CN114887113B - 一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法及应用 - Google Patents

一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法及应用，其制备方法包括以下步骤：通过一步无模板溶剂热法制备出纳米级二氧化铈颗粒；收集抗凝新鲜全血经离心、洗涤、分离血小板，血小板经反复冻融提取出血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡；将上述纳米级二氧化铈和纳米级血小板膜囊泡混合，经磁珠涡旋、抽提、离心、干燥，获得血小板膜包被二氧化铈颗粒；取GelMa冻干粉溶于水中，并加入光引发剂，制成预凝胶溶液，将预凝胶溶液与血小板膜包被二氧化铈颗粒混合，在紫外光照射下，获得负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶。本发明通过构建一种凝胶装载仿生物膜伪装纳米颗粒系统，促进糖尿病创面愈合。

Description

一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及糖尿病创面治疗凝胶领域，具体涉及一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法及应用。
背景技术
目前，全球有6.4％的人口患糖尿病，这一比例持续增长，2030年预计将接近至7.5-8％，糖尿病创面愈合不良是糖尿病患者最常见的并发症，约有25％的人在其病程中会患上糖尿病性伤口溃疡。其中25％的糖尿病足溃疡患者需要进行截肢手术治疗。手术后，患对侧溃疡的患者比例达50％，5年死亡率约为50％。
糖尿病引起的慢性创面不愈合是一个复杂的病理过程。它们主要由新生血管生成缺陷、过度炎症引起。糖尿病血管生成缺陷严重限制了创面组织所需的氧气和营养物质，同时高糖伤口环境改变线粒体电子链的功能,使胞内超氧自由基的生成增多，活性氧生成显著增加，ROS的过度累计会损伤组织内源性干细胞、对蛋白质、脂质和核酸产生不可逆的修饰作用，从而极大地损害了细胞的再生潜力。根据以上病理特征需设计合适的药物敷料糖尿病伤口。
目前富血小板血浆广泛用于治疗慢性创面。在实际应用，为局部伤口提供液体治疗是具有挑战性的，因为液体不易留在伤口。解决这一问题的一种方法是使用水凝胶递药系统，它可以输送有益地生长因子或细胞的同时保持湿润的伤口环境。传统制备富血小板凝胶(简称：PRP凝胶；英文名：PRP Gel)的方法是通过活化凝血酶。然而，凝血酶可以完全破坏血小板，导致生长因子的爆发性释放，该特性可能导致创面修复初期组织增生。并且爆发的生长因子难以在目的区域形成最佳的有效浓度并持续发挥作用。降低富血小板血浆的长期治疗效果。
发明内容
鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法及应用，本申请通过构建一种凝胶装载仿生物膜伪装纳米颗粒系统，通过使用甲基丙烯酸酐化明胶(Gelatin Methacryloyl，GelMa)，其较一般凝胶具有良好的生物学特性和可调的物理特性，具有支持伤口微环境的功能；血小板膜诱饵吸引患者自身血小板，并激活血小板多种功能，修复糖尿病创面血管生成受损。纳米级二氧化铈颗粒具有高效清除ROS的活性，不仅可以对有害的氧化损伤微环境进行改造，还可以保护自身血小板不受ROS诱导的损伤。本发明通过GelMa装载血小板膜包封纳米级二氧化铈颗粒促进糖尿病创面愈合。
为了达到上述目的，本发明提供一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一：通过一步无模板溶剂热法制备出纳米级二氧化铈颗粒；
步骤二：收集抗凝新鲜全血经离心、洗涤、分离血小板，血小板经反复冻融提取出血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡；
步骤三：将步骤一制备的纳米级二氧化铈和步骤二提取出的纳米级血小板膜囊泡混合，经磁珠涡旋、抽提、离心、干燥，获得血小板膜包被二氧化铈颗粒；
步骤四：取GelMa冻干粉溶于水中，并加入光引发剂，制成预凝胶溶液，将预凝胶溶液与血小板膜包被二氧化铈颗粒混合，在紫外光照射下，获得负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶。
