CN109880812A - 一种新型酯酶及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酯酶及编码该酯酶的核酸分子。本发明提供的酯酶，包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:2的功能。本发明提供的酯酶能水解pNPB，并能较好地作用于乳脂肪，产生具有代表性的中、短碳链脂肪酸类化合物(C4～C8)等风味物质，对研究乳品香精基料风味和调香工艺具有重要意义。

Description

一种新型酯酶及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型酯酶及应用。

背景技术

酯酶(EC 3.1.1.X)，是催化酯水解酶的总称，包括羧酸酯酶和脂肪酶。在生化方面酯酶和脂肪酶并没有本质区别，主要在底物特异性方面，羧酸酯酶倾向于水解酰基链长度短的底物(≤10)，而脂肪酶倾向于水解酰基链长度长的底物(≥10)。酯酶种类多、来源广，具有作用高效、催化反应条件温和、耗能低、不需要辅酶、副产物比较少以及催化产物质量高等优点。因此被广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学、生物柴油以及手性药物拆分等领域。目前，酯酶已成为在生物技术和有机合成方面应用最广泛的一类酶，也是在工业生产中被重点研究的催化刻。微生物所分泌产生的酯酶是酯酶的主要来源之一。微生物源酯酶具有温度和pH值范围广、底物专一性强等特点。能够发酵生产酯酶的微生物种类很多，据不完全统计，产酯酶的微生物多达65个属。不同生物来源的酯酶具有不同的蛋白质结构，决定了它们具有不同催化活力和催化专一性。酯酶对底物的专一性包括位置(或区域)专一性、脂肪酸专一性及立体专一性等。因此，微生物源酯酶是工业酶催化剑的重要源泉。

在奶味香精的生产和研发过程中，奶香味成分的调配占有极其重要的地位，而在调配工作中，奶味香精中关键性奶香风味化合物的确定又是调香工作的基础和关键性步骤。奶味香精的制备大多以奶油或干酪等为原料，利用相关微生物、酶水解等技术对乳脂肪进行适当的酶解，通过控制酶解程度得到不同奶香特征的风味化合物，以达到酶解增香的目的，再经修饰调配成奶味香精，大量应用于食品工业中。由于不同来源的酯酶，不同的酶解工艺获得的乳制品酶解产物风味略有不同，因此，在采用酶法制备奶味香精的生产中，酶的特异性、酶解产物中关键性奶香风味化合物则是酶水解稀奶油需要控制和分析的关键问题，对乳制品香精香料与调香工艺的分析研究具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一种酯酶，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:2的功能。

本发明还提供了一种核酸分子，其选自：

(a)编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列；以及

(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方案中，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种载体，其包含前述的核酸分子。

本发明还提供了一种宿主细胞，其包含前述的核酸分子，或载体。

在本发明的一个具体实施方案中，所述宿主细胞其选自细菌细胞、真菌细胞，优选选自酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。更优选为毕赤酵母细胞。

本发明还提供了一种生产酯酶的方法，其包括在宿主细胞中表达编码前述酯酶的核酸分子，并且回收得到的多肽。

本发明还提供了本发明的酯酶在水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物中的用途。

本发明还提供了一种水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物的方法。本发明提供的方法包括将前述的酯酶或包含前述的酯酶的组合物或使用前述的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物。

附图说明

图1为摇瓶发酵SL-5蛋白电泳图，其中泳道1为经摇瓶发酵得到的SL-5，泳道M为Marker。

图2显示了SL-5作用底物专一性测试结果。

图3显示了SL-5在不同温度下的相对酶活。

图4显示了SL-5在不同pH下的相对酶活。

图5显示了不同金属离子对SL-5酶活的影响。

图6显示了SL-5在不同温度下孵育的酶活检查结果。

图7显示了：不同SL-5添加量对稀奶油酸值的影响。

具体实施方式

在本发明中，除非另外说明，所有的百分数和比例均以质量计。另外，本发明描述的所有数值范围均包括端值并且可以包括将公开的范围的上限和下限互相任意组合得到的新的数值范围。例如，如果公开了某种组分的质量百分含量为10～30质量％，优选15～25质量％，更优选20～23质量％，则相当于同时公开了以下的数值范围：10～15质量％、10～25质量％、10～20质量％、10～23质量％、15～30质量％、15～20质量％、15～23质量％、20～25质量％、23～25质量％。

