CN109862965B - 用于进行聚合酶链式反应的方法和用于进行该方法的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过反应体积中的聚合酶链式反应扩增核酸的方法，其中通过使用电能加热所述反应体积。在所述聚合酶链式反应的扩增循环的至少一个代次中，在变性步骤中用于加热所述反应体积的电能与所述反应体积的尺寸的比率为小于20焦耳每毫升。本发明进一步涉及包括用于接收反应体积的反应容器和由一个或多个与所述反应体积接触以将其加热的加热元件(1)组成的加热部件的装置的用途，其中至少一个所述加热元件与寡核苷酸(5)缀合以在反应体积中扩增核酸。最后，本发明涉及用于在反应体积中扩增核酸的装置，其包括用于接收所述反应体积的反应容器，和由一个或多个与所述反应体积接触以将其加热的加热元件(1)组成的加热部件。

Description

用于进行聚合酶链式反应的方法和用于进行该方法的装置
技术领域
本发明涉及用于在加热的反应体积中扩增核酸的方法。其进一步涉及具有用于接收反应体积的反应容器和加热部件(heating means)的装置用于扩增核酸的用途。最后，本发明涉及用于在反应体积中扩增核酸的装置，其具有用于接收反应体积的反应容器和加热部件。
背景技术
US 7569366 B1公开了通过聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸的方法，其中，在加热块上设置反应容器以将其预热至退火温度。反应容器装备有电阻导线线圈或薄膜形式的加热部件，其与反应容器中的反应体积直接接触以暂时加热其至延伸温度和变性温度。为此，向加热部件提供电流脉冲。脉冲持续时间至少为微秒级的，变性时间至少约为10微秒。在一个示例性实施方案中，脉冲持续时间为100mm(毫秒)，反应容器体积为200μl(微升)。
US 6586233 B2公开了一种用于进行PCR的系统，其具有高温区和低温区的室，和将高和低温区互相连接的管道。通过对流泵送，重复引导样品液体通过高和低温区以实现温度变化。
在用于公众查阅的国际申请特开WO 2007/143034 A1中，公开了一种光学诱导温度变化的适用于进行PCR的方法。其提出了例如使用钛-蓝宝石激光器的飞秒脉冲照射纳米颗粒或者使用氩离子激光器照射纳米颗粒或金膜。
在用于公众查阅的欧洲申请特开EP 2809806 A1中，公开了一种通过PCR在反应体积中的纳米颗粒上扩增核酸的方法，其通过激光激发散热。纳米颗粒与PCR引物缀合。
在用于公众查阅的德国申请特开DE 19543060 A1中，公开了一种适用于在高于电解质溶液的沸点的温度下在直接加热的导线形式的电极上进行电化学测量的方法。为此，使用短时强交流电脉冲加热样品至电解质溶液沸点以上的高温，同时剩余溶液的温度实际上不受影响。然后，局部超温迅速下降，从而避免电解质溶液的沸腾和其他干扰导致的影响。
在用于公众查阅的德国申请特开DE 199600398 B4中公开了一种适用于生化分析的方法，其中电化学传感器的电极在其表面使用核酸分子或其部分修饰，所述核酸分子或其部分用作检测靶序列的探针序列。通过交流电直接加热传感器，其中仅加热靠近电极表面的非常薄层的实验溶液，但大部分溶液保持在实际不变的温度。
在“Electrochemical detection of osmium tetroxide-labelled PCR-products by means of protective strands”,Talanta 74(2007)，393至397页中，Reske和Flechsig等人报道了一种用于对聚合酶链式反应产物进行电化学检测的方法。在此，首先进行常规PCR以扩增待检测DNA。然后，分离扩增的DNA双链并用电化学活性的四氧化锇联吡啶标记。将这些与金电极接触并在其上固定DNA-探针链。通过伏安法测量，作者试图检测标记链与探针链的杂交。
