CN109876004A - 柴胡皂苷a的新用途 - Google Patents
柴胡皂苷a的新用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109876004A CN109876004A CN201910338996.XA CN201910338996A CN109876004A CN 109876004 A CN109876004 A CN 109876004A CN 201910338996 A CN201910338996 A CN 201910338996A CN 109876004 A CN109876004 A CN 109876004A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- saikoside
- cell
- prostate cancer
- resting stage
- lncap
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
本发明涉及医药学领域,特别是涉及一种皂苷化合物的新的医药用途。本发明的柴胡皂苷A可用于制备抑制静止期前列腺癌细胞生长的药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,特别是涉及一种皂苷类化合物的新用途。
背景技术
在癌症首次治疗过后,会残余下一些非增殖期的肿瘤细胞,这部分癌细胞不能被放化疗杀死,并会重新增殖从而导致癌症的复发,称为静止期癌细胞。静止期肿瘤细胞被激活转变为增殖期的肿瘤细胞,是肿瘤复发的一大原因。
前列腺癌是威胁男性健康的常见肿瘤之一。2014-2018年,前列腺癌的五年生存率为98.2%,而前列腺癌的致死率相较其他高发癌症相对较低。因此在前列腺癌的治疗中,如何提高患者的生存质量和防止癌症的复发,具有重要的意义。
肿瘤细胞进入静止期是其进行自我保护的一种机制,癌细胞进入静止期后可以减少细胞存活所需的能量,并降低对药物的敏感度,从而有利于癌细胞的存活。当机体环境发生变化后,静止期癌细胞会重新进入细胞周期,肿瘤又开始重新生长,从而导致癌症的复发。静止期细胞对于化疗药物和放疗耐受,目前临床上没有针对静止期细胞起效的抗癌药物。如果可以杀死处于静止期的癌细胞,就能极大降低其重新激活的可能性,从而预防癌症的复发。
柴胡为伞行科柴胡属Bupleurum DC.的根。柴胡皂苷是传统中药柴胡的主要生物活性成分。柴胡皂苷分A、B、C、D、M、N、P和T等,其中柴胡皂苷A和柴胡皂苷D为其有效活性成分。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种柴胡皂苷A的新的医药用途。
具体地说,本发明的第一方面是提供了式(Ⅰ)化合物在制备抑制静止期前列腺癌细胞生长的药物中的应用:
较优选地,所述药物可作为化疗辅助药物。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述,本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
图1静止期人前列腺癌细胞LNCaP对化疗药物耐受的统计分析图。
图2静止期人前列腺癌细胞DU145对化疗药物耐受的统计分析图。
图3为柴胡皂苷A能诱导对化疗药物耐受的静止期人前列腺癌细胞LNCaP死亡的统计分析图。
图4为柴胡皂苷A能诱导对化疗药物耐受的静止期人前列腺癌细胞DU145死亡的统计分析图。
图5为柴胡皂苷A诱导静止期人前列腺癌细胞LNCaP死亡的流式分析图。
图6为柴胡皂苷A诱导静止期人前列腺癌细胞DU145死亡的流式分析图。
图7为柴胡皂苷A诱导静止期人前列腺癌细胞LNCaP凋亡的PI-ANNEXIN V双染流式分析图。
图8为柴胡皂苷A诱导静止期人前列腺癌细胞DU145凋亡的PI-ANNEXIN V双染流式分析图。
图9为柴胡皂苷A抑制裸鼠皮下静止期人前列腺癌细胞PC-3移植瘤生长的体积变化曲线。
具体实施方式
本发明人通过体内和体外实验研究,意外地发现柴胡皂苷A(Saikosaponin A,简称SSA)能够显著性地诱导静止期前列腺癌细胞死亡。故而,该化合物可用于制备抑制静止期前列腺癌细胞生长的药物。
如本领域的技术人员所知,本发明的柴胡皂苷A具有如下结构通式:
分子式:C42H68O13 分子量:781
本发明的柴胡皂苷A可通过本领域的常规方法从柴胡中提取获得,或者利用市售原料,通过现有技术中传统的化合物合成方法合成获得。本领域的普通技术人员根据现有公知技术可以合成本发明的化合物。合成的化合物可以进一步通过柱色谱法、高效液相色谱法或结晶等方式进一步纯化。