本发明提供了一种酯酶，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:2的功能。

在一个实施方案中，本发明的酯酶的序列如SEQ ID NO:2所示。此外，本发明的SEQID NO:2还可以具有氨基酸残基的一个或几个，例如1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2个缺失、插入或取代，这些改动产生沉默变化或者产生功能上等效的酶。在保持酶活性的情况下，被设计的氨基酸取代可以根据残基在极性、电荷、可溶性、亲水性、疏水性和/或双亲性质上的相似性。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似的亲水性的具有不带电的极性头部的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

保守取代可以根据下表来进行。在第二栏中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代，在优选的情况下第三栏中同一行的氨基酸可互相取代：

本发明包括通过对SEQ ID NO:4进行删除、插入或保守取代得到的、仍然保留其活性的序列。其应该被视为SEQ ID NO:4的等同方案而得到保护。

本发明还提供了一种核酸分子，其选自：

(a)编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列；以及

(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

技术人员将会认为，由于遗传密码的简并性，多种不同的核苷酸序列可以编码同样的酶。另外，可以认识到，技术人员能够使用常规技术进行不影响本发明的核苷酸序列所编码的酶活性的核苷酸取代，这样可以反映表达本发明的酶所用的任何特定的宿主生物体的密码子偏倚性。

本发明也包括与本文列出的SEQ ID NO:1和2具有一定同一性的序列。合适的核酸或氨基酸序列与本文报道的SEQ ID NO:1和2具有至少约50％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少91％，甚至更优选至少92％，甚至更优选至少93％，甚至更优选至少94％，甚至更优选至少95％，甚至更优选至少96％，甚至更优选至少97％，甚至更优选至少98％，最优选至少9899％的同一性。其应该被视为SEQ ID NO:3和4的等同方案而得到保护。

百分比同一性是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类线性序列的匹配情况进行测定。“同一性”能够通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于下述的那些方法：ComputationalMolecular Biology(Lesk，A.M.，Ed.)Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.，Ed.)Academic Press，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，Eds.)Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.，ed.)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.andDevereux，J.，eds.)Stockton Press，NY(1991)。确定同一性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和同一性百分比计算可使用LASERGENE生物信息学计算软件包的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics 16，(6):276-277(2000))。序列多重比对可使用Clustal比对方法进行(即CLUSTALW；例如1.83版)(Higgins和Sharp，CABIOS，5:151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22:4673-4680(1994)；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res 31(13):3497-500(2003))，它们得自European Molecular Biology Laboratory via theEuropean Bioinformatics Institute)，使用默认参数。

本发明还提供了包含所述核酸分子的载体，以及包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。

“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可为得自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经被接合或重组到特定构建体中，该构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同合适的3'非翻译序列一起导入细胞。

本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞，例如细菌细胞、真菌细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。用于表达本发明的核酸分子的异源宿主细胞可以是存在于真菌或细菌家族中并在宽温度、pH值和溶剂耐受性范围内生长的微生物宿主。例如，预期任何细菌、酵母和丝状真菌可为表达本发明核酸分子的合适宿主。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如毕赤酵母属(Pichia)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)物种。在一个实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。

可用于转化上述宿主细胞的载体是本领域熟知的。通常，载体包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5'区域和控制转录终止的DNA片段3'区域。

本发明还涉及生产酯酶的方法，包括在宿主细胞中表达编码本发明的酯酶的核酸分子，并且回收得到的多肽。

可应用多种培养方法以制备本发明的酶。例如，从重组微生物宿主中大规模生产特定基因产物可通过分批、分批补料和连续培养方法进行。

分批和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989))，以及Deshpande，Mukund V.，(Appl.Biochem.Biotechnol.，36:227-234(1992)。

本发明的酶的商业生产也可通过连续培养进行。连续培养是一种开放式系统，其中将设定好的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由天然材料和/或合成材料组成。

从分批发酵、分批补料发酵、或连续培养中回收期望的酶可通过本领域技术人员已知的任何方法完成。例如，当在细胞内生产酶时，通过离心或膜过滤从培养基中分离细胞浆液，任选地用水或期望pH的含水缓冲液洗涤，然后将期望pH的含水缓冲液中的细胞浆液悬浮使其匀化，生产出包含需要的酶的细胞提取物。

本发明还提供了本发明的酯酶在水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物中的用途。

在本发明中，术语“中、短碳链脂肪酸类化合物”指的是碳链长度为4-8的脂肪酸类化合物。中短碳链脂肪酸(例如丁酸，己酸，辛酸)使产品具有一种独特强烈的奶风味，它们具有较高的香气贡献度，是构成乳香的主要成分。本发明的SL-5能较好地作用于乳脂肪，产生具有代表性的中、短碳链脂肪酸类化合物等风味物质，对研究乳品香精基料风味和调香工艺具有重要意义。