在“Electrochemical product detection of an asymmetric convectivepolymerase chain reaction”，Biosensors and Bioelectronics 25(2009)，400至405页中，Duwensee和Flechsig等人报道了一种通过对流进行PCR的方法。为此，引导铂丝通过样品管的下部区域并通过提供实验持续时间长达45分钟的热流加热至约89℃的温度。另外，在50℃温度的水浴中放置样品管。作者报道，在反应体积中出现两个中心轴与加热导线(heating wire)平行的涡旋(涡流)。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供用于加热的反应体积中扩增核酸的改进方法。本发明的目的还是提供具有用于接收反应体积的反应容器和加热部件的装置的新用途。最后，本发明的目的是提供具有用于接收反应体积的反应容器和加热部件的用于在反应体积中扩增核酸的改进的装置。
用于解决问题的方案
在本发明的一个方面，其目的是通过一种在反应体积中通过PCR扩增核酸的方法实现的，其中所述反应体积使用电能加热，其中，在PCR的扩增循环的至少一个代次中，在变性步骤中用于加热反应体积的电能与反应体积的值的比率为小于20焦耳每mL(毫升)。
本发明意义上的PCR为用于扩增核酸的方法，其中重复通过由变性、杂交和延伸步骤组成的扩增循环，并且实际上优选该顺序。在循环的每个代次中核酸分子的数量可增加(在最好的情况中通常加倍)，从而可出现核酸分子数量的指数增加。待扩增的核酸在下文称为“原型(original)”。原型为单链并且可与其被称为“互补物”的互补链一起形成双链。原型和互补物可为更大核酸的一部分。特别是在PCR中，在扩增循环的一个代次中产生的原型的拷贝可形成在其后代次中用于形成互补物的模板，并且产生的互补物的拷贝可作为模板用于在循环其后的代次中形成原型。扩增产物的通用术语为“扩增子”。
变性步骤用于变性核酸双链，即分离其成为两个单链。在变性步骤中，例如，原型可以从互补物分离。根据本发明优选的变性类型为热变性(也称为“熔融”)。为此，至少部分核酸双链或整个双链暴露于描述为“变性温度”的温度下，其导致或至少促使核酸双链的分离。一方面，选择的优选变性温度足够高可分离核酸双链。另一方面，选择的优选变性温度足够低使得可同样存在于样品中的DNA聚合酶不被显著破坏。变性温度的典型值为95℃。
为了便于本发明的下述说明，在本发明的术语中使用“变性步骤”描述方法中加热部件产生热以加热反应体积并通过该方法使得双链核酸分子变性的步骤。变性步骤的持续时间为加热部件在涉及变性步骤的PCR循环代次中产生热的相应时间的和。在使用加热电阻器作为加热部件的情况下，变性步骤的持续时间为通过加热部件传输电力以加热反应体积并导致双链核酸分子变性的持续时间。如果在扩增循环代次中的加热部件产生的热不为单一而是多个彼此分离的时间间隔(其可为优势，将在下文中说明)，变性步骤的持续时间为这些间隔持续时间的和。在通过该方式定义变性步骤中，即使存在的温度仍在变性所需范围内，特别是不包含基于加热部件自身的热容量的散热且反应体积与加热部件相邻的部分的温度不下降。这特别意味着，在根据本发明的方法中，变性同样可以发生在如此定义的变性步骤之后。同样意味着变性步骤的散热通常小于变性步骤中产生的热。
此外，PCR优选使用至少两种称为“引物”的寡核苷酸：正向引物和反向引物。正向引物与原型的3’端互补且反向引物与互补物的3’端互补。在杂交步骤(也称为“退火步骤”)中，正向引物和/或反向引物与其在原型或互补物或扩增子中的互补序列杂交。杂交步骤通常在导致或至少促进正向或反向引物与其在原型或互补物或扩增子中的互补序列杂交的温度下发生。优选选择促进尽可能特定的引物杂交的温度。杂交温度通常在50℃和72℃之间。
在延伸步骤中，杂交的引物通过聚合酶互补地延伸。因此，从正向引物开始可合成互补物，并从反向引物开始可合成原型。为达到延伸的目的，聚合酶暴露于促进或至少鼓励延伸的温度。当使用水生栖热菌(Thermus aquaticus,Taq)的聚合酶时，通常使用72℃的延伸温度。在PCR的一些实施方案中，杂交和延伸温度完全相同，即两个步骤在相同的温度下发生。(这意味着在PCR期间仅有两个温度水平，一个组合的杂交和延伸温度和一个变性温度。)