依照本发明的一个方面，所述步骤三中的纳米级二氧化铈与血小板膜囊泡混合具体为将纳米级二氧化铈、纳米级血小板膜囊泡分别加PBS溶液，经溶解、水浴超声后，再将两者混合。
依照本发明的一个方面，所述步骤一具体为：将六水合硝酸铈和聚乙烯吡咯烷酮溶解在溶剂中，经磁力搅拌后将其转移至高压反应釜180℃反应24h，冷却至室温，通过离心收集产物，随后使用无水乙醇和去离子水分别交替洗涤产物再进行干燥，制得纳米级二氧化铈颗粒。
依照本发明的一个方面，所述步骤二中的血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡的具体过程为：血小板膜重悬于磷酸盐缓冲盐水中，再经超声处理后通过400nm的针式过滤器反复抽提，制得纳米级血小板膜囊泡。
依照本发明的一个方面，所述步骤四制得的预凝胶溶液在与血小板膜包被二氧化铈颗粒混合前，黑暗中保存。
依照本发明的一个方面，所述溶剂为乙二醇、无水乙醇和去离子水的组合。
依照本发明的一个方面，所述步骤二中的血小板经反复冻融提取出血小板膜的具体过程为：-80℃冰箱保存30min后，在37℃水浴锅保存10min，反复3次，再进行超声处理，即提取出血小板膜。
依照本发明的一个方面，所述步骤三的抽提具体为通过200nm针式过滤器反复抽提。
基于同一发明构思，本发明还提供了上述任一所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法制备得到的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶在治疗糖尿病创面中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本申请的纳米级二氧化铈颗粒合成简单、具有良好的生物相容性、优异的多重抗氧化酶模拟活性和更强的催化性能；
(2)本申请采用血小板膜囊泡，血小板膜表面，富含多种特异性膜蛋白，当血小板膜附着于受损血管上，聚集更多的血小板，激活的血小板释放其生长因子，加速血管新生；本申请制得的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶中的纳米级二氧化铈是多重抗氧化的纳米酶，它对糖尿病伤口环境中的氧自由基具有较好的清除效果，并且它不会瞬时释放，使治疗效应降低，在GelMa凝胶多孔隙结构中以及血小板膜包被下其释放速度减慢，起到缓释效果，本申请的纳米级二氧化铈颗粒具有高效清除ROS的活性，不仅可以对有害的氧化损伤微环境进行改造，还可以保护自身血小板不受ROS诱导的损伤；
(3)本申请使用甲基丙烯酸酐化明胶(Gelatin Methacryloyl，GelMa)，其较一般凝胶具有良好的生物学特性和可调的物理特性，具有支持伤口微环境的功能；
(4)本申请制得的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶中的血小板膜能诱饵吸引患者自身血小板，并激活血小板多种功能，修复糖尿病创面血管生成受损；
(5)本申请的制得的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶将上述三者结合，三者相互协作制成对糖尿病伤口中的血管生成缺陷和过度氧化应激的病理环境起到治疗作用，其生物相容性好，在糖尿病模型创面微环境中组织的氧化应激水平高，抗炎效果良好，治疗14天后愈合率为97.2±1.4％。
附图说明
图1为本发明制备方法的制备流程示意图；
图2为实施例1、对比例1、实施例2、实施例3和空白对照组凝胶化前后对照图；
图3为实施例1中的CNPs、Pltm和Pltm@CNPs的粒径尺寸图；
图4为实施例1中的CNPs的透射电镜图(图4a)、实施例1中的Pltm的透射电镜图(图4b)、实施例1中的Pltm@CNPs的透射电镜图(图4c)；
图5为对比例1中的Gel的扫描电镜图(图5a)、实施例1中的Pltm@CNPs/Gel的扫描电镜图(图5b)；
图6为对比例1、对比例2、对比例3、实施例1处理Hacat细胞24h(左)、48h(右)后的活性柱状图；
图7为Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面的ROS荧光强度柱状图(图7A)；Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面的8-OHdG阳性细胞率的柱状图(图7B)；Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面的4-HNE阳性细胞率的柱状图(图7C)；