本发明还提供了一种水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物的方法。本发明提供的方法包括将前述的酯酶或包含前述的酯酶的组合物或使用前述的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所采用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。此外，“含有”、“包含”、“包括”等类似术语在本文中也包括“由……组成”、“由……构成”、“由……制成”之意；本文各实施方案中提及的各范围均可任意组合。

在本发明中，采用的检测方法如下：

1、酶活采用pNPB法检查，具体如下：

(1)测定试剂

A液：0.2mol/L NaH2PO4溶液，称取2.4g NaH2PO4用蒸馏水溶解并定容至100mL；

B液：0.2mol/L Na2HPO4溶液，称取2.84g Na2HPO4用蒸馏水溶解并定容至100mL；

底物缓冲液：取5.3mL A液和9.47mL B液，混合后加入约280mL水，加入0.92g脱氧胆酸钠、0.44g阿拉伯树胶粉，搅拌溶解，用H3PO4或NaOH调节pH值至8.0，定容至400mL，4℃保存。

底物pNPB溶液(3mg/mL)：称取pNPB 0.030g，加入10mL异丙醇溶解，4℃保存。

(2)测定方法

取1mL pNPB溶液和9mL底物缓冲溶液，混合。每2mL离心管加入600ul混合液，40℃预热5min。每离心管加入25uL样品，混匀，在40℃水浴锅内反应15min，立即加入无水乙醇500ul终止反应。12000rpm离心2min。分光光度测定(405nm)。

(3)酶活力计算公式：酶活力(U/mL)＝0.2275×ΔOD×10×稀释倍数/15

2、酸值(Acid value，AV)是指中和1g脂肪、脂肪油或其他类似物质中游离脂肪酸所需氢氧化钾的毫克数。取酶解液20mL于锥形瓶中，加入乙醚-乙醇(2∶1)混合溶剂50mL，使其充分溶解，再加1％酚酞乙醇溶液，用0.01mol/L KOH标准溶液滴定至出现微红色，且30s不消失，记下消耗的碱液毫升数(V)，计算公式如下：

酸值(mg KOH/g脂肪)＝V×N×56.1/W

式中：V—滴定消耗的氢氧化钾溶液体积(mL)；

N—氢氧化钾溶液当量浓度(mol/L)；

56.1—氢氧化钾的毫克当量(g/mol)；

W—被测样品重量(g)。

实施例1、表达载体pPIC 9K-SL-5的构建

经生工生物工程(上海)股份有限公司合成SL-5基因核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

经生工生物工程(上海)股份有限公司合成扩增引物对：SL-5_F及SL-5_R，其序列分别如SEQ ID NO:3(SL-5_F)和SEQ ID NO:4(SL-5_R)所示。

以合成的SL-5质粒为模板，使用引物对SL-5_F及SL-5_R，通过PCR反应扩增SL-5的成熟肽部分，其中，PCR使用Takara公司PrimeSTAR HS(DRR010A)DNA聚合酶进行，反应体系为：水33μl，5×PrimeSTAR buffer 10μl，dNTP mixture(2.5mM each)4μl，引物各1μl，SL-5质粒模板0.5μl，PrimeSTAR酶0.5μl。PCR反应程序为98℃ 3min，94℃ 10s，56℃ 30s，72℃2min，30个循环，最后72℃延伸7min。

PCR产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化(AP-PCR-50)，使用NEB公司EcoRI和NotI限制性内切酶酶切，并再次经过Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。同时使用相同的限制性内切酶酶切pPIC9K质粒，酶切产物同样用Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。使用Fermentas公司T4DNA连接酶，按照产品说明，将PCR产物酶切片段和pPIC9k载体酶切片段进行连接，连接物热激法转入大肠杆菌DH5α中，在含氨苄的LB平板上过夜培养。次日挑取单克隆在LB液体培养基中培养，使用Axygen公司质粒提取试剂盒提取质粒并送交上海生工测序。

将测序正确的重组表达载体用Sal I限制性内切酶酶切线性化后，按照毕赤酵母的标准转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey J Letchworth,2004)，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布到选择培养基MDS筛选平板，于28℃培养三天。挑取转化子至三丁酸甘油平板(1％蛋白胨，0.5％NaCl，0.5％酵母粉，2％琼脂糖，2％三丁酸甘油酯)上，30℃培养2天，挑取水解圈最大的转化子，获得GS115-SL-5菌株。