合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的,并且是现有技术中公知的技术,如R.Larock,Comprehensive OrganicTransformations,VCH Publishers(1989);T.W.Greene and P.G.M.Wuts,ProtectiveGroups in Organic Synthesis,3rd Ed.,John Wiley and Sons(1999);L.Fieser andM.Fieser,Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis,John Wiley andSons(1994);and L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)中都有公开。
本发明的柴胡皂苷A可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为活性成分的本发明的柴胡皂苷A及可药用载体。较佳地,本发明的药物组合物含有0.1~99.9%重量百分比的作为活性成分的本发明的柴胡皂苷A。“可药用载体”不会破坏本发明的柴胡皂苷A的药学活性,同时其有效用量,即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。
所述可药用载体包括但不限于:软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
本发明的柴胡皂苷A以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等;非肠道给药制剂包括注射液等;局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。
本发明的柴胡皂苷A以及其药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经肌肉或皮下、静脉、尿道、阴道等。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例1柴胡皂苷A诱导对化疗药物耐受的静止期前列腺癌LNCaP和DU145细胞死亡
1.1实验材料
柴胡皂苷A购自上海源叶生物科技有限公司。多西他赛(Docetaxel),紫杉醇(Taxol),依托泊苷(Etopside),5-氟尿嘧啶(Fluorouracil,5-FU),顺铂(Cisplatin)均购自上海陶素生化科技有限公司。
人前列腺癌细胞LNCaP和DU145购自美国ATCC细胞库。
RPMI1640,胎牛血清,青霉素和链霉素,SYBR GREEN购自美国Invitrogen公司。
1.2实验方法
人前列腺癌细胞LNCaP和DU145用含10%胎牛血清,100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培液基,于37℃,5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养,用0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。
静止期前列腺癌细胞LNCaP(DU145)的培养方法:用含10%血清的RPMI1640培养的LNCaP(DU145)细胞长到70-80%时,将培养基换成无血清的RPMI1640继续培养7天,得到静止期的LNCaP(DU145)细胞。
取对数增长期人前列腺癌细胞LNCaP(5×103个细胞/孔)或DU145(1*105个细胞/孔),接种于96孔板中,按1.2方法培养成为静止期细胞,并保留同样的细胞数作为细胞基数(Baseline)置于-80℃。第八天,分别加入40μM的Docetaxel,Taxol,Etopside,Fluorouracil(5-FU),Cisplatin处理细胞72小时;或加入浓度梯度为5,10,12.5,15μM的柴胡皂苷A(柴胡皂苷A),于96孔板中作用24小时,吸去全部培养基。将96孔板置于-80℃过夜后,每孔加入100μl含0.01%SYBR GREEN,20%细胞裂解液的染色试剂,避光孵育1h,对DNA进行染色,并将保留的Baseline做同样处理。使用酶标仪在激发光485/20nm,发射光528/20nm下检测荧光值。
1.3实验结果
结果如图1所示,静止期LNCaP细胞在40μM的高浓度化疗药物作用72小时后,DNA含量相较于细胞基数(Baseline)均未发现显著改变,表明细胞数量没有发生显著改变。说明静止期LNCaP细胞对于化疗药物具有耐受性。
结果如图2所示,静止期DU145细胞在40μM的高浓度化疗药物作用72小时后,DNA含量相较于细胞基数(Baseline)均未发现显著改变,表明细胞数量没有发生显著改变。说明静止期DU145细胞对于化疗药物具有耐受性。
结果如图3所示,静止期LNCaP细胞在不同浓度的柴胡皂苷A处理24小时后,DNA含量均低于细胞基数(Baseline),表明细胞数量显著减少,说明柴胡皂苷A诱导了静止期前列腺癌LNCaP细胞的死亡。其中当柴胡皂苷A的浓度为10μM时就可以显著地杀死静止期LNCaP细胞。
结果如图4所示,静止期DU145细胞在不同浓度的柴胡皂苷A处理24小时后,DNA含量均低于细胞基数(Baseline),表明细胞数量显著减少,说明柴胡皂苷A诱导了静止期前列腺癌DU145细胞的死亡。其中当柴胡皂苷A的浓度为10μM时就可以显著地杀死静止期DU145细胞。