图8为正常大鼠与糖尿病大鼠创面比较ROS、8-OHdG、4-HNE水平对比图；
图9为Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面的H&E染色后的创面组织图(图9A)；Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面的免疫因子TNF-α表达水平的创面组织图(图9B)；Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面的免疫因子IL-6表达水平的创面组织图(图9C)；Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面的免疫因子IL-16表达水平的创面组织图(图9D)；
图10为Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面后第0、3、7、14天拍摄伤口愈合情况并检查伤口愈合程度图(图10A)；Control、对比例1、对比例2、对比例3和实施例1的凝胶用于糖尿病创面后伤口愈合率的柱状图(图10B)。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，下文所用专业术语和本领域专业技术人员所理解的含义一致；除非特殊说明，本文所涉及的原料、试剂均可从市场购买，或通过公知的方法制得。
本申请的GelMa的英文全称是Gelatin Methacryloyl，中文名称为甲基丙烯酸酐化明胶；本申请的光引发剂优选为Irgacure 2959，本申请的实施例1-3和对比例1-3均为上述光引发剂。
本发明提供一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其制备流程图如图1所示，具体包括以下步骤：
步骤一：通过一步无模板溶剂热法制备出纳米级二氧化铈颗粒；
步骤二：收集抗凝新鲜全血经离心、洗涤、分离血小板，血小板经反复冻融提取出血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡；
步骤三：将步骤一制备的纳米级二氧化铈和步骤二提取出的纳米级血小板膜囊泡混合，经磁珠涡旋、抽提、离心、干燥，获得血小板膜包被二氧化铈颗粒；
步骤四：取GelMa冻干粉溶于水中，并加入光引发剂，制成预凝胶溶液，将预凝胶溶液与血小板膜包被二氧化铈颗粒混合，在紫外光照射下，获得负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶。
优选的，所述步骤三中的纳米级二氧化铈与血小板膜囊泡混合具体为将纳米级二氧化铈、纳米级血小板膜囊泡分别加PBS溶液溶解、水浴超声，再将两者混合。
优选的，所述步骤一具体为：将六水合硝酸铈和聚乙烯吡咯烷酮溶解在溶剂中，经磁力搅拌后将其转移至高压反应釜180℃反应24h，冷却至室温，通过离心收集产物，随后使用无水乙醇和去离子水分别交替洗涤产物再进行干燥，制得纳米级二氧化铈颗粒。
优选的，所述步骤二中的血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡的具体过程为：血小板膜重悬于磷酸盐缓冲盐水中，再经超声处理后通过400nm的针式过滤器反复抽提，制得纳米级血小板膜囊泡。
优选的，所述步骤四制得的预凝胶溶液在与血小板膜包被二氧化铈颗粒混合前，黑暗中保存。
优选的，所述溶剂为乙二醇、无水乙醇和去离子水的组合。
优选的，所述步骤二中的血小板经反复冻融提取出血小板膜的具体过程为：-80℃冰箱保存30min后，在37℃水浴锅保存10min，反复3次，再进行超声处理，即提取出血小板膜。
实施例1
步骤一：制备纳米级二氧化铈颗粒(CNPs)
通过一步无模板溶剂热法制备二氧化铈。将1.0g六水合硝酸铈和0.10g聚乙烯吡咯烷酮溶解在20ml乙二醇，40ml无水乙醇和20ml去离子水的混合物中，磁力搅拌3h，将混合物转移至高压反应釜，加热至180℃，24h。冷却至室温，通过离心(1000rpm/min，10min)收集产物，随后使用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次，在70℃下干燥过夜，制得纳米级二氧化铈颗粒(CNPs)，待用。
步骤二：制备纳米级血小板膜囊泡(Pltm)
