CN109897092B - 一种蓝舌病病毒非结构蛋白ns3的可溶制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种序列优化的蓝舌病病毒非结构蛋白NS3基因、相应表达载体、宿主细胞及其制备方法。本申请对NS3基因进行优化，并构建冷休克原核重组表达载体pCold‑NS3，转化表达型大肠杆菌BL21(DE3)，经诱导表达获得可溶性表达的蓝舌病病毒非结构蛋白NS3。本申请通过优化NS3基因，采用冷休克表达载体，同时采用自诱导表达培养基使NS3基因在低温条件长时间表达，实现蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的大量可溶表达。

Description

一种蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的可溶制备方法

技术领域

本申请涉及分子生物学和生物技术领域，具体地涉及一种优化的蓝舌病病毒非结构蛋白NS3基因及其原核表达载体的构建。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由呼肠孤病毒科、环状病毒属蓝舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)引起，主要是由库蠓传播的反刍动物非接触性病毒性传染病。蓝舌病已被世界动物卫生组织(OIE)认为是影响反刍动物最重要的疾病之一。其中NS3蛋白是BTV的非结构蛋白，其氨基酸序列具有高度保守性，具有群特异性，同时NS3是BTV蛋白中唯一的膜蛋白。目前，对于NS3蛋白结构和功能的研究还并不透彻，有关学者认为NS3蛋白的主要生物学功能可能为协同其他蛋白促进病毒的释放。

NS3蛋白并不稳定，国内外的报道中均提及NS3蛋白的原核表达量低而且易形成包涵体，目前现有技术中广泛采用真核表达系统对NS3进行表达，国内外尚无利用原核表达系统大量表达NS3蛋白的有关报道。考虑到真核表达成本高、技术繁琐，因此寻求NS3的原核可溶性以及大量表达是本领域的普遍需求，基于此，提出本申请。

发明内容

本申请的目的之一是提供了一种优化的NS3蛋白基因，该优化基因解决了目前NS3蛋白基因无法在大肠杆菌系统中表达或者在大肠杆菌系统中不能稳定表达的缺点。

本申请的目的之二是提供了一种优化的NS3蛋白基因表达载体的构建方法，该方法通过优化的基因序列成功构建了重组的表达载体。

本申请的目的之三是提供了一种蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的可溶制备方法，该方法利用构建的重组的表达载体制备大量、高纯度的可溶性NS3蛋白。

为实现上述目的本申请提供的一种优化的NS3蛋白基因，它的核酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本申请通过对NS3蛋白基因进行分析，其表达蛋白不稳定，需要对NS3蛋白基因序列进行优化，提高表达成功率。

本申请还提供了一种重组表达载体pCold-NS3，它含有上述优化的NS3蛋白基因。

在一些实施例中，所述优化的NS3蛋白基因插入表达载体pCold-I的酶切位点BamHI和EcoRI之间。

本申请还提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

本申请还提供了一种上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)对NS3蛋白基因进行分析，得到优化的NS3蛋白基因，其核酸序列如所示；

(2)根据优化的NS3蛋白基因序列，设计出一对特异性引物，在引物的5'端分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点(BamHI和EcoRI)，引物序列分别为

NS3-S:5'CGCGGATCCATGCTGTCTGGTCTGATCCAGCGC T'3

NS3-A:5'CCGGAATTCTCAGGTCAGCGGCATTTCGAAACCAT'3

(3)以优化的NS3蛋白基因序列为模板，进行PCR，获得PCR产物；

(4)用限制性内切酶BamHI和EcoRI对(3)PCR产物和pCold I进行双酶切，切胶回收获得酶切后的NS3基因和线性化的pCold I；

(5)将酶切后的NS3基因和线性化的pCold I，通过T4连接酶16℃条件下连接2小时，并通过热转化方法将连接产物转化至感受态细胞DH5α，通过菌落PCR、双酶切以及测序等方法验证重组表达质粒pCold-NS3。