实施例2、GS115-SL-5菌株摇瓶发酵

将GS115-SL-5菌株接种至50mL的BMGY培养基中，30℃，220rpm培养过夜，取300OD菌体离心收集。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加2％的甲醇，30℃，240rpm诱导表达。每隔12h向50mL培养基中补加0.5mL甲醇。诱导3天后，8000rpm，4℃离心发酵液，使用0.22um滤膜过滤处理上清液，将等量上清液使用用Milipore 10Kda超滤浓缩罐管浓缩到相同体积后，取用相同体积的浓缩酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果如图1所示。根据图1结果所示，泳道1有明显的目标条带，且条带大小位于35-40KDa之间，图1结果显示，酯酶SL-5经毕赤酵母GS115摇瓶发酵后可以成功的表达并分泌到胞外。

实施例3、底物专一性

以异丙醇为溶剂分别配制浓度为3mg/mL的4-硝基苯基丁酸酯(pNPB)、4-硝基苯基辛酸酯(pNPO)、4-硝基苯基月桂酸酯(pNPD)、4-硝基苯基豆蔻酸酯(pNPM)、4-硝基苯基棕榈酸酯(pNPP)、4-硝基苯基硬脂酸酯(pNPS)底物，按照标准pNPB法(更换为相应底物)检测脂肪酶的活力，根据酶活力为100％，计算其他公式计算各种底物下的相对酶活力，结果如图2所示。由图2可见，该酯酶(SL-5)可以特异的作用于pNPB，而对其他底物的作用则非常弱。

实施例4、最适作用温度

在不同的温度(30-70℃)下按照pNPB法测定脂肪酶活力，以测定酶活最高时的酶活力为100％，计算其他温度下的相对酶活(％)，结果如图3所示。由图3可见，SL-5最适作用温度为45℃，且在65℃时仍有73％的酶活，证明其可应用的温度范围较广。

实施例5、最适作用pH

将酶液SL-5分别加在不同pH(3.0-11.0)的缓冲液中(3.0≤pH＜6.0为乙酸-NaOH缓冲液、6.0≤pH＜6.5为MES缓冲液、6.5≤pH＜9.0为Tris-HCl缓冲液、9.0≤pH≤11为甘氨酸-NaOH缓冲液)，45℃下按pNPB法测定脂肪酶活力，以测定活力最高时的酶活力为100％，计算其他pH下酶的相对活力(％)，结果如图4所示。由图4可见，SL-5酯酶在pH值7-9能表现较高的脂肪酶酶活。

实施例6、金属离子对脂肪酶活力的影响

配制ZnSO₄、MnCl₂、CaCl₂、MgSO₄、CuSO₄、KCl、(NH4)₂SO₄、NaCl、NiSO₄、FeCl₃和EDTA等无机盐贮存液。按照pNPB方法，首先配制反应混合液，向每个反应管中分装600uL混合液，并添加终浓度为5mmol/L的无机盐贮存液，再按照标准方法测定活性。以添加水为对照记为100％，计算其他各组的相对活力，结果如图5所示。如附图5所示，ZnSO₄、CuSO₄、FeCl₃、CaCl₂、MgSO₄均对SL-5脂肪酶有强抑制作用，但NaCl、KCl、(NH4)₂SO₄则对SL-5脂肪酶有明显的激活作用，尤其是(NH4)₂SO₄，相比对照酶活可以提高80％左右。

实施例7、温度稳定性

将SL-5酯酶分别放入55℃和65℃水浴锅内孵育，分别在0h、2h、4h、6h、8h、20h和24h取样。pNPB检测方法同实施例3，检测剩余酶活。测得的数据用Origin 8.0处理，结果如图6所示，根据图6结果，SL-5酯酶具有较好的温度稳定性。

实施例8、稀奶油水解实验

称取3.0g稀奶油，分别设定酶添加量为10、20、30、40、50、60U进行酶解反应，用去离子水补齐至50mL。酶解温度35℃，pH为8.0，酶解时间为18h，结果如图7所示。

根据图7结果，随着酶的添加量从10U增加到60U，SL-5对乳脂肪的酶解作用也逐渐增强，且在30U时达到饱和。可见SL-5能较好地作用于乳脂肪，产生具有代表性的中、短碳链脂肪酸类化合物(C4～C8)等风味物质，对研究乳品香精基料风味和调香工艺具有重要意义。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 一种新型酯酶及应用

