CN113384689A - 一种硼烯纳米疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
一种硼烯纳米疫苗及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种硼烯纳米疫苗及其制备方法和应用,所述硼烯纳米疫苗包括:硼烯纳米片、肿瘤自身抗原和免疫佐剂;所述硼烯纳米疫苗通过多巴胺介导的方式在所述硼烯纳米片的表面制备肿瘤自身抗原涂层,再负载所述免疫佐剂制备得到。本发明还提供了所述硼烯纳米疫苗的制备方法以及一种肿瘤治疗药物。本发明所述硼烯纳米疫苗具有良好的生物相容性、循环性、光声成像性及治疗性,可以在清除实体肿瘤的同时激活体内的抗肿瘤免疫过程,抑制肿瘤的转移与复发;生物利用率高,制备方法简单,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域,尤其涉及一种硼烯纳米疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是一种通过刺激或调节机体的免疫系统来消灭肿瘤细胞的方法,特别是通过增强局部肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力来达到治疗的效果。肿瘤免疫治疗具有较高的免疫特异性,对健康组织的损伤较小,在化疗、放疗和分子靶向治疗后,已经成为一种新型的临床治疗癌症的手段。
然而,由于肿瘤的免疫逃逸,肿瘤免疫治疗往往受到限制。此外,由于肿瘤微环境中的物理屏障和免疫抑制微环境,实体瘤的免疫治疗效果不理想,从而限制了药物积累、T细胞浸润和抗肿瘤效果。治疗性肿瘤疫苗已成为癌症治疗领域的一个研究重点。作为特异性和免疫性的肿瘤相关抗原(如多肽、DNA和RNA等),肿瘤疫苗在细胞因子、趋化因子或其他佐剂的协助下,激活或加强宿主的特异性抗肿瘤免疫反应,以杀死和根除肿瘤细胞。然而,这种治疗方法在确定目标抗原方面存在困难,即很难找到合适的肿瘤抗原来识别肿瘤,如三阴性乳腺癌等。此外,单独的肿瘤疫苗不能治愈晚期肿瘤。如何将主动特异性免疫治疗与手术、化疗、放疗有机地结合起来,充分发挥综合治疗疗法的作用,将成为一个重要的研究方向。
因此,如何提供一种新的治疗性肿瘤疫苗,可以在识别、清除肿瘤的同时激活抗肿瘤免疫反应,已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种硼烯纳米疫苗及其制备方法和应用,通过将肿瘤抗原与免疫佐剂共同传递,具有良好的抗原识别能力,并能被体内的抗原呈递细胞有效吸收,治疗效果好,利用率高。
为达此目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种硼烯纳米疫苗,所述硼烯纳米疫苗包括:硼烯纳米片、肿瘤自身抗原和免疫佐剂;
所述硼烯纳米疫苗通过多巴胺介导的方式在所述硼烯纳米片的表面制备肿瘤自身抗原涂层,再负载所述免疫佐剂制备得到。
本发明中,硼烯纳米片具有良好的生物安全性、快速循环性、综合光声成像诊断和治疗性能,可作为多模式联合治疗系统,具有巨大的临床应用潜力;在硼烯纳米片表面包覆肿瘤自身抗原涂层可以刺激体内产生抗肿瘤免疫,负载免疫佐剂后可以放大免疫信号,增强免疫效果;所述硼烯纳米疫苗在近红外光照射后产生光热效应,激活树突状细胞,其进入淋巴结并把抗原呈递给CD8+T细胞,引起免疫源性细胞死亡,消除实体肿瘤的同时进一步激活体内的抗肿瘤免疫过程;纳米疫苗增强了肿瘤特异性CD8+T细胞对光热处理残留物的清除,可以诱导出强大而持久的免疫反应,防止肿瘤复发与转移,并且可以将肿瘤抗原与免疫佐剂共同传递,被抗原呈递细胞(如巨噬细胞和树突状细胞)有效吸收,提高了纳米疫苗的利用率。
优选地,所述肿瘤自身抗原包括肿瘤细胞裂解液。
本发明中,所述肿瘤细胞裂解液可以为手术切除的肿瘤,含有患者特定的肿瘤自身抗原,因此可以用来制备患者个性化的纳米疫苗,针对性更强,治疗效果更好。
优选地,所述免疫佐剂包括受体激动剂。
优选地,所述受体激动剂包括Toll样受体激动剂R848。
第二方面,本发明提供了一种第一方面所述的硼烯纳米疫苗的制备方法,所述制备方法包括:
制备肿瘤自身抗原,制备硼烯纳米片,在多巴胺介导下,使用所述肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片,再负载免疫佐剂,得到所述硼烯纳米疫苗。
对硼烯纳米片(BNSs)进行抗原修饰通常需要先进行氧化处理,增加了工艺难度的同时还对纳米材料的性能有影响,若氧化程度较低则修饰位点不够,使纳米材料表面修饰的抗原及负载的药物偏低,若氧化程度较高则会影响材料的光热转换率、光声成像效率等,不利于临床的检测与应用。本发明中,通过多巴胺介导的方式使用肿瘤自身抗原对硼烯纳米片进行修饰,可以避免对原材料进行氧化而引起的材料性能改变的弊端,不影响材料本身的特性,还可以提供充足的可修饰位点,且简化了制备工艺,应用价值极高。
优选地,所述制备肿瘤自身抗原的方法包括:
制备肿瘤细胞单细胞悬液,离心后收集,分散,液氮冷冻后裂解,离心去除肿瘤碎片后,收集上清液,得到所述肿瘤自身抗原。
优选地,所述液氮冷冻的时间为55~70min,例如可以是55min、56min、57min、58min、59min、60min、61min、62min、63min、64min、65min、66min、67min、68min、69min或70min等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述裂解的次数为4~6次,例如可以是4次、5次或6次,所述裂解持续的时间为25~35min,例如可以是25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min或35min等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述离心的转速为7500~8500rpm,例如可以是7500rpm、7600rpm、7700rpm、7800rpm、7900rpm、8000rpm、8100rpm、8200rpm、8300rpm、8400rpm或8500rpm等,所述离心的时间为4~8min,例如可以是4min、4.5min、5min、5.5min、6min、6.5min、7min、7.5min或8min等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述制备肿瘤自身抗原还包括测定肿瘤抗原含量的步骤。