本实验证明静止期人前列腺癌细胞对化疗药物耐受,但是柴胡皂苷A能够显著诱导静止期前列腺癌细胞的死亡。表明柴胡皂苷A具有潜在的抑制前列腺癌复发的作用,可以作为放化疗后辅助药物增强放化疗的敏感度,或可开发成为预防肿瘤复发的药物。
实施例2柴胡皂苷A诱导静止期前列腺癌LNCaP和DU145细胞死亡的定量
2.1实验材料
人前列腺癌细胞LNCaP和DU145购自美国ATCC细胞库。
RPMI1640,胎牛血清,青霉素和链霉素,Flexible viability dye购自美国Invitrogen公司。
2.2实验方法
取对数增长期人前列腺癌细胞LNCaP(5×103个细胞/孔)或DU145(1×105个细胞/孔),接种于6孔板中,按1.2方法培养成为静止期细胞。第八天加药处理细胞。以浓度梯度分别为10,11,12,13μM的柴胡皂苷A处理LNCaP细胞24h,以浓度梯度分别为11,12,13,14μM的柴胡皂苷A处理DU145细胞24h。收集细胞到流式管中,离心2000rpm,2分钟,弃上清,用100μlPBS稀释的Flexible viability dye重悬细胞,4℃染色20min,加入400μlPBS后上流式细胞仪检测。用Flowjo软件进行数据分析,统计死亡细胞数目百分比。
2.3实验结果
结果如图5所示,静止期LNCaP细胞在不同浓度的柴胡皂苷A处理24小时后,随着柴胡皂苷A浓度的增大,活细胞百分比下降,死细胞百分比上升。说明柴胡皂苷A能够呈剂量依赖地诱静止期前列腺癌LNCaP细胞的死亡。
结果如图6所示,静止期DU145细胞在不同浓度的柴胡皂苷A处理24小时后,随着柴胡皂苷A浓度的增大,活细胞百分比下降,死细胞百分比上升。说明柴胡皂苷A能够呈剂量依赖地诱静止期前列腺癌DU145细胞的死亡。
本实验进一步对柴胡皂苷A诱导静止期人前列腺癌细胞死亡的作用进行定量,表明柴胡皂苷A具有潜在的预防前列腺癌复发的作用,可以作为放化疗后辅助药物增强放化疗的敏感度,或可开发成为预防肿瘤复发的药物。
实施例3柴胡皂苷A诱导静止期前列腺癌LNCaP和DU145细胞发生凋亡
3.1实验材料
人前列腺癌细胞LNCaP和DU145购自美国ATCC细胞库。
RPMI1640,胎牛血清,青霉素和链霉素,碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和Annexin V购自美国Invitrogen公司。
3.2实验方法
取对数增长期人前列腺癌细胞LNCaP(8×104个细胞/孔)或DU145(1×105个细胞/孔)接种于6孔板中,按1.2方法培养成为静止期细胞。第八天加入浓度分别为10,11,12μM的柴胡皂苷A处理24小时。收集细胞到流式管中,100μl重悬细胞,分别加入5μl PI和5μlANNEXIN V进行染色,室温避光孵育15分钟。每样品加400μl binding buffer,上流式细胞仪检测。用Flowjo软件进行数据分析,统计凋亡细胞数目百分比。
3.3实验结果
结果如图7所示,静止期LNCaP细胞在不同浓度的柴胡皂苷A处理24小时后,随着柴胡皂苷A浓度的增大,凋亡细胞的百分比显著增加。说明柴胡皂苷A能够呈剂量依赖地诱静止期前列腺癌LNCaP细胞发生细胞凋亡。以上结果表明,柴胡皂苷A可能通过诱导细胞凋亡来杀死化疗药物耐受的静止期前列腺癌LNCaP细胞。
结果如图8所示,静止期DU145细胞在不同浓度的柴胡皂苷A处理24小时后,随着柴胡皂苷A浓度的增大,凋亡细胞的百分比显著增加。说明柴胡皂苷A能够呈剂量依赖地诱静止期前列腺癌DU145细胞发生细胞凋亡。以上结果表明,柴胡皂苷A可能通过诱导细胞凋亡来杀死化疗药物耐受的静止期前列腺癌DU145细胞。
本实验证明柴胡皂苷A具有诱导静止期人前列腺癌细胞发生凋亡的作用,表明柴胡皂苷A可以作为放化疗后辅助药物增强放化疗的敏感度,或可开发成为预防肿瘤复发的药物或保健品。
实施例4柴胡皂苷A抑制裸鼠皮下静止期人前列腺癌细胞PC-3移植瘤生长
4.1实验材料
人前列腺癌细胞PC-3购自美国ATCC细胞库。
RPMI1640,胎牛血清,青霉素和链霉素购自美国Invitrogen公司。
裸鼠购自于上海必凯实验动物有限公司,雄性,4周龄,体重16-18g。
4.2实验方法
取对数生长期的人前列腺癌PC-3细胞接种于裸鼠皮下,数量为2×106个细胞/只。自第一只裸鼠的瘤块长到肉眼可见之日起,每日用游标卡尺测量每只裸鼠肿瘤的长、宽、高的长度。并计算瘤体积大小。肿瘤体积=(长×宽×高)×π/6。每只老鼠的肿瘤长到300mm3左右时,符合入组条件。将符合入组条件的裸鼠随机分为四组,即对照组,阳性药组(多西他赛组),柴胡皂苷A组,多西他赛和柴胡皂苷A联用组。每只老鼠自入组之日起,给予药物腹腔注射。每7天为一个给药周期,共给药三个周期。对照组在每个周期的第1天给予多西他赛的对照溶液,第2-7天给予柴胡皂苷A的对照溶液。多西他赛组仅在每个周期的第一天给予多西他赛5mg/kg,柴胡皂苷A组仅在每个周期的第2-7天给予柴胡皂苷A 7.5mg/kg。多西他赛和柴胡皂苷A联用组在每个周期的第1天给予多西他赛5mg/kg,第2-7天给予柴胡皂苷A7.5mg/kg。给药后第22天牺牲动物,取肿瘤及主要脏器。实验结果用“均值±标准差”表示,采用SPSS 21.0软件进行统计分析,多组间的方差分析以“one-way ANOVA”进行比较。p<0.05为*,表示有统计学差异;p<0.01为**,表示有显著性差异;p<0.001为***,表示有极为显著的差异。
