CN109913487A - 一种基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物鉴定技术领域，公开了一种基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法，利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建单荧光报告基因系统用于筛选荧光蛋白；荧光报告基因的确定；pEZ15Asp骨架的获取；荧光基因的组装；获得菌株；系统验证；筛选不同强度的启动子；用流式细胞术进行荧光强度的定量分析。本发明方便快捷，能在较短的时间批量化筛选及鉴定不同强度的启动子，并能进行量化分析；可以快速高通量的筛选并定量不同强度的启动子以及其他的生物元件，可以快速扩充运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的生物元件库，用于不同需求的代谢工程改造。

Description

一种基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法

技术领域

本发明属于生物鉴定技术领域，尤其涉及一种基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

传统的启动子筛选方法是通过对基因组的随机剪切，随后通过下游的单一报告基因的表达情况来鉴定得到的序列是否为启动子序列以及其启动强度如何。以往的检测系统大多为单一报告基因系统，但是单一报告基因系统中报告基因的表达会受到来自菌株内部和外部的多种因素的影响，从而会影响该系统对启动子的鉴定。此外，通过以往的方法获取待测启动子的速度慢，且无法快速高通量的进行强度鉴定，不利于启动子的高效定量研究。随着各项技术的发展，虽然又有一些新的方法被开发，比如电泳迁移率分析、原子力显微镜等体外检测技术，但是都因为准确度不高而没有被广泛使用。

随着高通量测序技术的快速发展，大量的物种基因组得以测序并给予注释，同时，伴随着大量的系统生物学分析的相继开展并积累了海量的系统生物学数据，这些数据中含有大量的信息有待挖掘，比如各种不同的生物元件，其中启动子就可以通过多组学数据分析来进行筛选。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中，单一报告基因系统中报告基因的表达会受到来自菌株内部和外部的多种因素的影响，从而会影响该系统对启动子的鉴定。

(2)现有技术中，获取待测启动子的周期长、实验复杂，无法快速高通量的进行强度鉴定，不利于启动子的高效定量研究。

(3)另外现有技术中，体外检测技术因为准确度不高而没有广泛使用。

解决上述技术问题的难度：

需要建立一种快速筛选待测启动子的分析方法，需要系统生物学数据收集分析与生物信息学数据分析技术。

需要建立一套在体内准确定量的启动子强度的分析系统。

需要建立一种快速高通量的鉴定分析方法。

解决上述技术问题的意义：

上述问题的解决，可以提供一种高效、快速、高通量的启动子及其它物元件体内定量的分析方法，扩大运动发酵单胞菌的启动子及其它生物元件的元件库，也可以应用于其它微生物体系，为代谢工程和合成生物学提供多样的生物功能及调控元件。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法。

本发明是这样实现的，一种基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法，具体包括以下步骤：

步骤一：利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建单荧光报告基因系统用于筛选荧光蛋白。

步骤二：荧光报告基因的确定：根据不同荧光基因蛋白在运动发酵单胞菌中的表达结果，筛选到合适的荧光报告基因后，同样利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建双荧光报告基因系统。

步骤三：pEZ15Asp骨架的获取：以已获得的pEZ15Asp为模板，分别以引物1和引物2、进行PCR扩增得到。

步骤四：荧光基因的组装：利用Gibson装配，将Ptet-EGFP和 PlacUV5-opmCherry与骨架连接，并在两荧光报告基因中间加入一个终止子，得到双荧光报告基因系统。

步骤五：菌株获得：得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌中，通过PCR及测序确定最终菌株。

步骤六：系统验证：得到含有可诱导的双荧光报告基因系统的菌株后，利用0,0.2,0.4,0.6,0.8,or 1.0μg/mL的不同浓度的四环素进行诱导培养，并利用流式细胞术(FCM)、荧光定量PCR(qPCR)、Western Blot在不同层面进行验证。

步骤七：根据不同的组学数据筛选不同强度的启动子。

步骤八：用筛选出来的启动子替换双荧光报告基因中的Ptet诱导启动子，并用流式细胞术进行荧光强度的定量分析。

进一步，步骤一中，荧光蛋白，包括EGFP,mCherry,RFP，CFP，和密码子优化的EGFP(opEGFP),mCherry(opmCherry)和CFP(opCFP)，都由启动子 PlacUV5启动。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法构建对运动发酵单胞菌系统生物学挖掘利用的生物元件库。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明以运动发酵单胞菌为模式菌株，建立了利用系统生物学数据预测筛选不同强度的启动子序列的方法，该预测筛选方法高效快捷，可作为实验的指导基础。同时，本发明开发了一种基于流式细胞术分析的双荧光报告基因系统，用于定量分析启动子及其他生物元件的强度。该方法相较于现有的启动子筛选鉴定方法，可以快速高通量的筛选并定量不同强度的启动子以及其他的生物元件，并且启动子的定量分析在细胞体内完成，受细胞内、外部环境变化的影响小，定量准确，可以快速扩充运动发酵单胞菌的生物元件库，用于不同需求的代谢工程改造。