取健康人抗凝新鲜全血，将富血浆血小板的抗凝新鲜全血在1000rpm/min下离心5min，弃上清，获得血小板；通过反复冻融方法提取血小板膜，即-80℃冰箱保存30min，37℃水浴锅保存10min。反复3次。随后超声处理(10min,350W)。将超声后的血小板膜通过400nm的针式过滤器反复抽提制备得到血小板膜囊泡(Pltm)，使用真空冷冻干燥机将Pltm冻干，待用。
步骤三：制备血小板膜包被二氧化铈(Pltm@CNPs)体系
取0.01g Pltm加1ml PBS溶液溶解，取0.01g CNPs加1ml PBS溶液溶解，将溶解后的Pltm和CNPs溶液分别水浴超声10min，再将两者混合，磁珠涡旋搅拌混合30min，再通过200nm针式过滤器反复抽提后，通过离心(5000rpm/min，10min，4℃)弃去上清液即多余的血小板膜囊泡，建立Pltm@CNPs体系。使用真空冷冻干燥机将Pltm@CNPs冻干，待用。
步骤四：制备负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶体系(PLTm@CNPs/Gel)
取1g GelMa冻干粉在37℃下溶于19ml去离子水中，加入0.1g PI光引发剂，制得预凝胶溶液，在黑暗中保存。取1ml预凝胶溶液与步骤三中的0.01g Pltm@CNPs混合，在紫外光(254nm，400mw/m2)照射下20min后制得负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶体系(1％w/wPLTm@CNPs/Gel)。
实施例2
步骤一、步骤二、步骤三同实施例1；
步骤四：制备负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶体系(PLTm@CNPs/Gel)
取1g GelMa冻干粉在37℃下溶于19ml去离子水中，加入0.1g PI光引发剂，制得预凝胶溶液，在黑暗中保存。取1ml预凝胶溶液与步骤三中的0.005g Pltm@CNPs混合，在紫外光(254nm，400mw/m2)照射下20min后制得负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶体系(0.5％w/wPLTm@CNPs/Gel)，如图2所示0.5％w/w PLTm@CNPs/Gel水凝胶在紫外线照射后形成。
实施例3
步骤一、步骤二、步骤三同实施例1；
步骤四：制备负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶体系(PLTm@CNPs/Gel)
取1g GelMa冻干粉在37℃下溶于19ml去离子水中，加入0.1g PI光引发剂，制得预凝胶溶液，在黑暗中保存。取1ml预凝胶溶液与步骤三中的0.02g Pltm@CNPs混合，在紫外光(254nm，400mw/m2)照射下20min后制得负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶体系(2％w/wPLTm@CNPs/Gel)，如图2所示2％w/w PLTm@CNPs/Gel水凝胶在紫外线照射后形成。
对比例1
取1g GelMa冻干粉在37℃下溶于19ml去离子水中，加入0.1g PI光引发剂，制得预凝胶溶液，在紫外光(254nm，400mw/m2)照射下20min后制得水凝胶体系(Gelma)
对比例2
步骤一：制备纳米级血小板膜囊泡(Pltm)
取健康人抗凝新鲜全血，将富血浆血小板的抗凝新鲜全血在1000rpm/min下离心5min，弃上清，获得血小板；通过反复冻融方法提取血小板膜，即-80℃冰箱保存30min，37℃水浴锅保存10min。反复3次。随后超声处理(10min,350W)。将超声后的血小板膜通过400nm的针式过滤器反复抽提制备得到血小板膜囊泡(Pltm)，使用真空冷冻干燥机将Pltm冻干，待用。
步骤二：取1g GelMa冻干粉在37℃下溶于19ml去离子水中，加入0.1g PI光引发剂，制得预凝胶溶液，将1ml预凝胶溶液与0.01g Pltm混合，在紫外光(254nm，400mw/m2)照射下20min后制得水凝胶体系(1％w/w PLTm/Gel)。
对比例3
步骤一：制备纳米级二氧化铈颗粒(CNPs)