本发明上下文包括的术语“核酸”和“寡核苷酸”不仅为(脱氧)核糖核苷酸和(脱氧)寡核糖核苷酸，即使前述是优选的，但也为包含主链上具有修饰的一个或多个核苷酸类似物的核酸和寡核苷酸(例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯或肽核酸(PNA)，特别是在主链的糖上(例如2’-O-烷基衍生物、3’-和/或5’-氨基核糖、锁核酸(LNA)、己糖醇核酸、吗啉代、二醇核酸(GNA)、苏阿糖核酸(TNA)或三环-DNA–参见这方面相关文献，D.Renneberg和C.J.Leumann的论文“Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA”,J.Am.Chem.Soc,2002,124卷，5993-6002页，将其中的相关内容通过引用并入而视为本公开的一部分)，或包含例如7-脱氮嘌呤的碱基类似物，或例如硝基吲哚等通用碱基或例如N4-乙基胞嘧啶等经修饰的天然碱基。在本发明的一个实施方案中，核酸或寡核苷酸为与例如PNA等非核苷类似物的轭合物或嵌合体。在本发明的一个实施方案中，核酸或寡核苷酸在一个或多个位置包含非核苷单元，例如间隔子，如六甘醇或n在3与6之间的Cn-间隔子。如果核酸或寡核苷酸包含修饰，则选择这些修饰，使得其同样可以通过修改与天然DNA/RNA分析物杂交。优选的修饰影响熔融行为，优选熔融温度，特别是为了可以区分具有不同程度的碱基互补性的杂交体(错配判别)。优选的修饰包括核酸或寡核苷酸中的LNA、8-氮杂-7-脱氮嘌呤、5-丙炔基-尿嘧啶和胞嘧啶和/或无碱基中断或修饰。本发明意义上的进一步修饰为例如用生物素、硫醇和荧光供体和荧光受体分子修饰。
根据本发明的方法发生在反应体积中。这意味着在本发明的意义上，核酸的扩增发生在至少部分的内聚反应体积中。反应体积为除溶剂或悬浮介质外的液体溶液或悬浮液，优选水，通常还包含待扩增核酸(下文同样使用“靶核酸”)。其通常还包含原型和互补物和/或例如聚合酶、dNTP和盐等可以悬浮或溶解的其他构成部分。
在本发明意义上的“用于加热的电能”为直接或间接用于加热反应体积的能量。根据该定义，其通常与提供至反应体积的热不同。例如当使用加热电阻器作为加热部件时，几乎不发现或不根本不会发现该差异，因为在该情况下，用于加热的电能几乎完全以适当设置加热电阻器的方式通过电流转化为加热电阻器中的热，用于加热的电能可以几乎完全提供至反应体积。然而，在例如来自EP 2809806 A1的已知方法的情况中，可高度感知差异，其中激光激发纳米颗粒用于散热，因为在这种情况下用于加热的电能为操作激光的电能，并且直到绕过激光和纳米颗粒才加热反应体积。由于通过激光和纳米颗粒的绕行效率低，仅一小部分用于加热的电能实际作为热提供至反应体积。
在参考本发明相关“加热反应体积”的情况下，其不一定意味着在本发明的意义上必须加热整个反应体积，更不必均匀加热。相反，不均匀加热或仅加热部分反应体积同样视为本发明意义上的加热反应体积。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过在反应体积中通过PCR扩增核酸的方法来实现，其中加热部件由一个或多个电接触的与反应体积接触并加热反应体积的加热元件组成，其中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，加热部件向所述反应体积供给的、在变性步骤中生成的热小于CR＊5℃(摄氏度)。CR为反应体积在通过加热部件加热期间的热容量(此处和下文中，主体的热容量通过大写字母“C”表示，但比热容用小写字母“c”表示)。换而言之，在不考虑其他热流入和流出的情况下，加热部件以平均小于5℃加热反应体积。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过在反应体积中通过PCR扩增核酸的方法来实现，其中加热部件与反应体积接触并加热反应体积，其中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，在变性步骤中发生的平均温度的最大增加(下文也称为反应体积的“MGTE”)为低于10℃。