优选地,所述制备硼烯纳米片的方法包括:
将硼粉分散在异丙醇中,超声,离心去除块状硼,收集悬浮液再次离心,沉淀使用异丙醇洗涤,得到所述硼烯纳米片。
优选地,所述超声的功率为400~550w,例如可以是400w、410w、420w、430w、440w、450w、460w、470w、480w、490w、500w、510w、520w、530w、540w或550w等,所述超声的时间为8~12h,例如可以是8h、8.5h、9h、9.5h、10h、10.5h、11h、11.5h或12h等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述离心的转速为2500~3000rpm,例如可以是例如可以是2500rpm、2600rpm、2700rpm、2800rpm、2900rpm或3000rpm等,所述离心的时间为15~30min,例如可以是15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述再次离心的转速为11000~13000rpm,例如可以是11000rpm、11200rpm、11400rpm、11600rpm、11800rpm、12000rpm、12200rpm、12400rpm、12600rpm、12800rpm或13000rpm等,所述再次离心的时间为20~40min,例如可以是20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min、31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min或40min等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述洗涤的次数为2~5次,例如可以是2次、3次、4次或5次。
优选地,所述肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片的方法包括:
制备多巴胺和硼烯纳米片的悬浮液,再与碱性氧化剂溶液混合,再与肿瘤自身抗原混合,纯化后得到肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片。
优选地,所述制备多巴胺和硼烯纳米片的悬浮液使用的液体包括水和/或乙醇溶液。
优选地,所述碱性氧化剂包括高锰酸钾、高碘酸钠或氢氧化钠中的任意一种。
优选地,所述与碱性氧化剂溶液混合的方式为搅拌,所述搅拌的时间为10~20min,例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述与肿瘤自身抗原混合的方式为避光搅拌,所述避光搅拌的时间为1.5~2.5h,例如可以是1.5h、2h或2.5h等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述纯化的方式包括透析,所述透析使用的透析袋的截留分子量为8~14kDa,例如可以是8kDa、8.5kDa、9kDa、9.5kDa、10kDa、10.5kDa、11kDa、11.5kDa、12kDa、12.5kDa、13kDa、13.5kDa或14kDa等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述透析后还包括冷冻干燥的步骤。
优选地,所述肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片中还包括测定肿瘤抗原包被量的步骤。
优选地,所述负载免疫佐剂的方法包括:
将含有免疫佐剂的甲醇溶液加入所述肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片的悬浮液中,搅拌,离心取上清液。
优选地,所述搅拌的时间为10~14h,例如可以是10h、10.5h、11h、11.5h、12h、12.5h、13h、13.5h或14h等,该数值范围内的其他具体点值均可选择,在此便不再一一赘述。
优选地,所述负载免疫佐剂还包括计算免疫佐剂装载率的步骤。
作为优选技术方案,本发明所述硼烯纳米疫苗的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备肿瘤自身抗原:
制备肿瘤细胞单细胞悬液,离心后收集,分散,液氮冷冻55~70min后,裂解4~6次,持续25~35min,7500~8500rpm离心4~8min去除肿瘤碎片后,收集上清液,测定肿瘤抗原含量,得到所述肿瘤自身抗原;
(2)制备硼烯纳米片:
将硼粉分散在异丙醇中,400~550w超声8~12h,2500~3000rpm离心15~30min去除块状硼,收集悬浮液,11000~13000rpm再次离心20~40min,沉淀使用异丙醇洗涤2~5次,得到所述硼烯纳米片;
(3)肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片:
使用水和/或乙醇溶液制备多巴胺和硼烯纳米片的悬浮液,再与碱性氧化剂溶液混合,搅拌10~20min,再与肿瘤自身抗原混合,避光搅拌1.5~2.5h,使用截留分子量为8~14kDa的透析袋进行透析,冷冻干燥后得到肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片,并测定肿瘤抗原包被量;