4.3实验结果
结果如图9所示,给药后第5天起,柴胡皂苷A组和联用组的瘤体积显著低于对照组,p<0.001。柴胡皂苷A组,阳性药组和联用组的瘤体积生长速率显著低于对照组,而联用组的瘤体积生长速率又显著低于柴胡皂苷A组和阳性药组。此外,柴胡皂苷A组与阳性药组的瘤体积变化无显著差异。以上实验结果表明,柴胡皂苷A能够抑制裸鼠皮下人前列腺癌细胞PC-3移植瘤生长,其作用与阳性药相当。而柴胡皂苷A与多西他赛的联用能够显著降低裸鼠皮下移植瘤的体积,且联用后抑制作用显著强于单用,表明柴胡皂苷A具有潜在的抑制前列腺癌复发的作用,可以作为放化疗后辅助药物增强放化疗的敏感度,或可开发成为预防肿瘤复发的药物。
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而,应理解的是,在不偏离本发明精神之前提下,本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰,所述改变和修饰同样落入本申请所附权利要求的覆盖范围。
Claims (2)
1.式(Ⅰ)化合物在制备抑制静止期前列腺癌细胞生长的药物中的应用
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述药物可作为化疗辅助药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910338996.XA CN109876004A (zh) | 2019-04-25 | 2019-04-25 | 柴胡皂苷a的新用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910338996.XA CN109876004A (zh) | 2019-04-25 | 2019-04-25 | 柴胡皂苷a的新用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109876004A true CN109876004A (zh) | 2019-06-14 |
Family
ID=66938372
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910338996.XA Pending CN109876004A (zh) | 2019-04-25 | 2019-04-25 | 柴胡皂苷a的新用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109876004A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1496255A (zh) * | 2000-11-17 | 2004-05-12 | �������о�����չ˽������˾ | 用三萜组合物抑制NF-κB |
CN108434168A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-08-24 | 杨真慧 | 一种用于替代锥叶柴胡制备前列腺癌治疗药物的组合物及其测定方法 |
CN108721312A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-11-02 | 杨真慧 | 一种用于替代锥叶柴胡制备脑胶质瘤治疗药物的组合物及其测定方法 |
CN108796022A (zh) * | 2017-04-28 | 2018-11-13 | 上海中医药大学 | 柴胡皂苷元a和d的制备方法及应用 |
-
2019
- 2019-04-25 CN CN201910338996.XA patent/CN109876004A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1496255A (zh) * | 2000-11-17 | 2004-05-12 | �������о�����չ˽������˾ | 用三萜组合物抑制NF-κB |
CN108796022A (zh) * | 2017-04-28 | 2018-11-13 | 上海中医药大学 | 柴胡皂苷元a和d的制备方法及应用 |
CN108434168A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-08-24 | 杨真慧 | 一种用于替代锥叶柴胡制备前列腺癌治疗药物的组合物及其测定方法 |