在本发明意义上的加热部件因而为加热元件的总和。本发明意义上所述“接触”意为，相对于加热元件和反应体积，反应体积与加热元件相邻的区域。如果加热元件包括设置在加热元件的发热组件和反应体积之间的材料(下文也称为“分离层”)，“接触”意为加热元件通过该分离层的面向反应体积的面与反应体积接触。加热元件和反应体积之间的这种接触可以实现的优点是反应体积在加热元件附近被加热元件加热。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过在反应体积中通过PCR扩增核酸的方法来实现，其中加热部件由一个或多个与反应体积接触并加热反应体积的加热元件组成，其中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，加热部件向所述反应体积供给的、在变性步骤中生成的热小于CR＊5℃，其中CR为反应体积在通过加热部件加热期间的热容量，并且在整个变性步骤期间，对于加热部件与反应体积的接触面积的至少10％并不是建立瞬时稳定的温度的。
温度梯度视为，在通过加热元件加热的起始t0之后的一个时间点t1，如果其在时间t2＝t0+2＊(t1-t0)的最大倾斜(incline)量相对于其在时间点t1的最大倾斜量的变化小于20％，为本发明意义上的“瞬时稳定”。为确定瞬时稳定性，仅比较相关的最大梯度量，而不是加热部件是否在时间点t2产生热。优选地，在时间点t2的梯度量的变化小于10％，特别优选小于5％，特别优选小于3％，特别优选小于1％。梯度通常在加热部件的表面具有其最大倾斜。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过使用如下用途来实现：包括用于接收反应体积的反应容器和由一个或多个与反应体积接触以将其加热的加热元件(1)组成的加热部件的装置，用于反应体积中核酸的扩增，其中至少一个加热元件与寡核苷酸缀合。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过用于在反应体积中扩增核酸的装置来实现，其中所述装置包括由一个或多个可与反应体积接触以加热其的加热元件组成的加热部件。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过用于在反应体积中扩增核酸的装置来实现，其中所述装置包括由一个或多个用于使用电能加热反应体积的加热元件组成的加热部件和用于将电能引入装置中的部件，其中设计装置使其在任何时间点的电功耗不超过50W(瓦特)。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过用于在反应体积中扩增核酸的装置来实现，其中所述装置包括用于接收反应体积的反应容器、由一个或多个用于使用电能加热反应体积的加热元件组成的加热部件、和用于将电能引入装置中的部件，其中设计装置使得其电功耗和反应容器容量之间的比率在PCR期间任何时间点不超过1W/ml(瓦特每毫升)。该限制不适用于装置接通过程中由基于技术的启动电流导致的可能更高的功耗。这类增加的功耗不认为是PCR期间的功耗，因此在此不作考虑。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过借由PCR扩增反应体积中的核酸的装置来实现，其中所述装置包括用于接收反应体积的反应容器、由一个或多个加热电阻器组成的加热部件、和将电流施加至加热部件以加热反应体积的控制装置，其中设计控制装置使得在PCR扩增循环的至少一个代次中，在变性步骤中通过控制装置施加至加热元件的电能与反应容器容量的比率为小于40J/mL(焦耳每毫升)。
在本发明进一步的方面，本发明的目的通过借由PCR扩增反应体积中的核酸的装置来实现，所述装置包括用于反应体积的反应容器、由至少一个加热元件组成的用于加热反应体积的加热部件、和为控制加热部件向反应体积散热的控制装置，其中设计控制装置使得PCR扩增循环的至少一个代次中，在变性步骤中通过加热部件向反应体积发散的热量和用于接收反应体积的反应容器容量之间的比率小于20J/mL，并且加热部件的至少一个加热元件具有在至少一个方向上的大于1.5μm(微米)的膨胀。
除其他以外，本发明基于本发明人的认知，即，在已知的扩增方法中，核酸扩增不同步骤所需要建立的反应体积温度所需的热能化持续时间对方法持续时间做出极大贡献，并且可以通过缩短这些阶段以缩短方法持续时间。进一步地，基于本发明人的认知，当PCR所需的一个或多个温度仅在部分反应体积中实现时，该方法同样可以有效进行。本发明同样基于如下认知：其可以在使用能量显著低于现有技术的情况下实现。