此外，本发明中基于组学数据预测的不同启动子强度与实验数据之间的相关性较高，说明本发明提出的基于系统生物学数据筛选启动子的方法，可以用于不同需求启动子及其他生物元件的预测筛选。

另外，本方法开发的双荧光报告基因系统可用于定量分析其他的生物元件，也可以利用到除运动发酵单胞菌以外的其他物种中使用。本发明所拥有的优势如表1所示。

本发明的建立可以达到对运动发酵单胞菌及不同微生物体系系统生物学的充分挖掘利用及扩大其生物元件库，用于代谢工程及合成生物学实践。本方法简单易于操作，适用生物元件范围广，且可推广到其它物种。

表1.本发明与现有技术的优劣势比较。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的单荧光报告基因系统和筛选荧光蛋白结果示意图。

图3是本发明实施例提供的双荧光报告基因系统示意图。

图4是本发明实施例提供的韦恩(Venn)分析筛选不同强度的启动子示意图

图5是本发明实施例提供的流式细胞仪模式和数据相关性示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术中，单一报告基因系统中报告基因的表达会受到来自菌株内部和外部的多种因素的影响，从而会影响该系统对启动子的鉴定。

为了解决现有的技术问题，下面结合具体方案对本发明的应用原理作详细说明。

本发明实施例提供的基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法包括：筛选可以在运动发酵单胞菌中表达的荧光蛋白，确定可用的荧光蛋白对后，再构建可诱导的双荧光报告基因系统模拟对不同启动子的鉴定，最后用双荧光报告基因系统鉴定不同的启动子。

如图1所示，本发明实施例提供的基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法具体包括以下步骤：

S101：利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建单荧光报告基因系统用于筛选荧光蛋白。

S102：荧光报告基因的确定：根据不同荧光基因蛋白在运动发酵单胞菌中的表达结果，筛选到合适的荧光报告基因后，同样利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建双荧光报告基因系统。

S103：pEZ15Asp骨架的获取：以已获得的pEZ15Asp为模板，分别以引物 1和引物2、进行PCR扩增得到。

S104：荧光基因的组装：利用Gibson装配，将Ptet-EGFP和 PlacUV5-opmCherry与骨架连接，并在两荧光报告基因中间加入一个终止子，得到双荧光报告基因系统。

S105：菌株获得：得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌中，通过PCR及测序确定最终菌株。

S106：系统验证：得到含有可诱导的双荧光报告基因系统的菌株后，利用浓度为0,0.2,0.4,0.6,0.8,or 1.0μg/mL的四环素进行诱导培养，并利用流式细胞术(FCM)、荧光定量PCR(qPCR)、Western Blot在不同层面进行验证。

S107：根据不同的组学数据筛选不同强度的启动子。

S108：用筛选出来的启动子替换双荧光报告基因中的Ptet诱导启动子，并用流式细胞术进行荧光强度的定量分析。

步骤S101中，本发明实施例提供的荧光蛋白，包括EGFP,mCherry,RFP， CFP，和密码子优化的EGFP(opEGFP),mCherry(opmCherry)和CFP(opCFP)，荧光蛋白都由启动子PlacUV5启动。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理进行进一步说明；

实施例1；

(1)利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建单荧光报告基因系统用于筛选荧光蛋白(图2A)，包括EGFP,mCherry,RFP，CFP，和密码子优化的EGFP(opEGFP), mCherry(opmCherry)和CFP(opCFP)，荧光蛋白都由启动子PlacUV5启动。

(2)荧光报告基因的确定：根据不同荧光基因蛋白在运动发酵单胞菌中的表达结果(图2B)，筛选到合适的荧光报告基因(EGFP和opmCherry)后，同样利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建双荧光报告基因系统。