本发明还提供一种蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的可溶制备方法，利用上述重组表达载体pCold-NS3，或宿主细胞进行重组表达获得。

在一些具体实施方式中，所述制备方法包括以下步骤：

(1)对NS3蛋白基因进行分析，得到优化的NS3蛋白基因，其核酸序列如所示；

(2)根据优化的NS3蛋白基因序列，设计出一对特异性引物，在引物的5'端分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点(BamHI和EcoRI)，引物序列分别为

NS3-S:5'CGCGGATCCATGCTGTCTGGTCTGATCCAGCGC T'3

NS3-A:5'CCGGAATTCTCAGGTCAGCGGCATTTCGAAACCAT'3

(3)以优化的NS3蛋白基因序列为模板，进行PCR，获得PCR产物；

(4)用限制性内切酶BamHI和EcoRI对(3)PCR产物和pCold I进行双酶切，切胶回收获得酶切后的NS3基因和线性化的pCold I；

(5)将酶切后的NS3基因和线性化的pCold I，通过T4连接酶16℃条件下连接2小时，并通过热转化方法将连接产物转化至感受态细胞DH5α，通过菌落PCR、双酶切以及测序等方法验证重组表达质粒pCold-NS3。

(6)将重组表达质粒pCold-NS3转化感受态细胞BL21(DE3)，经筛选验证，获得含重组表达质粒pCold-NS3的表达菌。

在一些具体实施方式中，还包括

(7)将1mL含有重组表达质粒pCold-NS3表达菌接入100mL含氨苄的自诱导表达培养基中，在15℃条件下诱导表达24h；

(8)取诱导表达的菌液，12000rpm离心1min，加入pH7.4PBS缓冲液，超声裂解后12000rpm离心10min，取上清。

(9)将上清加入至亲和层析柱，待柱中液体流尽后，加入4mL的洗液清洗两次。待柱中洗液流尽后，加入1mL的洗脱液，收集流出的液体，即获得纯化后的NS3蛋白。

本申请取得的有益技术效果：

(1)本申请提供了一种采用原核表达系统获得蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的方法，通NS3基因序列的优化，冷休克原核重组表达载体pCold的选用与构建，以及自诱导表达培养等，成功建立了一套适于NS3蛋白可溶性表达的体系。相较于传统NS3蛋白的常规表达方法，本申请具有如下多点优势：

(1)本申请实现NS3的原核可溶性表达，无包涵体形成，可溶性NS3蛋白表达量高；

(2)本申请可以大量获得占总表达蛋白45％以上的NS3蛋白，特异性表达量显著；

(3)本申请可溶性表达获得的NS3蛋白并未因原核表达而降低活性，其具有良好免疫原性；

(4)本申请相比于传统真核表达，分离纯化简单，只需一次亲和层析，不需复杂的变性和复性过程，避免了复性率低的问题，适于推广使用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1、本申请的实验技术流程图；

图2、本申请的重组表达载体pCold-NS3图谱，图中，Amp表示氨苄抗性，BamHI和EcoRI为双酶切位点，优化的NS3基因为目的基因；

图3、本申请优化的NS3基因的PCR扩增结果图，图中，1为DNA Marker，2为PCR扩增获得的优化的NS3基因片段；

图4、本申请的重组表达载体pCold-NS3的菌落PCR和双酶切鉴定结果图，图中1为菌落PCR结果，2为双酶切结果，3为DNA Marker；

图5、本申请诱导表达可溶性分析，图中1为蛋白Marker；2含pColdI的细菌全蛋白，3为含pCold-NS3的细菌诱导表达后经裂解离心收集的沉淀；4含pCold-NS3的细菌诱导表达后经裂解离心收集的上清；

图6、本申请的Western-blot结果，图中1为蛋白Marker；2为含pColdI的细菌全蛋白，3为含pCold-NS3的细菌诱导表达后裂解后离心收集的上清；4为纯化后的重组蛋白NS3。