特别是通过本发明可以实现-例如借助于短电脉冲-仅将加热部件的加热元件的直接附近短时加热，优选地为了在反应体积中进行核酸分子的变性，同时大部分反应体积保持在(在这种意义上为“整体”)基础温度，在其中可以发生特别是延伸，同样优选杂交。这优选通过以下来实现：通过加热部件加热的持续时间短使得周围的反应体积中出现的热场(thermal field)仅可传播几微米并以这种方式创建加热区，其优选包括仅一小部分的反应体积。特别是带来的热量可以很低使得反应体积中没有实质的整体加热发生。
本发明意义上的“整体温度”意为相对于体积而言是反应体积的平均温度，因此该温度是在反应体积热能化后在其中建立或将建立的。“整体加热”是在通过该方式定义的整体温度中的增加。
此外，本发明可以实现，在加热后，特别是在变性步骤中，带来的热从加热区传播至剩余的反应体积中，仅在此导致可以忽略的整体温度增加。“可以忽略”在此特别意为温度增加对于核酸分子的变性优选过低且特别优选温度增加过低而不会干扰杂交和延伸。
变性和同样优选的核酸扩增的其他步骤可以因此在加热元件的直接附近局部发生，其中在加热部件上固定至少一个所需引物(在下文中称为“官能化”)，以允许扩增子也在此处形成并因此促进局部加热变性。换而言之，即加热部件官能化，PCR步骤特别是杂交、延伸和/或变性的局部化，以及同样优选产生信号以观察PCR进程，是在加热部件的直接附近实现的，由于基于该事实，反应体积的加热可以限制在反应体积的一部分。
通过本发明可以实现更加快速地扩增核酸。特别是，与持续许多秒加热与冷却过程的常规热循环方式相反，通过本发明可以实现，PCR持续时间不再由例如加热和冷却速率的技术限制决定。由于在加热部件的附近不断产生热，反应容器的热能化时间同样可以忽略。本发明人确定，即使在PCR扩增循环有40代次的情况下，核酸分子的变性和其冷却至延伸和杂交温度总共仅需几毫秒。通过本发明可以实现，PCR的持续时间主要由用于扩散和反应过程所需变性步骤和例如通过聚合酶延伸的生物化学过程之间的持续时间决定。
通过本发明还可实现可以使用较低的能量扩增核酸。此外，本发明可更有效控制扩增过程并且例如广泛避免已知方法中的控制温度内发生的反应体积的温度波动。本发明可以提供成本效益更好和更紧凑的用于扩增核酸的装置。例如，其可以实现提供通用串行总线(USB)棒形式的根据本发明用于扩增核酸的装置。
本发明优选的实施方案
从属权利要求的主题为可以单独或相互结合使用的优势实施方案和细化方案。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，在变性步骤中用于加热反应体积的电能与反应体积的尺寸的比率为小于20J/mL，优选小于10J/mL。通过本发明的该实施方案，可有利地实现根据本发明的方法的低能耗。另外，在变性步骤中添加的能量如此大使得可有利避免反应体积的过度整体加热。
在本发明的的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，在变性步骤中用于加热反应体积的电能与反应体积的尺寸的比率为0.01和30W/mL(瓦特每毫升)之间，优选0.05和10W/mL之间，特别优选0.1W和5W/mL之间。
在本发明一个实施方案中，变性步骤包括多个彼此间隔开的时间间隔，其中加热部件在涉及变性步骤的PCR循环代次中产生热。在不同情况下，电流脉冲的时间间隔的基于时间的距离相对于样品热能化时间必须非常小；特别优选地，必须选择电流脉冲的时间间隔的基于时间的距离使得加热部件在时间间隔之间的温度减少小于20％。例如如果开关电源用于能源供给，本发明的该实施方案可以是有利的。特别优选通过电流脉冲或多个电流脉冲实现变性步骤，其中在优选实施方案中在持续时间或电流脉冲期间的电流强度的绝对量的变化小于10％。该方法中，可以实现反应体积的加热的平滑动态。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，在变性步骤中用于加热反应体积的电能与反应体积的尺寸的比率为大于10mJ/mL(微焦耳每毫升)，优选大于30mJ/mL并且特别优选大于100mJ/mL。在一个具有恒定电功率的实施方案中，由该使用的电功率和变性步骤的持续时间的乘积简单计算能量。本发明的该实施方案可获得的优势在于，能量足够大以操作具有与反应体积接触面积的加热部件，其尺寸足以满足实践中常见的PCR反应动力学。