CN108721312A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-11-02 | 杨真慧 | 一种用于替代锥叶柴胡制备脑胶质瘤治疗药物的组合物及其测定方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
MIN YAO ET AL: "Saikosaponin-d inhibits proliferation of DU145 human prostate cancer cells by inducing apoptosis and arresting the cell cycle at G0/G1 phase", 《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》 * |
杨春艳等: "柴胡皂苷D对骨肉瘤143B细胞增殖抑制作用研究", 《中国药业》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105233292A (zh) | Ory-1001联合放疗和化疗用于治疗人三阴性乳腺癌的用途 | |
CN108329381A (zh) | 一种来源于麒麟菜的十六肽及其在制备防治恶性肿瘤转移药物中的应用 | |
CN110075106B (zh) | 一种抗肿瘤药物及异烟肼在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
US11524021B2 (en) | Use of ginsenoside M1 for manufacturing medicament for treating oral cancer | |
CN109876004A (zh) | 柴胡皂苷a的新用途 | |
WO2021023290A1 (zh) | 吡硫锌在肺癌治疗中的应用 | |
CN111249274B (zh) | 银杏内酯b在制备胶质瘤细胞活性抑制剂中的应用 | |
US11730835B2 (en) | Method of preventing the development of melanoma | |
US20220000952A1 (en) | Method preparing antrodia cinnamomea extract and antrodia cinnamomea composition, and pharmaceutical composition | |
CN107708728A (zh) | 一种用于治疗胃癌的肿瘤疫苗及其制备方法 | |
WO2022151335A2 (zh) | 一种高压氧联合免疫药物用于肿瘤治疗的方法 | |
US20060039999A1 (en) | Pharmaceutical composition for inhibition of tumor growth or metastasis | |
CN116077496B (zh) | 紫草素联合cm-272在制备治疗肺癌药物中的应用 | |
TWI607751B (zh) | Statin compounds for the treatment of gastric cancer | |
CN115957204B (zh) | 二苯硫醚类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN111803482B (zh) | 鹿茸单体在制备抑制乳腺肿瘤骨转移的药物中的应用及药物 | |
US11827588B2 (en) | Compound, agent and composition for the suppression of cancer growth | |
CN116350674B (zh) | 一种预防Lewis肺癌早期肺转移的中药组合物及其应用 | |
RU2077888C1 (ru) | Способ лечения лучевой болезни у животных | |
CA3159001A1 (en) | Method of preventing the development of melanoma | |
WO2023029141A1 (zh) | 奥替尼啶双盐酸盐在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
WO2017011973A1 (zh) | 他汀类化合物用于治疗胃癌的用途 | |
US6395312B1 (en) | Echinops extract with anti-cancer activity | |
CN111450110A (zh) | 牛膝多糖在制备预防非小细胞肺癌转移药物中的应用 | |
CN114028380A (zh) | 柚皮素在制备治疗卵巢癌所致肠道菌群紊乱的药物中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190614 |