图7、本申请的间接ELISA结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。

实施例1：蓝舌病病毒NS3蛋白基因序列的优化

(1)序列分析及优化

对NS3蛋白开放阅读框原序列进行分析，尝试设计十几组优化序列进行单因素试验，经重组表达预实验，通过SDS-PAGE电泳和Western blot验证，最终确立最适于本申请蛋白可溶表达的优化序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。

优化后的NS3基因序列：

ATGCTGAGCGGTCTGATTCAGCGTTTTGAAGAAGAAAAAACCAAACATAATCAGGATCGTGTTGAAGAACTGTCACTGGTGCGCGTTGATGATACCATTAGCCAGCCGCCGCGTTATGCCCCGAGCGCACCGATGCCGAGCAGCATGCCGACCGTTGCACTGGAAATTCTGGATAAAGCAATGAGTAATACCACCGGTGCAACCCAGACCCAGAAAGCCGAAAAAGCCGCCTTTGCCAGCTATGCAGAAGCATTTCGTGATGATGTTCGTCTGCGTCAGATTAAACGCCATGTTAATGAACAGATTCTGCCGAAACTGAAAAGCGATCTGAGCGGTCTGAAGAAAAAACGTGCAATTATTCATACCACCCTGCTGGTTGCAGCAGTTGTTGCACTGCTGACCAGCGTTTGTACCCTGAGCAGCGATATGAGTGTTGCATTTAAAATTAATGGTACCAAAACCGAAGTGCCGAGCTGGTTTAAAAGCCTGAATCCGATGCTGGGTGTTGTTAATCTGGGTGCAACCTTTCTGATGATGGTTTGTGCAAAAAGCGAACGTGCACTGAATCAGCAGATTGATATGATTAAAAAAGAAGTGATGAAAAAACAGAGCTATAATGATGCAGTTCGTATGTCATTTACCGAATTTAGCAGCGTTCCGCTGGATGGTTTTGAAATGCCGCTGACCTAA

(2)引物设计及PCR反应

根据优化后的NS3序列设计特异性引物，分别在引物的5’端加入保护性碱基和限制性内切酶，引物序列如下：

NS3-S:5'CGCGGATCCATGCTGTCTGGTCTGATCCAGCGC T'3

NS3-A:5'CCGGAATTCTCAGGTCAGCGGCATTTCGAAACCAT'3

以优化后的NS3基因的cDNA为模板，用上述特异性引物进行PCR扩增。

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10sec，55℃退火30sec，68℃延伸1min，35个循环；68℃延伸7min，4℃保存。

PCR反应体系：2×PCR Buffer 12.5μL，2mM dNTPs 5μL，10mM NS3-S Primer 0.75μL，10mM NS3-A Primer 0.75μL，NS3cDNA 1μL，dH₂O 5μL。

实施例2原核表达载体pCold-NS3的构建

(1)优化的基因片段与载体pColdI连接

限制性内切酶BamHI和EcoRI对优化后的NS3基因和载体pColdI进行双酶切，酶切体系如下：

37℃条件下，反应1h。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用Takara公司的琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化。

采用Takara公司的连接试剂盒DNA Ligation Kit(Mighty Mix〉将酶切产物NS3、pColdI进行连接，制备重组原核表达载体pCold-NS3(见图2)。NS3、pColdI的mol数比约为4:1。16℃，连接1小时。连接体系如下：

(2)连接产物的转化

将连接产物通过热激转化的方式转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α。取100μL感受态细胞DH5α在冰上融化，加入10μL连接产物，轻轻混匀。冰上放置30min。随后42℃水浴热激45s，再冰上放置2min。添加SOC培养基500μL，并与37℃振荡培养1h(160-225rpm)。取适量涂布于含Amp的LB平板，37℃过夜培养。

(3)阳性质粒的鉴定

挑取白色菌落，接种至含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。取少量菌液进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。取菌落PCR阳性的菌液用Takara公司的质粒小量提取试剂盒进行小量质粒提取，并进行双酶切鉴定，参见图4。选取菌落PCR和酶切鉴定均阳性的阳性质粒进行测序鉴定。