优选在PCR扩增循环的至少一个代次中，特别优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，加热部件向反应体积供给的、在变性步骤中生成的热小于CR＊5℃(摄氏度)。CR在此为通过加热部件加热期间反应体积的热容量。换而言之，如果不考虑其他流入或流出的热量，加热部件将反应体积加热平均小于5℃。
优选在PCR扩增循环的至少一个代次中，特别优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，反应体积的最大MGTE为小于10℃，特别优选小于7℃，特别优选小于5℃，特别优选小于4℃，特别优选小于3℃，特别优选小于2℃，特别优选小于1℃，特别优选小于0.75℃，特别优选小于0.5℃和最特别优选小于0.3℃。
MGTE的值为4℃和更高可为有利的，特别是如果PCR期间组合的杂交和延伸温度增加(例如因为PCR期间加热元件上的局部扩增子密度大幅增加)，即同样为了通过局部加热(些微)改变整体温度。另外，通过该方式可以例如通过温度调节块减少外部提供的热功率，其可进一步降低根据本发明的装置的总功率需求。MGTE的低值可为有利的，以便可以非常快速连续地一个接一个地进行PCR扩增循环的代次，或者，以便可以将样品与附近很好地绝热并因此使其独立于环境条件。如果例如组合的杂交和延伸温度为70℃并且反应体积在变性步骤后体积平均温度增加至70.6℃，则这里的MGTE＝0.6℃。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，在变性步骤期间，在加热部件与反应体积的接触表面的至少10％、优选至少30％、特别优选至少50％、特别优选至少80％并不是建立瞬时稳定的温度梯度的。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，在变性步骤至少一半的持续时间中，温度梯度的最大倾斜为大于0.5℃/μm，特别优选大于1℃/μm，并且最特别优选大于3℃/μm。本发明的该实施方案的一个可实现的优势为实现良好的通过加热元件带来的温度增加的局部化，作为形成梯度所必须的温度增加的局部化(因此在该实施方案中温度梯度不必须瞬时恒定)。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选在至少三个中特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，在变性步骤至少一半的持续时间中，温度梯度的最大倾斜为小于1000℃/μm，特别优选小于300℃/μm。本发明的该实施方案的一个可实现的优势为可以避免溶液中的热泳效果。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，循环持续时间tc为短于60s(秒)，优选短于40s，特别优选短于20s，特别优选短于15s，特别优选短于10s。在本发明意义上，循环持续时间tc为由变性、杂交和延伸以该顺序的步骤组成的聚合酶链式反应的扩增循环代次的持续时间。通过选择特别短的循环持续时间tc，在本发明的该实施方案中可以实现特别迅速的PCR方法。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选在至少三个中，特别优选在至少10个中，特别优选在至少20个中，PCR的持续时间tPCR为短于45分钟，特别优选短于30分钟，特别优选短于20分钟，特别优选短于15分钟并且特别优选短于10分钟。所述持续时间为PCR从起始至结束的时间，其中PCR的起始为在由变性、杂交和延伸以该顺序的步骤组成的扩增循环的第一完整代次的变性步骤的起始时间点，并且PCR的结束时间为具有变性、杂交和延伸以该顺序的步骤的扩增循环的最后完整代次的变性步骤的结束。
加热部件
在本发明的优选实施方案中，通过由一个或多个加热元件构成的加热部件加热反应体积，其中特别优选加热元件或至少一个加热元件、特别优选全部加热元件为电接触。通过该方式可以有利地实现电流可以流过加热元件。本发明的该实施方案可以利用通过电控制装置可特别简单地操作或调节电接触加热元件的事实。