如图2所示，本发明实施例提供的单荧光报告基因系统和筛选荧光蛋白结果示意图。

(A)单荧光报告基因系统示意图；(B)荧光蛋白筛选结果。

(3)pEZ15Asp骨架的获取：以pEZ15Asp为模板，分别以引物1和引物2、进行PCR扩增得到。按照PCR回收试剂盒对PCR产物回收纯化。

引物1：5’-GCGCTAGCGGAGTGTATACTGGCTTACTATGTT-3’SEQ ID NO：8。

引物2：5’-ACGGTGAGCTGGTGACCTGCCTTATC-3’SEQ ID NO：9。

(4)荧光基因的组装：利用Gibson装配，将Ptet-EGFP和PlacUV5-opmCherry 与骨架连接，并在两荧光报告基因中间加入一个终止子，得到双荧光报告基因系统，如图3所示。

如图3所示，本发明实施例提供的双荧光报告基因系统示意图。

(5)菌株获得：得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌中，通过PCR及测序确定最终菌株。

(6)系统验证：得到含有可诱导的双荧光报告基因系统的菌株后，利用浓度为0,0.2,0.4,0.6,0.8,or 1.0μg/mL的浓度的四环素进行诱导培养，并利用流式细胞术(FCM)、荧光定量PCR(qPCR)、Western Blot在不同层面进行验证。取样时间均为对数期。

(7)根据不同的组学数据筛选不同强度的启动子。

(8)用筛选出来的启动子替换双荧光报告基因中的诱导型启动子Ptet，并用流式细胞术进行荧光强度的定量分析。

实施例2；

(1)首先根据不同的组学数据筛选出下游表达强的基因，并进行韦恩(Venn)分析，筛选出各组学数据共有基因。在不同的组学数据中，根据每个基因在所有条件下的平均值进行排序，本发明定义排在90％以上的为强启动子，排在40-60％的为中等强度启动子，排在10％以下的为弱启动子。本发明筛选到19个强启动子，9个中等强度启动子，10个弱启动子。

如图4所示，本发明实施例提供的Venn分析筛选不同强度的启动子示意图。

(2)对目的基因的启动子(以Pgap为例)进行查找、序列分析及操纵子预测，确定其启动子序列：

Pgap启动子序列:

5’-GTTCGATCAACAACCCGAATCCTATCGTAATGATGTTTTGCCCGA TCAGCCTCAATCGACAATTTTACGCGTTTCGATCGAAGCAGGGACGACAA TTGGCTGGGAACGGTATACTGGAATAAATGGTCTTCGTTATGGTATTGAT GTTTTTGGTGCATCGGCCCCGGCGAATGATCTATATGCTCATTTCGGCTTG ACCGCAGTCGGCATCACGAACAAGGTGTTGGCCGCGATCGCCGGTAAGTC GGCACGTTAAAAAATAGCTATGGAATATAGTAGCTACTTAATAAGTTAGG AGAATAAAC-3’SEQ ID NO：1。

(3)启动子的获取：以ZymomonasmobilisZM4为模板，引物P0177-F, P0177-R进行PCR扩增获得启动子片段，引物5’端的小写字母为与双荧光报告基因系统的同源臂

P0177-F

5’-gcggccgctactagtGTTCGATCAACAACCCGAATC-3’SEQ ID NO：2。

P0177-R

5’-gcccttgctcaccatGTTTATTCTCCTAACTTATTAAGTAGC-3’SEQ ID NO：3。

(4)双荧光报告基因系统骨架的获取：以诱导型的Ptet双荧光报告基因系统为模板，引物Prtt-F,Prtt-R进行PCR扩增获得骨架

Prtt-F5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3’SEQ ID NO：4。

Prtt-R5’-ACTAGTAGCGGCCGCTG-3’SEQ ID NO：5。

(5)获得重组质粒：获得启动子片段和双荧光报告基因系统骨架后，通过 Gibson装配的方法转化大肠杆菌DH5α，PCR验证平板上的阳性克隆，过夜培养后提取其中的质粒。(质粒提取按照质粒提取试剂盒标准步骤)

(6)获取含有特定启动子双荧光报告基因系统质粒的菌株：用提取的质粒对ZM4进行电转化。取ZM4感受态细胞于冰上，待感受态细胞融化后取50μL 加入电转杯中，并在电转杯中加入1μg质粒。电转条件为1600V，25μF，200Ω。电转完毕后于RM液体培养基中于30℃复苏。复苏6-12小时的培养物于6000 rpm，1min离心，除去上清。加入200μL新鲜的RM培养基，取100μL涂布于200μg/mL壮观霉素抗性平板，30℃培养2天。再用引物Pdual-F,Pdual-R进行PCR阳性克隆验证。