<130> 123

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

atgtctcgtg aaggtaccac cattttgatt gaacctcccg aaactgctga ttctgtcgtt 60

gttatcatgc atggtttggg tgataccgcc aacggttttg ccgatgttgc ccagatgttt 120

tctgcccgta tgcctaccac caaatttatt ttgcctaccg cccctacaca gcctgttacc 180

ttgaaccgtg gtatgcgtat gccttcttgg tatgacatcg tttctttggg tggtggtcct 240

aacgaaacct ttgagggcat tgaagattct gcccagcgta ttcgtggtat tttggaccag 300

gaacatgaaa agggtatgcc ttataaccgt atggttttgg ccggtttttc tcagggtgcc 360

gccatgtctt tgtttaccgg tttgcagttg cctgccgaaa aaaaattggc cggcttgttg 420

gttatgtctg gttatttggc cggttacaac acctttaaat tgacccctgg cttggaagat 480

actcctgttt tgcatcagca tggtacctct gatcaggttg tttctttcga aatgggtgat 540

cgtacccaga aacgtgttca ggaattgggt gccaccgatt atactttgga accctacaag 600

ggtatgtccc attctgtttc tcctgaagaa ttgggttctg gtttggcctt tttgcaaaaa 660

gttttggccc ctgccaaaga tgctgccacc gattctggtg caggtgccaa aaccgttgat 720

gatatgtctg tcaccgaatt gaaagccgcc attgaacagg gtggtttggg taccaaagcc 780

gttggtttgg ttgaaaaaga ggacttggtc aagttgttga aggaatctca ggccaccaaa 840

gaattgtag 849

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Ser Arg Glu Gly Thr Thr Ile Leu Ile Glu Pro Pro Glu Thr Ala

1 5 10 15

Asp Ser Val Val Val Ile Met His Gly Leu Gly Asp Thr Ala Asn Gly

20 25 30

Phe Ala Asp Val Ala Gln Met Phe Ser Ala Arg Met Pro Thr Thr Lys

35 40 45

Phe Ile Leu Pro Thr Ala Pro Thr Gln Pro Val Thr Leu Asn Arg Gly

50 55 60

Met Arg Met Pro Ser Trp Tyr Asp Ile Val Ser Leu Gly Gly Gly Pro

65 70 75 80

Asn Glu Thr Phe Glu Gly Ile Glu Asp Ser Ala Gln Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Ile Leu Asp Gln Glu His Glu Lys Gly Met Pro Tyr Asn Arg Met Val

100 105 110

Leu Ala Gly Phe Ser Gln Gly Ala Ala Met Ser Leu Phe Thr Gly Leu

115 120 125

Gln Leu Pro Ala Glu Lys Lys Leu Ala Gly Leu Leu Val Met Ser Gly

130 135 140

Tyr Leu Ala Gly Tyr Asn Thr Phe Lys Leu Thr Pro Gly Leu Glu Asp

145 150 155 160

Thr Pro Val Leu His Gln His Gly Thr Ser Asp Gln Val Val Ser Phe

165 170 175

Glu Met Gly Asp Arg Thr Gln Lys Arg Val Gln Glu Leu Gly Ala Thr

180 185 190

Asp Tyr Thr Leu Glu Pro Tyr Lys Gly Met Ser His Ser Val Ser Pro

195 200 205

Glu Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Phe Leu Gln Lys Val Leu Ala Pro

210 215 220

Ala Lys Asp Ala Ala Thr Asp Ser Gly Ala Gly Ala Lys Thr Val Asp

225 230 235 240

Asp Met Ser Val Thr Glu Leu Lys Ala Ala Ile Glu Gln Gly Gly Leu

245 250 255

Gly Thr Lys Ala Val Gly Leu Val Glu Lys Glu Asp Leu Val Lys Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Ser Gln Ala Thr Lys Glu Leu

275 280

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccggaattca tgtctcgtga aggtacc 27

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ataaggcggc cgcctacaat tctttggtgg cc 32

Claims (10)

1.酯酶，其包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：

(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，以及

(b)由(a)所述的序列经过取代、缺失或添加至少一个氨基酸后得到的序列，所述取代优选为氨基酸保守性取代，并且所述序列仍然保持SEQ ID NO:2的功能。

2.核酸分子，选自：

(a)编码权利要求1所述的多肽的核苷酸序列；以及

(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

3.权利要求2的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.载体，其包含权利要求2或3的核酸分子。

5.宿主细胞，其包含权利要求2或3的核酸分子，或权利要求4的载体。

6.权利要求5的宿主细胞，其选自细菌细胞、真菌细胞，优选酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。

7.权利要求6的宿主细胞，其是毕赤酵母细胞。

8.生产酯酶的方法，包括在宿主细胞中表达编码权利要求1的酯酶的核酸分子，并且回收得到的多肽。

9.权利要求1的酯酶在水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物中的用途。

10.一种水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1或2所述的酯酶或包含权利要求1或2所述的酯酶的组合物或使用权利要求5-7中任一项所述的宿主细胞的发酵液、发酵上清和/或发酵浓缩液水解pNPB或制备中、短碳链脂肪酸类化合物。