(4)负载免疫佐剂:
将含有免疫佐剂的甲醇溶液加入所述肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片的悬浮中,搅拌10~14h,离心取上清液,并计算免疫佐剂装载率,得到所述硼烯纳米疫苗。
第三方面,本发明提供了第一方面所述的硼烯纳米疫苗和/或第二方面所述的硼烯纳米疫苗的制备方法在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明中,所述硼烯纳米疫苗可以在杀伤肿瘤细胞的同时激活体内的抗肿瘤免疫过程,抑制肿瘤的转移与复发,治疗效果极佳,生物相容性好;制备工艺简单,成功率高,具有极高的应用价值。
第四方面,本发明提供了一种肿瘤治疗药物,所述肿瘤治疗药物包括第一方面所述的硼烯纳米疫苗。
本发明中,所述肿瘤治疗药物中含有病人自身特定的肿瘤自身抗原,针对性更强,毒副作用更小,应用前景广阔。
优选地,所述肿瘤治疗药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
相比于现有技术,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明所述硼烯纳米疫苗在近红外光照射后可以在清除实体肿瘤的同时激活体内的抗肿瘤免疫过程,刺激细胞因子的分泌及T细胞的成熟,可以抑制肿瘤的复发与转移,治疗效果持久;具有良好的靶向性,对正常细胞的毒副作用小,不影响正常的生理活动;纳米疫苗微粒可以将肿瘤抗原与免疫佐剂共同传递,可以被抗原呈递细胞有效吸收,利用率高;所述硼烯纳米疫苗具有良好的安全性、循环性、成像性、治疗性及药物释放可控性,可配合临床检测仪器使用,形成多模式联合治疗系统,发挥更好的治疗效果,临床应用潜力巨大;
(2)所述硼烯纳米疫苗通过多巴胺介导的方式将肿瘤自身抗原和免疫佐剂修饰在硼烯纳米片表面,不影响纳米材料本身的特性的同时提供了充足的可修饰位点,肿瘤抗原包被量及免疫佐剂的装载率均较高,治疗效果更好;生产工艺简单,技术成熟,科学高效,促进了产品的使用与推广。
附图说明
图1A为BNSs和B@TF的透射电子显微镜表征图片(从左至右每一列图片的比例尺依次为600nm、200nm和100nm);
图1B为BNSs的马尔文激光粒度仪的检测结果图片;
图1C为B@TF的马尔文激光粒度仪的检测结果图片;
图1D为BNSs和B@TF的X射线能谱分析仪的检测结果图片(比例尺=100nm);
图1E为BNSs和B@TF的X射线光电子能谱仪的检测结果图片;
图1F为BNSs的原子力显微镜的检测结果图片(比例尺=400nm);
图1G为B@TF的原子力显微镜的检测结果图片(比例尺=400nm);
图1H为BNSs和B@TF的傅里叶变换红外光谱的检测结果图片;
图1I为BNSs和B@TF的光稳定性的检测结果图片;
图1J为BNSs在激光照射下的光热升温曲线图片;
图1K为B@TF在激光照射下的光热升温曲线图片;
图1L为BNSs和B@TF-R848的体外光声成像能力的检测结果图片;
图1M为B@TF-R848的药物释放性能的检测结果图片;
图2A为BNSs、B@TF和B@TF-R848在无近红外辐射下对HUVEC细胞的杀伤能力的结果图片;
图2B为对照组、BNSs、B@TF和B@TF-R848在近红外辐射下对4T1细胞的杀伤能力的结果图片;
图2C为B@TF-R848对4T1细胞的光热破坏效应的结果图片(比例尺=100μm);
图2D为B@TF-R848在4T1细胞中的摄取及定位的结果图片(比例尺=20μm);
图3A为B@TF-R848-Cy7在小鼠体内的肿瘤和主要器官的分布情况图片;
图3B为分别注射了生理盐水、BNSs和B@TF-R848的小鼠在辐照条件下的红外热成像图片;
图4A为实施例5中不同组别的小鼠的肿瘤体积的统计图片;
图4B为实施例5中不同组别的小鼠的体重的统计图片;
图4C为BNSs和B@TF-R848在肿瘤细胞中分布的光声成像图片;
图4D为实施例5中不同组别的小鼠的肿瘤的H&E染色和Ki-67染色的结果图片(H&E染色图片的比例尺均为100μm,Ki-67染色图片的比例尺均为50μm);
图4E为实施例5中不同组别的小鼠肿瘤的生长抑制率的统计图片;
图4F为实施例5中不同组别的小鼠的肺部H&E染色的图片(比例尺均为100μm);
图5A为空白Cy7和B@TF-R848-Cy7处理后的BM-DCs的免疫荧光图片(比例尺=20μm);
图5B为B@TF-R848处理后的BM-DCs的透射电子显微镜图片(比例尺=2μm);
图5C为实施例6中不同组别的BM-DCs的体外成熟度的统计图片;
图5D为实施例6中不同组别小鼠的血清中细胞因子浓度的统计图片;
图5E为实施例6中不同组别小鼠的淋巴结细胞的流式细胞术结果图片;
图5F为实施例6中不同组别小鼠的淋巴结细胞中树突状细胞的成熟度结果图片;
图5G为实施例6中不同组别小鼠的脾脏细胞的流式细胞术结果图片;
图5H为实施例6中不同组别小鼠的脾脏中T细胞的成熟度结果图片;
图5I为实施例6中不同组别小鼠的CD8+T淋巴细胞的瘤内浸润情况图片(比例尺=100μm);
图5J为实施例6中不同组别小鼠的CD8+T淋巴细胞的比例统计图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料:
4T1细胞和HUVEC细胞来自传秋生物;
Balb/c小鼠、B6小鼠购自南京模式动物研究中心,得到伦理委员会批准,根据动物福利委员会批准的标准指导方针进行;
临床样本由肿瘤患者提供,签订了医学研究的书面知情同意书;
硼粉购自Maclin;
Toll样受体激动剂R848、hoechst33342、2-巯基乙醇和FITC购自Sigma Aldrich;