Pdual-F CCGCTCACAATTCCACACATTATAC SEQ ID NO：6。

Pdual-R ACCAGGATGGGCACCAC SEQ ID NO：7。

(7)流式细胞术检测：将38个验证正确的单克隆于200μg/mL壮观霉素的RM培养基中进行活化，活化后每个样培养3个平行，培养至对数期后，取样200μL，12000rpm离心1min，去上清，并用1×PBS洗两次后重悬，用设定好的程序进行流式细胞仪检测，为防止小概率及偶然事件，本发明将细胞收集事件设置为20,000。

(8)结果分析：根据流式细胞仪得到的数据，每个样品取所有事件的EGFP 和opmCherry的平均荧光值进行计算，并用EGFP/opmCherry的比值进行标准化处理，以排除来自细胞内部及外部的干扰，结果如下图5。

如图5所示，本发明实施例提供的流式细胞仪模式和数据相关性示意图。

(A)不同强度启动子的流式细胞仪模式图；(B)实验数据与组学数据的相关性。

结果表明，在双荧光报告基因系统中装载不同强度的启动子可以用流式细胞仪进行快速定量分析，EGFP/opmCherry的比值说明所测试的启动子在该系统中的相对强度，并且实验结果与组学数据预测的强度之间的相关性较高，说明本发明中的双荧光报告基因系统可以用于启动子强度的鉴定，同时也说明本发明中的基于组学数据预测启动子强度的方法可以用于筛选不同强度的启动子。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttcgatcaa caacccgaat cctatcgtaa tgatgttttg cccgatcagc ctcaatcgac 60

aattttacgc gtttcgatcg aagcagggac gacaattggc tgggaacggt atactggaat 120

aaatggtctt cgttatggta ttgatgtttt tggtgcatcg gccccggcga atgatctata 180

tgctcatttc ggcttgaccg cagtcggcat cacgaacaag gtgttggccg cgatcgccgg 240

taagtcggca cgttaaaaaa tagctatgga atatagtagc tacttaataa gttaggagaa 300

taaac 305

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggccgcta ctagtgttcg atcaacaacc cgaatc 36

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcccttgctc accatgttta ttctcctaac ttattaagta gc 42

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtgagca agggcgag 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actagtagcg gccgctg 17

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgctcacaa ttccacacat tatac 25

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accaggatgg gcaccac 17

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcgctagcgg agtgtatact ggcttactat gtt 33

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acggtgagct ggtgacctgc cttatc 26

Claims (3)

1.一种基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法，其特征在于，所述的基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法筛选并确定在运动发酵单胞菌中表达的荧光蛋白；构建可诱导的双荧光报告基因系统后对不同启动子进行鉴定；所述基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法具体包括以下步骤：

步骤一，利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建单荧光报告基因系统用于筛选荧光蛋白；

步骤二，荧光报告基因的确定：根据不同荧光蛋白基因在运动发酵单胞菌中的表达结果，筛选到合适的荧光报告基因后，利用pEZ15Asp质粒为骨架，构建双荧光报告基因系统；

步骤三，pEZ15Asp骨架的获取：以获得的pEZ15Asp为模板，分别以引物1和引物2进行PCR扩增得到pEZ15Asp骨架；

步骤四，荧光基因的组装：利用Gibson装配，将Ptet-EGFP和PlacUV5-opmCherry与骨架连接，并在两荧光报告基因中间加入终止子，得到双荧光报告基因系统；

步骤五，菌株获得：得到质粒后，将质粒电转到野生型运动发酵单胞菌中，通过PCR及测序确定最终菌株；

步骤六，系统验证：得到含有可诱导的双荧光报告基因系统的菌株后，利用浓度为0,0.2,0.4,0.6,0.8,or 1.0μg/mL的四环素进行诱导培养，并利用流式细胞术FCM、荧光定量PCR、Western Blot在不同层面进行验证；

步骤七，根据不同的组学数据筛选不同强度的启动子；

步骤八，用筛选出来的启动子替换双荧光报告基因中的Ptet诱导启动子，并用流式细胞术进行荧光强度的定量分析。

2.如权利要求1所述的基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法，其特征在于，所述步骤一中，荧光蛋白包括EGFP,mCherry,RFP，CFP，和密码子优化的EGFP(opEGFP),mCherry(opmCherry)和CFP(opCFP)，荧光蛋白均由启动子PlacUV5启动。

3.一种利用权利要求1～2任意一项所述基于双荧光报告基因系统鉴定生物元件的方法构建的对运动发酵单胞菌系统生物学挖掘利用的生物元件库。