温时间为1-2h。

9.权利要求1所述的抗氧化剂的应用，其特征在于，所述抗氧化剂用于清除活性氧；

其中，所述活性氧包括双氧水、羟自由基和超氧阴离子中的至少一种；

优选地，所述抗氧化剂用于清除肾脏中过量的活性氧。

10.权利要求1所述的抗氧化剂在制备用于治疗急性肾损伤相关疾病的药物中的应用。