透析袋购自(截留分子量为8~14kDa)和透析袋购自(截留分子量为5kDa)购自北京索莱宝科技有限公司;
CCK-8实验试剂、活/死细胞双重染色试剂盒购自Dojindo MolecularTechnologies;
GM-CSF购自PeproTech;
FBS和RPMI-1640培养基购自GIBCO;
Cy7购自上海阿拉丁;
酶联免疫吸附试验试剂盒购自Biolegend;
H&E染色试剂购自北京百灵威科技有限公司;
Ki-67染色试剂购自Abcam;
双缩脲酸检测试剂盒、抗CD11c-FITC抗体、抗CD80-Cy5.5抗体、抗CD86-APC抗体、抗CD3-APC抗体、抗CD4-FITC抗体和抗CD8a-PE抗体购自Thermo Fisher Scientific。
实施例1
本实施例提供一种硼烯纳米疫苗,所述硼烯纳米疫苗包括:硼烯纳米片、三阴性乳腺癌细胞抗原和Toll样受体激动剂R848,所述硼烯纳米疫苗通过如下方法进行制备:
(1)制备肿瘤自身抗原:
将小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1接种到Balb/c小鼠体内,建立肿瘤小鼠模型。当肿瘤大小增长到直径约10mm时,从小鼠身上剥离肿瘤组织,将肿瘤标本放入含有50μg/mL庆大霉素的HBSS中,在无菌条件下迅速送入细胞实验室。
将肿瘤捣碎并通过70μm细胞过滤器,制备肿瘤细胞单细胞悬液。将肿瘤细胞悬液在3000rpm下离心2min并收集,然后分散在20mL的PBS中,在液氮中冷冻60min,并在室温下裂解5次,持续30min。8000rpm离心5min去除肿瘤碎片,并收集上清液,使用双缩脲酸(BCA)检测试剂盒按说明书测定肿瘤抗原含量,计算结果为肿瘤抗原含量为50.4±7.9%,得到所述肿瘤自身抗原。
(2)制备硼烯纳米片:
将硼粉分散在异丙醇(IPA)中,终浓度为5mg/mL;溶液在冰浴中以500w的功率超声处理10h,3000rpm离心处理20min去除块状硼,收集悬浮液,12000rpm离心30min,沉淀使用IPA清洗3次,得到所述硼烯纳米片。
(3)肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片:
向1mL乙醇中加入0.2mg多巴胺和1mg BNSs,制成悬浮液,再加入20μL15mg/mL的高锰酸钾,搅拌15min,再加入10μL 100mg/mL的肿瘤自体抗原(TF)溶液,在环境温度下避光磁力搅拌2h,使用截留分子量为8~14kDa的透析袋进行透析,冻干后得到肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片,命名为B@TF。
根据BCA蛋白测定法计算肿瘤抗原的包被量。将制备的B@TF悬浮液在12000rpm离心5min,取上清液,在4℃下使用截留分子量为5kDa的透析袋透析过夜。按比例稀释后,用紫外-可见分光光度计测定上清液样品的吸光度,并通过BCA标准曲线计算浓度。肿瘤抗原的包被量(CA)计算为
CA(wt%)=(WTF(上清液)/WTF)×100%。
其中,WTF(上清液)和WTF分别为上清液中TF的重量和添加的TF的重量。
(4)负载免疫佐剂:
将100μL 10mg/mL的R848甲醇溶液加入到900μL不同质量的B@TF悬浮液中(依次为200、180、160、140和120μg),搅拌12h,离心后取上清液。采用高效液相色谱法(HPCL,流动相为乙腈和0.1%磷酸水溶液,测定波长254nm)检测上清液,计算R848的装载率,公式为:
DL(wt%)=(WR848/WB@TF)×100%。
其中,WR848和WB@TF分别为纳米疫苗中R848的重量和添加的B@TF-R848的重量。
通过上述步骤,成功制备得到所述硼烯纳米疫苗B@TF-R848。
实施例2
本实施例对实施例1制备的硼烯纳米疫苗及中间产物进行表征。
透射电子显微镜表征
使用透射电子显微镜(TEM,JEM-3200Fs,JEOL,日本)对BNSs和B@TF的形态进行了表征,结果如图1A所示。
由图可知,根据典型的单个硼片的衍射图案确定了硼片的结晶性质,显示出明显的干涉条纹,d间距为0.51nm,对应于β-斜方六面体硼结构的平面。BNSs和B@TF的平均尺寸分别为140和200nm。
分散性能表征
将BNSs和B@TF用水配置成悬浮液,使用马尔文激光粒度仪进行观察,结果如图1B和图1C所示。由图可以看出二者在水中都具有良好的分散性,可以产生丁达尔效应。
元素组成表征
使用X射线能谱分析仪(EDS)对BNSs和B@TF的元素组成进行检测,元素图谱如图1D所示。
由图可知,BNSs中只含有硼元素,碳和氧的含量均很低,表明其纯度很高,其中只有少量发生了氧化,并且只掺杂了微量杂质;而B@TF中含有大量的碳、氧、氮和锰元素,表明肿瘤自身抗原成功包覆到BNSs的表面。
此外,还通过X射线光电子能谱仪(XPS,ESCALAB 250Xi,Japan)对元素组成进行了进一步确认,结果如图1E所示。
有图可知,B@TF中不仅包括硼、碳和氧,还包括氮和锰。元素映射图清楚地显示,碳、氧、氮和锰出现在硼片的周围。这可以证实,反应后蛋白质被包裹在BNSs周围。同时,XPS调查光谱显示,与BNSs组相比,B@TF中出现了两个新的氮峰和锰峰。
厚度表征
使用原子力显微镜(AFM,FASTSCANBIO,德国)检测了BNSs和B@TF的厚度,结果如图1F和图1G所示。
有图可知,BNSs的平均厚度为小于1nm,在BNSs表面包覆肿瘤自身抗原后,B@TF的厚度变成了6~8nm,表明表面包覆肿瘤自身抗原后,厚度增加。
蛋白质包装表征
使用傅里叶变换红外光谱(FTIR,Nexus 470,Nicolet,Madison,WI,USA)对BNSs和B@TF的蛋白质包装情况进行了表征,结果如图1H所示。