实施例3重组蛋白NS3的表达与纯化

(1)诱导表达

将测序正确的质粒pCold-NS3通过热激转化的方式转化入表达型的大肠杆菌感受态细胞BL21(De3)。菌落PCR确定阳性菌，即含重组表达质粒pCold-NS3的表达菌。将含重组表达质粒pCold-NS3的表达菌接种至自诱导表达培养基中诱导表达，所述自诱导培养基为Overnight Express ^TM Instant LB Media，诱导表达的步骤：取少量菌液接种至3mL含Amp的LB液体培养基中，37℃过夜培养。取过夜培养的菌液按照1:100的量加入到含Amp的自诱导培养基中，15℃条件下，诱导时间24h。表达产物进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，图中5为蛋白Marker；2含pColdI的细菌全蛋白，3为含pCold-NS3的细菌诱导表达后经裂解离心收集的沉淀；4含pCold-NS3的细菌诱导表达后经裂解离心收集的上清，可见目标蛋白NS3大量存在于上清液中，同时沉淀中基本没有该蛋白，即不存在包涵体形式，这令人惊喜；因为生物领域熟知，原核表达病毒蛋白容易形成包涵体，很难通过常规的手段例如实验条件优化、基因序列优化等获得如此高比例的可溶性蛋白，尤其是对于蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的原核表达更是难得的结果。本发明的方法使该蛋白占总表达蛋白量的45％以上，表达量极其显著，跟真核表达系统效率相当甚至更好，获得了出乎意料的技术效果。

(2)纯化

用QIAGEN His标签蛋白纯化试剂盒进行重组蛋白的纯化。具体步骤：取200mL诱导表达后的菌液，12000rpm离心2min，弃上清，保留底部的菌体；将菌体冰浴15min后，加入10mL裂解缓冲液重悬菌体，继续冰浴30min，期间轻轻摇晃混匀2-3次；4℃下，14000g/min离心30min，得到裂解液上清；上下颠倒纯化柱，使柱中的树脂颗粒重悬起来，打开盖子，并去掉柱子底部的封闭帽，让柱中的保存液自然流干；将裂解液上清加入纯化柱中，在重力作用下自然流干；加4mL洗液，洗柱两次；先后各加入1mL洗脱液，将挂柱的重组蛋白洗脱下来，即重组蛋白NS3。

实施例4重组蛋白NS3的抗原性分析

纯化的重组蛋白NS3进行Western-blot分析，一抗为蓝舌病阳性血清、二抗为HRP标记的兔抗羊多抗血清。Western-blot结果表明优化后的原核重组表达的NS3蛋白有很好的抗原性，结果见图6。

实施例5以重组蛋白NS3为包被蛋白的间接ELISA

为进一步验证重组蛋白NS3的表面活性，以重组蛋白NS3为包被蛋白，建立一种间接ELISA。具体步骤：以碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释纯化的重组蛋白NS3至0.25ng/μL，ELISA板每孔200μL，4℃包被过夜；PBST洗涤3次；每孔300μL含5％脱脂奶粉的PBST，37℃封闭2h；PBST洗涤3次；每孔100μL待检血清(1:160稀释)，室温(25℃)下孵育30min；PBST洗涤3次；100μL/孔HRP标记的兔抗绵羊抗体(1:10000稀释)，室温(25℃)下孵育30min；PBST洗涤3次；加入100μL/孔TMB显色液，室温条件下避光显色10min；100μL/孔0.5mol/L H₂SO₄终止液终止后，读取OD450nm值。以该间接ELISA方法，检测20份蓝舌病阳性血清和20份蓝舌病阴性血清。