加热元件或加热元件之一优选为例如通过其欧姆电阻将电流转换为热的装置。本发明的该实施方案可以开发这类加热元件可有效将电能转换成热的事实。优选加热元件为加热电阻器或珀耳帖元件。在多个加热元件的情况下，这些加热元件可以串联或并联、或部分串联和部分并联地配置。
优选的加热元件可以具有设置在加热元件的发热组件和反应体积之间的材料。这类材料可用于保护加热元件免受例如与PCR化学物质的腐蚀或其他化学相互作用和/或使其电绝缘(因此描述为“分隔层”)，并且可由例如聚合物组成。优选地，这类加热元件和反应体积通过厚度小于500μm的分隔层最大地分隔，优选厚度小于100μm，优选厚度小于20μm，优选厚度小于5μm，优选厚度小于1μm，优选厚度小于0.2μm，优选厚度小于0.05μm。最特别优选的是另一实施方案，其中在加热元件和反应体积之间不存在分隔层，或其中选择分隔层的热性能使得其对于加热部件向反应体积散热的影响为可以忽略的。
其可有利地在加热元件上任何地方尽可能达到均匀或稳定的温度。这可以在加热电阻器的情况中实现，例如在加热电阻器每个子件(sub-piece)或子体积(sub-volume)中，促进加热期间的平均电流密度或恒定表面/体积比率(OVV)。这可有利地实现在整个加热元件中确保恒定导体截面积和导体的每单位长度的恒定电压下降。在多个加热元件的情况中，在本发明的优选实施方案中这些以相同方式加热反应体积。然而，本发明同样包括加热元件以不同方式加热反应体积的实施方案，例如通过不同时间长度和不同强度。加热部件的加热元件例如关于其长度或几何结构可相同或不同。
反应体积优选通过由一个或多个加热元件组成的加热部件加热，其中特别优选加热元件或至少一个加热元件、特别优选全部加热元件与反应体积接触。在本发明的优选实施方案中，至少一个加热元件在其整个表面上抵接反应体积。特别优选全部加热元件在其整个表面上抵接反应体积。本发明的该实施方案的可实现的优点为反应体积可以通过加热元件附近相应的加热元件有效地加热。通过本发明的该实施方案同样可有利地实现的是，为确保高反应动力学(特别是核酸分子与引物的杂交动力学，如下所述，其优选配置在加热元件上)，加热部件具有尽可能大的可及表面。
为了尽可能有效促进散热至(直接)附近，加热元件优选具有尽可能高的表面/体积比率(OVV)，并且同时具有尽可能低的体积以确保加热元件的低热容量。根据本发明的优选实施方案的加热元件的表面/体积比率为大于103m-1(每米)，优选大于104m-1和特别优选大于5*104m-1。然而，表面/体积比率过高可在一些情况下导致非常精细并且因此机械上不稳定的结构，因此根据本发明可以有利地保持表面/体积比率小于109m-1，优选小于108m-1并且在一些情况下甚至小于107m-1。
对于长导线线材(长度远大于直径)，例如以2/r计算表面/体积比率，其中r为导线的半径。对于薄膜或箔(厚度远小于长度和横向膨胀)，通过1/d计算表面/体积比率，其中d为膜或箔的厚度。对于上述实施方案，根据本发明优选仅考虑与反应体积接触的表面。同样优选仅考虑其表面与反应体积接触的体积(即，例如，根据本发明不将不通过溶液的入口管线作为相关体积和表面)。同样也相应地适用于随后考虑体积填充因子和热容量。
在本发明的优选实施方案中，加热部件与反应体积接触的表面和反应体积之间的比率为大于0.1m-1，特别优选大于1m-1，特别优选大于5m-1，特别优选大于10m-1，特别优选大于20m-1，特别优选大于50m-1，特别优选大于100m-1。本发明的该实施方案使得可以有利地实现有利的反应动力学，这是因为在反应体积的大部分中，反应体积的组成部分可以通过扩散快速到达加热元件的表面以参与在此处发生的核酸扩增方法的步骤。另外，在以下进一步描述的情况中，对于通过一个反应参与物(reaction partner)(例如引物)至少部分地在其表面上官能化的加热元件，可利用通过更大表面还可获得更多反应参与物的事实。
为了避免加热元件结构变得太精细或位于反应体积中的核酸分子和其他反应物的运动受到过多表面的阻碍，在所述比率中加热元件或多个加热元件的表面与反应体积的尺寸的比率为小于106m-1，特别优选小于105m-1，特别优选小于104m-1，最特别优选小于103m-1。