由图可知,在携带肿瘤自身抗原蛋白的B@TF中观察到的1220、1540和1650cm-1的吸收峰归属于酰胺I/II/III带。这些特征性的蛋白质峰表明,肿瘤自身抗原蛋白已经成功地被包覆在BNSs上。
近红外诱导热效应表征
将BNSs和B@TF悬浮液暴露在近红外激光下进行六期照射,检测BNSs和B@TF的光稳定性,用808nm激光(2W/cm2)对悬浮液(200μg/mL)进行照射,升到最高温度后停止照射让溶液自然冷却至室温,再进行照射,重复该过程六次。记录六个循环过程的时间-温度变化数据并绘制曲线,结果如图1I所示。
由图可知,近红外的功率密度为2w/cm2,在6个周期的加热和冷却过程中,光热效应的变化不明显,从而表明BNSs和B@TF具有较高的光稳定性。
测定BNSs和B@TF的光热转换效率(PTCE):通过照射含有1mL不同浓度的BNSs和B@TF分散液的1cm的石英比色皿进行测量。近红外激光照射采用808nm、5W的多模二极管激光器(宁波LaseverTM公司)。用红外热成像仪(FLIRTM E60,美国)记录被照射的水性溶液的温度。当系统内达到热平衡的速度远远超过与周围环境的能量交换时,PTCEη可以通过公式确定:
其中η是入射激光能量转化为热能的PTCE,I是入射激光功率(以mW为单位),A808是样品在808nm波长下的吸收率,h是传热系数,A是容器的面积,△Tmax是最大稳态温度下的温度变化(△Tmax=Tmax-Tamb,其中Tmax是系统的最高温度,Tamb是周围的环境温度)。Qs代表由样品池本身吸收的热量,是用不含样品的纯水的样品池独立测量的。当使用含有水样的硼硅玻璃样品池时,测得的Qs为Qs=(0.54-I)mW。给定入射激光功率I,可以得到Qs=(0.54-I)mW。△Tmax=Tmax-Tamb和A808很容易通过测量得到。
为了确定hA,引入了一个无尺寸驱动力温度θ:
其中t是分散液的实时温度。
考虑到在样品分散液的冷却期间关闭激光辐射,推导出一个有用的关系如下:
其中i项是∑imiCp,i系统组件(样品分散液、样品池等)的质量和热容量的产物。
从公式(3)中可以看出,通过应用冷却阶段的线性时间数据与驱动力温度的负自然对数(曲线"t v.s.-lnθ")可以直接得出hA,并得到:
公式(4)的右边是曲线"t-(-ln(θ))"的斜率,通过使用冷却期间的温度和时间的相关性,得到了"t v.s.-lnθ"的曲线。
因此,从曲线得到t/(-lnθ)的比率为205.2,通过使用公式(4)和给定的数据(mwater=1g,C p,water=4.2J/g),推断出hA的乘积为0.020467836mW/℃。最后,通过将hA的值代入公式(2),可以确定BNSs和B@TA在808nm处的PTCE为23.2%和33.8%。
此外,图1J和1K的结果表明,在激光照射下,水溶液中不同浓度的BNSs和B@TF的温度升高,在相同的照射功率下,它们都表现出强大的光热效应,具有浓度依赖性。最大温度梯度(ΔTmax)为39.5℃和43.2℃。此外,B@TF的光热转换效率和ΔTmax高于BNSs,这可能是聚多巴胺导致。高的光热转换效率表明,BNSs和B@TF可以作为癌症光热治疗的有效试剂。
光声成像特性表征
分别对BNSs和B@TF-R848的体外光声成像(PA成像)能力进行检测。将1mL的BNSs和B@TF-R848水溶液(浓度分别为0、0.031、0.062、0.125、0.25和0.5mg/mL)加入到24孔板中,使用Vevo LAZR光声成像系统(Visual-Sonics公司)对硼样品沿波长680~850nm的激发光进行扫描,收集光声信号,确定以下光声成像测试中选择的激发光为780nm。进行光声信号检测,结果如图1L所示。
有图可知,在780nm波长下,BNSs和B@TF-R848组都发现了强烈的浓度依赖性PA信号,这意味着B@TF-R848有可能成为一种PA剂,以促进成像引导的恶性肿瘤治疗。
药物释放性能表征
将1mg B@TF-R848样品重新分散在1mL的PBS缓冲溶液(pH=7.4)中,并在不同的时间进行孵化。12000rpm离心后,收集上清液,并混合等体积的甲醇以溶解药物。用HPLC检测混合物,计算R848的释放量。将100μL 10mg/mL的R848甲醇溶液加入到900μL不同质量的B@TA悬浮液中(200、180、160、140和120μg),并搅拌12h,离心后保留上清液用于检测。采用高效液相色谱法(HPCL,流动相为乙腈和0.1%磷酸水溶液,测定波长254nm)检测上清液,测量R848的装载率。药物装载率(DL)计算为:
DL(wt%)=(WR848,L/WB@TA)×100%
其中,WR848,L和WB@TF分别为纳米疫苗中R848的重量和添加的B@TA-R848的重量。
为了研究R848的释放动力学,将1mg B@TA-R848样品重新分散在1mL PBS缓冲溶液(pH=7.4)中,并在不同时间进行培养。以12,000rpm的速度离心后,收集上清液并混合等体积的甲醇以溶解药物。然后用HPLC检测混合物,并计算出R848的释放量。为了研究近红外触发的R848的释放,在相同的条件下,以不同的孵育时间在808nm的近红外激光(2W/cm2,10mim)照射下,进行了药物释放过程的测试,结果如图1M所示。由图可知,B@TF可以有效地装载R848,最大装载效率约为73%,这可能与BNSs、聚多巴胺和药物分子之间产生的π-π堆叠效应有关。在二维纳米材料中,硼的分子质量最小,使其具有很高的药物装载率。在酸性(pH=6.5)和近红外照射的触发下,由于聚多巴胺降解引起的蛋白质外壳的破裂,药物可以被释放。R848在PBS中,24h内从B@TF-R848中释放的比例不到总药物的20%,而在pH=6.5条件下,B@TF-R848的释放率在6h内达到约50%,24h内达到约60%,在pH=6.5条件下,伴随808nm的近红外照射,药物的释放率在短短6h内达到60%以上,24h内接近80%。