结果表明，20份蓝舌病阳性血清OD值均大于1.5，而20份蓝舌病阴性血清OD值在0.3左右，两者差异显著，进一步说明了该重组蛋白NS3具有良好免疫原性，具体结果见附图7。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120> 一种蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的可溶制备方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctgagcg gtctgattca gcgttttgaa gaagaaaaaa ccaaacataa tcaggatcgt 60

gttgaagaac tgtcactggt gcgcgttgat gataccatta gccagccgcc gcgttatgcc 120

ccgagcgcac cgatgccgag cagcatgccg accgttgcac tggaaattct ggataaagca 180

atgagtaata ccaccggtgc aacccagacc cagaaagccg aaaaagccgc ctttgccagc 240

tatgcagaag catttcgtga tgatgttcgt ctgcgtcaga ttaaacgcca tgttaatgaa 300

cagattctgc cgaaactgaa aagcgatctg agcggtctga agaaaaaacg tgcaattatt 360

cataccaccc tgctggttgc agcagttgtt gcactgctga ccagcgtttg taccctgagc 420

agcgatatga gtgttgcatt taaaattaat ggtaccaaaa ccgaagtgcc gagctggttt 480

aaaagcctga atccgatgct gggtgttgtt aatctgggtg caacctttct gatgatggtt 540

tgtgcaaaaa gcgaacgtgc actgaatcag cagattgata tgattaaaaa agaagtgatg 600

aaaaaacaga gctataatga tgcagttcgt atgtcattta ccgaatttag cagcgttccg 660

ctggatggtt ttgaaatgcc gctgacctaa 690

Claims (9)

1.一种序列优化的蓝舌病病毒非结构蛋白NS3基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种重组表达载体pCold-NS3，其特征在于，包含权利要求1所述序列优化的蓝舌病病毒非结构蛋白NS3基因。

3.根据权利要求2所述重组表达载体pCold-NS3，其特征在于，所述的优化的蓝舌病病毒非结构蛋白NS3基因插入到表达载体pCold-I的酶切位点BamHI和EcoRI之间。

4.含有权利要求2-3所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)表达型感受态细胞。

5.一种权利要求2-3所述重组表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)得到优化的NS3蛋白基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)根据优化的NS3蛋白基因序列，设计特异性引物，在引物5'端分别加入保护碱基和相应限制酶切位点BamHI和EcoRI，引物序列分别为

NS3-S:5'CGCGGATCCATGCTGTCTGGTCTGATCCAGCGC T'3

NS3-A:5'CCGGAATTCTCAGGTCAGCGGCATTTCGAAACCAT'3

(3)以优化的NS3蛋白基因序列为模板，PCR扩增，获得PCR产物；

(4)用限制性内切酶BamHI和EcoRI对PCR产物和pCold I双酶切，切胶回收获得酶切后的NS3基因和线性化的pCold I；

(5)酶切后的NS3基因和线性化的pCold I采用T4连接酶16℃条件下连接2小时，转化入感受态细胞DH5α，筛选获得阳性菌，提取质粒获得重组表达载体pCold-NS3。

6.一种蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的可溶制备方法，其特征在于，利用权利要求2或3所述重组表达载体pCold-NS3，或权利要求4所述的宿主细胞进行重组表达。

7.一种蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的可溶制备方法，其特征在于，包含权利要求5所述步骤，并进一步包括：

(6)将重组表达载体pCold-NS3通过热激转化入感受态细胞BL21(DE3)，筛选获得含有重组表达载体pCold-NS3的表达菌。

8.权利要求7所述的蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的可溶制备方法，其特征在于，还包括：

(7)采用自诱导表达培养基对重组表达菌进行培养。

9.权利要求8所述的蓝舌病病毒非结构蛋白NS3的可溶制备方法，其特征在于，所述步骤

(7)为：将含重组表达载体pCold-NS3的表达菌接入自诱导表达培养基中，15℃条件下诱导表达24h，并进一步包括：

(8)取诱导后的菌液离心，加入PBS缓冲液，超声破碎后离心，取上清液；

(9)将上清液加入亲和层析柱中，洗涤后，洗脱获得纯化NS3蛋白。