通过一步无模板溶剂热法制备二氧化铈。将1.0g六水合硝酸铈和0.10g聚乙烯吡咯烷酮溶解在20ml乙二醇，40ml无水乙醇和20ml去离子水的混合物中，磁力搅拌3h，将混合物转移至高压反应釜，加热至180℃，24h。冷却至室温，通过离心(1000rpm/min，10min)收集产物，随后使用无水乙醇和去离子水分别洗涤3次，在70℃下干燥过夜，制得纳米级二氧化铈颗粒(CNPs)，待用。
步骤二：取1g GelMa冻干粉在37℃下溶于19ml去离子水中，加入0.1g PI光引发剂，制得预凝胶溶液，将1ml预凝胶溶液与0.01g CNPs混合，在紫外光(254nm，400mw/m2)照射下20min后制得水凝胶体系(1％w/w CNPs/Gel)。
性能检测
(1)表观检测
如图2所示，图2左侧为实施例1凝胶化前的图，图2右侧分别为实施例1、对比例1、实施例2和实施例3凝胶化后的图，由图2可知，在紫外光照20min后实施例1、对比例1、实施例2、实施例3均固化为凝胶。
(2)尺寸检测
对实施例1中的纳米级血小板膜囊泡(Pltm)、纳米级二氧化铈颗粒(CNPs)、血小板膜包被二氧化铈(Pltm@CNPs)进行粒径检测，其结果如图3所示：Pltm粒径186.4±10.2nm；CNP粒径74.6±4.5nm；Pltm@CNPs粒径175.2±6.9nm。
(3)微观检测
对实施例1中的纳米级血小板膜囊泡(Pltm)、纳米级二氧化铈颗粒(CNPs)、血小板膜包被二氧化铈(Pltm@CNPs)进行透射电镜检测，其表观形貌如图4所示，图4中的a、b、c分别为Pltm、CNPs和Pltm@CNPs的透射电镜图，由图4可知，CNPs为球状结构，PLTm@CNPs直径略大于CNPs，且可见有囊泡状结构覆盖。对实施例1进行扫描电镜检测，其如图5所示，图5中的a、b为对比例1和实施例1的扫描电镜图，由图5可知，两者表现出良好的三维孔隙结构，具有内在的连通性。
(4)生物相容性检测
将对比例1、对比例2、对比例3、实施例1进行Hacat细胞的杀伤作用检测。将Hacat细胞置于96孔板中培养24h，随后将上述细胞在对比例1、对比例2、对比例3、实施例1中孵育24小时，按照检测说明书，每孔加入10ul MTT溶液，放入培养箱中继续孵育4h，随后终止培养，小心吸取上清液，每孔加入100ul DMSO溶液，振荡10min，使甲臜结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD 490nm处检测每孔的吸光值。如图6所示，在对比例1、对比例2、对比例3、实施例1处理细胞24h、48h后，细胞均保持90％以上的活力。
(5)抗氧化作用检测
制备糖尿病伤口大鼠模型。为制作创面，使用戊巴比妥麻醉GK大鼠，去除皮肤上的毛发，出现清晰的手术视野。使用15mm切口器，手术剪进行全层皮肤的切除。大鼠随机分为5组，进行1)空白对照(Control)，2)对比例1，3)对比例2，4)对比例3，5)实施例1治疗。在第14天处死大鼠，取创面皮肤组织，每组一部分组织置于液氮中保存。从液氮中取出冰冻的上皮组织，使用刀片切离组织为1×1cm2薄片。按照标准方案进行ROS探针染色，放入37℃培养箱培养20min，吸取染色液，加入清理液清洗。将组织薄片置于载玻片上，压片，即刻在荧光显微镜下观察并采集图像。ROS探针在组织中活性氧存在的条件下，会氧化生成红色荧光物质，红色荧光强度与组织内活性氧水平成正比。其结果如图7所示，如图7A所示，Control组、对比例1和对比例2组的ROS荧光强度显著高于含有CNPs的对比例3组和实施例1组。
对上皮组织中的过氧化标记物进行检测，将石蜡包埋的上皮组织去石蜡化、抗原修复后，按照标准方案，进行抗8-OHdG，抗4-HNE免疫荧光染色，DAPI对细胞核进行复染，在荧光显微镜下观察并采集图像，使用ImageJ软件对染色标记的荧光强度进行定量。如图7B和图7C所示，实施例1组中的8-OHdG阳性细胞率为4.6±1.4％，4-HNE阳性细胞率为3.3±1.2％，其值显著低于空白对照(Control—PBS组)(8-OHdG阳性细胞率38.48±7.0％和4-HNE阳性细胞率38.10±5.7％)和对比例1组(8-OHdG阳性细胞率30.12±5.3％和4-HNE阳性细胞率35.42±4.1％)
正常大鼠与糖尿病大鼠创面比较ROS、8-OHdG、4-HNE水平。如图8所示，GK大鼠创面组织中ROS、8-OHdG和4-HNE含量显著增加，由此证实在糖尿病模型创面微环境中组织的氧化应激水平增高。
(6)抗炎作用检测