综合上述结果,硼烯纳米疫苗具有良好的分散性能、肿瘤自身抗原蛋白包覆完全、具有近红外诱导热效应、具有光声成像能力以及可控药物释放等独特优势,在生物医学开发和应用方面具有巨大潜力。
实施例3
本实施例对实施例1制备的硼烯纳米疫苗及中间产物的光热杀伤肿瘤细胞的性能进行检测,包括以下步骤:
将HUVEC细胞接种在96孔板中(5000个细胞/孔),培养24h后分别与含不同浓度(浓度分别为10、25、50、100和200μg/mL)的BNSs、B@TF和B@TF-R848的培养基孵育24h后,用CCK-8试剂盒测定其体外细胞毒性,结果如图2A所示。
由图可知,细胞相对存活率约为1.0,从而表明在这些浓度下,BNSs、B@TF和B@TF-R848对HUVEC细胞没有明显的细胞毒性。
此外,将4T1细胞接种在96孔板中(5000个细胞/孔),培养24h后分别与含不同浓度(浓度分别为6.25、12.5、25、50和100μg/mL)的BNSs、B@TF和B@TF-R848的培养基孵育24h后,在808nm激光(2w/cm2)下照射5min,再培养4h,用CCK-8试剂盒测定其体外细胞毒性。同时设置未处理的细胞进行相同的操作作为对照,结果如图2B所示。
由图可知,4T1细胞在近红外照射后表现出明显的浓度依赖性光热消融效应。在药物浓度为100μg/mL时,用BNSs处理的细胞存活率为小于50%,而B@TF和B@TF-R848组的存活率不到20%,这是由于聚多巴胺包被后光热效应提高的结果。
通过激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)图像进一步证明肿瘤细胞的光热破坏效应。将4T1细胞接种在27mm的玻璃底培养皿中,培养24h后,将B@TF-R848加入孔中,B@TF-R848的浓度为100μg/mL。12h后,用808nm激光(2w/cm2,5min)对细胞进行局部照射。4h后,用活/死细胞双重染色试剂盒检测细胞活力,并使用激光共聚焦显微镜(CLSM,蔡司710NLO)拍摄染色细胞的荧光照片,如图2C所示。该图像是在用钙黄素-AM和碘化丙啶双染色试剂盒共同染色后得到的,这使活细胞发出绿色荧光,死细胞发出红色荧光。在激光照射的部位观察到大量的细胞死亡,而在未照射的区域没有观察到明显的细胞死亡。在图像中可以清楚地注意到红色和绿色之间的明显分界线,这显示了B@TF-R848在癌细胞中的出色光热破坏能力。
此外,还通过CLSM研究了B@TF-R848在4T1细胞中的细胞摄取和细胞内贩运。将4T1细胞接种在27mm的玻璃底培养皿中,培养24h后,将B@TF-R848加入孔中,B@TF-R848的浓度为100μg/mL。12h后,用808nm激光(2w/cm2,5min)对细胞进行照射,通过免疫荧光对细胞核、溶酶体和纳米疫苗进行定位,结果如图2D所示。
由图可知,B@TF-R848-Cy7在孵化6h后被有效地内化并定位在溶酶体区室中,这一点通过与溶酶体标签的共定位得到了证明,在合并图像中显示为黄色荧光。
综合上述结果,表明B@TF-R848对正常细胞的杀伤作用较小,生物相容性好;在近红外辐射下可以对肿瘤细胞进行有效杀伤;B@TF-R848可以被肿瘤细胞有效摄取并运输到细胞内,生物利用率高。
实施例4
本实施例对实施例1制备的硼烯纳米疫苗及中间产物的体内靶向效应进行验证。
雌性Balb/c小鼠(14±2g,5~6周龄)用于建立异种移植4T1肿瘤模型。每天给小鼠免费提供新鲜食物和水,并在实验前至少饲养7d。将T1细胞的PBS细胞悬液(5×107/只)注射到小鼠的右背皮下。大约一周后,肿瘤完全建立。
将游离的Cy7和B@TF-R848-Cy7(剂量:100μL,5mg/kg体重)分别通过尾部静脉注射到4T1异种移植瘤的小鼠体内。12和24h后,使用体外近红外荧光成像技术对小鼠进行测定。小鼠牺牲后,在注射后24h获得主要器官,并通过动物活体成像系统检测药物的分布,结果如图3A所示。
由图可知,在注射后24h,在肝脏和肾脏检测到了游离Cy7的强烈荧光信号,而在肿瘤中没有观察到有效的积累,这表明小分子药物在体内的分布是非特异性的,可以迅速从体内清除。相反,B@TF-R848-Cy7在肿瘤中表现出明显较高的蓄积水平,这一般可归因于渗透性和保留效应的增强(EPR)。除了在肿瘤部位检测到的荧光信号外,在小鼠的主要器官包括肝脏、肾脏和肺部也能检测到。光纳米疫苗在肝脏和肾脏的积累可能是由于新陈代谢,包括单核吞噬细胞系统的快速识别和清除以及肾脏的排泄。此外,在肺部的积累可能是由笨重颗粒的机械停滞造成的。
将4T1肿瘤小鼠随机分组,分别注射100μL的生理盐水、BNSs(1mg/mL)和B@TF-R848(1mg/mL),之后,使小鼠在808nm激光下照射(1w/cm2,5min),通过测量肿瘤的温度变化来监测体内的光热效应,结果如图3B所示。
由图可知,辐照5min后,用生理盐水或BNSs处理的肿瘤部位的温度只分别上升到41.1和52.5℃,而在注射B@TF-R848的小鼠中,肿瘤温度在辐照过程中迅速上升,最高达到61.6℃,这足以导致肿瘤细胞死亡。
上述结果表明,B@TF-R848可以在肿瘤部位有效聚集,并在近红外辐射下迅速升温,发挥肿瘤杀伤的作用。
实施例5
本实施例对实施例1制备的硼烯纳米疫苗及中间产物的体内肿瘤治疗效果进行验证。
当肿瘤大小达到100mm3时,将T1肿瘤小鼠随机分为5组,进行不同的处理。1.生理盐水;2.BNSs;3.B@TF-R848(免疫疗法);4.BNSs+NIR(光热疗法);5.B@TF-R848+NIR(光热和免疫疗法)。静脉注射的剂量为每组5mg/kg体重,每组分别在第1、7和15天给药3次,第4组和第5组在注射后12h在1w/cm2的808nm近红外下照射5min。肿瘤体积用数字卡尺测量记录,根据:V=ab2/2计算肿瘤的相对体积,其中a和b分别代表最大和最小直径。结果如图4A所示。
由图可知,与生理盐水和BNSs相比,第3、4和5组的肿瘤生长减少。第4组和第5组比第3组有更好的治疗效果,这表明光热疗法对实体瘤比单独使用免疫疗法更有效。大约14d后,第4组的肿瘤逐渐恢复生长,从而表明单纯的光热疗法并不能防止肿瘤复发。值得注意的是,第5组的小鼠表现出非常高的肿瘤生长抑制,5只小鼠的肿瘤都消失了,没有复发,这表明光热疗法-免疫疗法的联合治疗具有显著的协同作用。
在所有组别中,没有发现明显的副作用,包括不正常的体重减轻、饮食或活动障碍(如图4B所示)。在光声成像结果中,与对照组相比,静脉注射BNSs和B@TF-R848后,在肿瘤部位测量到强烈的PA信号,而且大部分信号集中在肿瘤外缘的血管附近(如图4C所示),这表明纳米疫苗具有光声成像能力,可用于观察其在肿瘤内的分布。它还表明,纳米疫苗可以通过EPR效应在肿瘤中积累,但仍然难以进入实体瘤内部。
取小鼠体内的肿瘤,使用10%中性福尔马林固定瘤组织,石蜡包埋后制成切片,H&E染色和Ki-67染色,显微镜检查,结果如图4D所示。由图可知,第5组的肿瘤细胞死亡数量最大。根据肿瘤生长抑制率(TGI,%)=(1-V实验组/V对照组)×100%来计算肿瘤生长抑制率,并对结果进行统计,如图4E所示。由图可知,B@TF-R848组的肿瘤抑制率最高。
肺组织切片经H&E染色和数字图像显示,第1组和第2组小鼠的肺部发现了肿瘤转移,第5组没有发现明显的肿瘤转移(如图4F所示),从而表明与盐水处理组相比,用B@TF-R848+NIR处理的小鼠有效地防止了肿瘤的转移。
实施例6
本实施例对实施例1制备的硼烯纳米疫苗及中间产物的免疫系统激活效果进行验证。
小鼠骨髓源性树突状细胞(BM-DCs)来源于B6小鼠,未成熟的BM-DCs(4×106)在添加了10%FBS、0.8ng/mL 2-巯基乙醇(2-ME)和20ng/mL小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的RPMI-1640培养基中(GIBCO)中培养3天。将BM-DCs按5×105个细胞/孔接种于6孔板中,分为对照组、BNSs组、B@TF组和B@TF-R848组,分别进行处理:1.对照组,用完全的RPMI-1640培养;2.BNSs组,用含有50μg/mLBNSs的RPMI-1640培养基培养;3.B@TA组,用含有50μg/mL B@TF的RPMI-1640培养基培养;4.B@TA-R848组,用含有50μg/mL B@TF-R848的RPMI-1640培养基培养。使用hoechst33342对细胞核进行染色、FITC对细胞质进行染色、B@TF-R848-Cy7对B@TF-R848进行染色。B@TF-R848组的免疫荧光及投射电子显微镜图片分别如图5A和图5B所示。由图可知,BM-DCs可以有效地吸收B@TF-R848-Cy7。
检测不同组别的BM-DCs的体外成熟度。分别收集四组BM-DCs,离心后用PBS悬浮后,使用流式抗体标记(anti-CD11c-FITC、anti-CD80-PE和anti-CD86-APC),并用流式细胞仪检测。结果如图5C所示。由图可知,与对照组、BNSs组和B@TF组相比,B@TF-R848组在体外诱导引起了更高的CD80+、CD86+树突状细胞亚群的扩增,表明B@TF-R848能够刺激BM-DCs的极化和成熟,在体外具有高免疫原性。
将4T1细胞的乳腺癌小鼠被随机分成4组,依次为1.生理盐水;2.BNSs(5mg/kg)+NIR;3.B@TF-R848(5mg/kg);4.B@TF-R848(5mg/kg)+NIR。在肿瘤接种后的第7、11、15天通过尾部静脉注射3次进行免疫。第2组和第4组在第一次注射的12h后接受光热治疗(1w/cm2,5min)。治疗后第21天收集小鼠的血液、腹股沟的淋巴结和脾脏。对于血液样本,在室温下1500rpm离心15min以去除血细胞。使用相关的小鼠酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒按照说明书测定血清细胞因子的浓度,结果如图5D所示。由图可知,在808nm近红外照射下,用B@TF-R848处理的小鼠与其他组相比,IFN-γ、TNF-α和IL-2/6的水平增强,表现出促炎症细胞因子的明显激活,这对肿瘤生长有影响。与其他组相比,IL-10的水平显示变化不大。
淋巴结和脾脏用剪刀将其剁成小块,2mL RBCs裂解缓冲液通过70μm的细胞过滤器,用50mL的聚丙烯管支撑。在离心管中加入额外的3mL RBC裂解缓冲液,得到的单细胞悬浮液在室温下放置20min以裂解RBCs。加入5mL1640完全培养基停止反应,用PBS清洗细胞2次。用抗CD11c-FITC、抗CD80-Cy5.5和抗CD86-APC抗体对分离的淋巴结细胞进行表面标记,用抗CD3-APC、抗CD4-FITC和抗CD8a-PE抗体对脾脏细胞进行表明标记,用流式细胞仪分析四组的免疫反应,结果如图5E~5H所示。与对照组1相比,第2组的小鼠显示出成熟的树突状细胞增加,表明光热处理可以促进肿瘤排泄淋巴结中的DC成熟。同样,单独用B@TF-R848治疗的第3组小鼠也显示出成熟树突状细胞的增加,这表明B@TF辅助的免疫佐剂刺激了DC的成熟。第4组(B@TF-R848+NIR)的小鼠显示出最高的细胞成熟功效。在808nm近红外照射下,用B@TF-R848给药的小鼠在脾脏CD3+T细胞中表现出最高比例的CD8+T细胞。相比之下,BNSs+NIR组和B@TF-R848组的CD8+T细胞的频率与B@TF-R848+NIR组的小鼠相比要低,从而表明与单一治疗相比,将光热和免疫治疗结合起来具有更好的激活免疫系统的效果。
图5I和5J的结果显示了CD8+T淋巴细胞的瘤内浸润情况。由图可知,与未接受激光照射的组(生理盐水和B@TF-R848组)相比,接受激光照射的组(BNSs+NIR和B@TF-R848+NIR组)的淋巴细胞肿瘤浸润情况更好。因此,研究结果表明,光热治疗后,淋巴细胞的浸润在实体瘤中得到了促进。