将石蜡包埋的创面上皮组织切片，按照标准流程进行H&E染色，在光镜下观察并采集图片。如图9A所示，红色箭头表示炎症细胞，发现Control组和对比例1组皮肤组织存在较多炎症细胞(包括巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞)，在对比例2组和对比例3组中炎症细胞较对比例1组减少，而治疗组实施例1组与其他组相比炎症细胞显著减少。同时采用免疫组化法检测免疫因子(TNF-α、IL-16、IL-6)表达水平。如图9B和图9C所示，在实施例1组中棕黄色颗粒(免疫因子)显著少于其他四组。
(7)促进糖尿病伤口愈合作用
制备伤口模型后，分别于伤后第0、3、7、14天拍摄伤口愈合情况并检查伤口愈合程度。如图10A所示，肉眼观察，实施例1组创面呈现光滑的浅粉色外观，而其他组的伤口表现出溃疡状的红色和黄色表面。经实施例1治疗的伤口组织比其他组表现出更快的愈合速度，较早形成创面瘢痕，创面显著缩小，治疗14天后创面愈合附近皮肤的毛发接近正常毛发，皮肤弹性接近正常。如图10B我们计算各创面愈合面积，发现在治疗14天后实施例1组愈合率为97.2±1.4％，而其他组愈合率在90％以下，其中Control组和对比例1组愈合较差，分别为60.74±8.2％、68.25±5.1％。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤一：通过一步无模板溶剂热法制备出纳米级二氧化铈颗粒；
步骤二：收集抗凝新鲜全血经离心、洗涤、分离血小板，血小板经反复冻融提取出血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡；
步骤三：将步骤一制备的纳米级二氧化铈和步骤二提取出的纳米级血小板膜囊泡混合，经磁珠涡旋、抽提、离心、干燥，获得血小板膜包被二氧化铈颗粒；
步骤四：取GelMa冻干粉溶于水中，并加入光引发剂，制成预凝胶溶液，将预凝胶溶液与血小板膜包被二氧化铈颗粒混合，在紫外光照射下，获得负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶。
2.根据权利要求1所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的纳米级二氧化铈与血小板膜囊泡混合具体为将纳米级二氧化铈、纳米级血小板膜囊泡分别加PBS溶液，经溶解、水浴超声后，再将两者混合。
3.根据权利要求1所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤一具体为：将六水合硝酸铈和聚乙烯吡咯烷酮溶解在溶剂中，经磁力搅拌后将其转移至高压反应釜180℃反应24h，冷却至室温，通过离心收集产物，随后使用无水乙醇和去离子水分别交替洗涤产物再进行干燥，制得纳米级二氧化铈颗粒。
4.根据权利要求1所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的血小板膜并制成纳米级血小板膜囊泡的具体过程为：血小板膜重悬于磷酸盐缓冲盐水中，再经超声处理后通过400nm的针式过滤器反复抽提，制得纳米级血小板膜囊泡。
5.根据权利要求1所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤四制得的预凝胶溶液在与血小板膜包被二氧化铈颗粒混合前，黑暗中保存。
6.根据权利要求3所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其特征在于，所述溶剂为乙二醇、无水乙醇和去离子水的组合。
7.根据权利要求1所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的血小板经反复冻融提取出血小板膜的具体过程为：-80℃冰箱保存30min后，在37℃水浴锅保存10min，反复3次，再进行超声处理，即提取出血小板膜。
8.根据权利要求1所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤三的抽提具体为通过200nm针式过滤器反复抽提。
9.根据权利要求1-8任一所述的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶的制备方法制备得到的负载血小板膜包被氧化铈的Gelma凝胶在制备治疗糖尿病创面材料中的应用。
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