综上所述,本发明提供了一种硼烯纳米疫苗,其具有良好的近红外诱导效应、光声成像特性和药物可控释放的能力;对正常细胞的毒副作用小,对肿瘤细胞的杀伤效果好,具有良好的靶向性,并且可以刺激体内的抗肿瘤免疫过程并且可以抑制肿瘤的复发与转移;制备方法科学高效,具有广阔的应用前景。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种硼烯纳米疫苗,其特征在于,所述硼烯纳米疫苗包括:硼烯纳米片、肿瘤自身抗原和免疫佐剂;
所述硼烯纳米疫苗通过多巴胺介导的方式在所述硼烯纳米片的表面制备肿瘤自身抗原涂层,再负载所述免疫佐剂制备得到。
2.根据权利要求1所述的硼烯纳米疫苗,其特征在于,所述肿瘤自身抗原包括肿瘤细胞裂解液;
优选地,所述免疫佐剂包括受体激动剂;
优选地,所述受体激动剂包括Toll样受体激动剂R848。
3.一种权利要求1或2所述的硼烯纳米疫苗的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
制备肿瘤自身抗原,制备硼烯纳米片,在多巴胺介导下,使用所述肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片,再负载免疫佐剂,得到所述硼烯纳米疫苗。
4.根据权利要求3所述的硼烯纳米疫苗的制备方法,其特征在于,所述制备肿瘤自身抗原的方法包括:
制备肿瘤细胞单细胞悬液,离心后收集,分散,液氮冷冻后裂解,离心去除肿瘤碎片后,收集上清液,得到所述肿瘤自身抗原;
优选地,所述液氮冷冻的时间为55~70min;
优选地,所述裂解的次数为4~6次,所述裂解持续的时间为25~35min;
优选地,所述离心的转速为7500~8500rpm,所述离心的时间为4~8min;
优选地,所述制备肿瘤自身抗原还包括测定肿瘤抗原含量的步骤。
5.根据权利要求3或4所述的硼烯纳米疫苗的制备方法,其特征在于,所述制备硼烯纳米片的方法包括:
将硼粉分散在异丙醇中,超声,离心去除块状硼,收集悬浮液再次离心,沉淀使用异丙醇洗涤,得到所述硼烯纳米片;
优选地,所述超声的功率为400~550w,所述超声的时间为8~12h;
优选地,所述离心的转速为2500~3000rpm,所述离心的时间为15~30min;
优选地,所述再次离心的转速为11000~13000rpm,所述再次离心的时间为20~40min;
优选地,所述洗涤的次数为2~5次。
6.根据权利要求3~5任一项所述的硼烯纳米疫苗的制备方法,其特征在于,所述肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片的方法包括:
制备多巴胺和硼烯纳米片的悬浮液,再与碱性氧化剂溶液混合,再与肿瘤自身抗原混合,纯化后得到肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片;
优选地,所述制备多巴胺和硼烯纳米片的悬浮液使用的液体包括水和/或乙醇溶液;
优选地,所述碱性氧化剂包括高锰酸钾、高碘酸钠或氢氧化钠中的任意一种;
优选地,所述与碱性氧化剂溶液混合的方式为搅拌,所述搅拌的时间为10~20min;
优选地,所述与肿瘤自身抗原混合的方式为避光搅拌,所述避光搅拌的时间为1.5~2.5h;
优选地,所述纯化的方式包括透析,所述透析使用的透析袋的截留分子量为8~14kDa;
优选地,所述透析后还包括冷冻干燥的步骤;
优选地,所述肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片中还包括测定肿瘤抗原包被量的步骤。
7.根据权利要求3~6任一项所述的硼烯纳米疫苗的制备方法,其特征在于,所述负载免疫佐剂的方法包括:
将含有免疫佐剂的甲醇溶液加入所述肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片的悬浮液中,搅拌,离心取上清液;
优选地,所述搅拌的时间为10~14h;
优选地,所述负载免疫佐剂还包括计算免疫佐剂装载率的步骤。
8.根据权利要求3~7任一项所述的硼烯纳米疫苗的制备方法,其特征在于,所述硼烯纳米疫苗的制备方法包括如下步骤:
(1)制备肿瘤自身抗原:
制备肿瘤细胞单细胞悬液,离心后收集,分散,液氮冷冻55~70min后,裂解4~6次,持续25~35min,7500~8500rpm离心4~8min去除肿瘤碎片后,收集上清液,测定肿瘤抗原含量,得到所述肿瘤自身抗原;
(2)制备硼烯纳米片:
将硼粉分散在异丙醇中,400~550w超声8~12h,2500~3000rpm离心15~30min去除块状硼,收集悬浮液,11000~13000rpm再次离心20~40min,沉淀使用异丙醇洗涤2~5次,得到所述硼烯纳米片;
(3)肿瘤自身抗原包覆硼烯纳米片:
使用水和/或乙醇溶液制备多巴胺和硼烯纳米片的悬浮液,再与碱性氧化剂溶液混合,搅拌10~20min,再与肿瘤自身抗原混合,避光搅拌1.5~2.5h,使用截留分子量为8~14kDa的透析袋进行透析,冷冻干燥后得到肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片,并测定肿瘤抗原包被量;
(4)负载免疫佐剂:
将含有免疫佐剂的甲醇溶液加入所述肿瘤自身抗原包覆的硼烯纳米片的悬浮中,搅拌10~14h,离心取上清液,并计算免疫佐剂装载率,得到所述硼烯纳米疫苗。
9.权利要求1或2所述的硼烯纳米疫苗和/或权利要求3~8任一项所述的硼烯纳米疫苗的制备方法在制备肿瘤治疗药物中的应用。
10.一种肿瘤治疗药物,其特征在于,所述肿瘤治疗药物包括权利要求1或2所述的硼烯纳米疫苗;
优选地,所述肿瘤治疗药物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的任意一种或至少两种的组合。
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