为了将在变性步骤中通过加热部件供给至反应体积的热保持在尽可能低，有利的是还保持加热部件的热容量低，这是因为为了实现加热元件表面上一定的温度升高：需要越来越多的能量，加热部件的热容量越大。在变性步骤中通过加热部件供给至反应体积的能量随后在整个反应体积上传播。通过相应体积和从其中产生相应体积的相应材料的比体积热容的乘积给出加热元件的热容量。加热部件的配置的显著地自由度在于其大小。
因此，可以有利地保持尽可能低的加热部件体积，特别是材料厚度。在这方面值得注意的是，热扩散范围不取决于加热部件的尺寸而是仅取决于加热持续时间。在本发明的优选实施方案中，加热部件的全部加热元件的体积相对于反应体积为小于10％，优选小于5％，特别优选小于3％且最特别优选小于1％。通过本发明的该实施方案，可以有利地通过低体积填充因子实现加热部件的低热容量。
在本发明的优选实施方案中，加热部件包括多个导体由反应体积包围、电流流过其中的配置。在此可以有利地实现的是，加热部件可在反应体积的许多不同位置或部分有效。这在PCR起始时仅具有极低浓度的待扩增核酸分子并且因此这些分子与最近的加热元件的平均距离长的典型情况下特别有利。可以估计长度为100碱基对的核酸单链通过扩散从起始点移动其自身通过距离x所需时间t＝x2/DDNA(其中DDNA≈10-11m2/s)。在本发明的优选实施方案中，反应体积中已知点与最近加热元件的空间距离为小于3mm(毫米)，优选小于2mm，特别优选小于1mm，特别优选小于0.75mm，特别优选小于0.5mm和特别优选小于0.25mm。
在本发明实施方案中，单个或全部加热元件由导电金属或金属合金或其他低电阻率的导电材料，例如碳、半导体材料或导电塑料制成。
在一个实施方案中，单个或全部加热元件由仅一根导线或一个电导体或多个导线或电导体组成。这些可为直的、弯曲的或卷绕成线圈的。多个导线或电导体彼此之间可以具有相等或不相等的距离，可彼此交叉或不彼此交叉。每个导线或电导体可具有圆形、椭圆形、平面或任何其他截面。加热元件同样可轻易通过，即通过表面区域，例如金属阻尼的平坦表面。
加热部件的特别优选的实施方案为导电性金属导线的配置或阵列，优选周期性配置。导线特别优选彼此平行配置。阵列的导线优选具有0.5和100μm(微米)之间的直径，特别优选1和50μm之间。导线优选彼此间隔50和1500μm之间。
导线优选由金或其他金属制成，或将它们设计为护套导线，其中芯由更便宜且更稳定的材料、优选金属组成。特别优选具有不锈钢、钼或最特别优选具有以优选金的惰性材料为护套的钨芯的护套导线。由于芯的高强度，这类导线可有利地设计得非常薄(并且因此具有高表面/体积比率)，但仍通过护套材料促进优选不锈钢护套的所需化学特性。特别优选具有钨芯的护套导线(钨有利地具有相对于金高得多的拉伸强度)，其中优选5和40μm之间的芯直径和0.1和2μm之间厚度的金护套。
在其他实施方案中，金属箔用作加热元件，其横穿反应体积并例如通过冲压/打孔、电铸、激光或水射流切割、蚀刻技术或其他方法设计成点阵(lattice)。
在本发明的其他实施方案中，加热元件适用于不导电或导电性差的材料。优选加热元件由金属薄膜制成，其通过PVD、通过压力方法或其他方法化学地电气地施用于非导电结构。非导电结构可以例如设计成非常精细的注射成形部件(优选结构尺寸为小于300μm)或通过快速成形法。同样可以考虑使用织物结构作为加热元件或加热元件用载体。特别地，用作加热元件或加热元件用载体的这类材料具有20μm和3mm之间的网格尺寸，特别优选在100μm和1.5mm之间。如果织物结构本身为导电的，可有利地利用它们整体作为加热元件。如果它们由非导电性材料(例如塑料)制成，可将其镀金属使得电流仅流过薄表面层(通常<10μm)并且因此存在大表面。换而言之，点阵的织物的导线或纤维具有相对大的表面，但仅主动加热薄的、施加金属的体积。在本发明意义上，仅电流本质上流过的部分视为加热元件。如果例如蒸镀具有金膜的PMMA的塑料结构，则仅金膜视为加热元件。
加热部件的官能化
在本发明的优选实施方案中，加热部件的至少一个加热元件与寡核苷酸缀合，即寡核苷酸与加热元件连接。特别优选加热部件的全部加热元件与寡核苷酸缀合。通过该方式可以有利地实现作为根据本发明方法的一部分的寡核苷酸通过加热部件特异性加热，而不必加热整个反应体积。在本发明的特别优选的实施方案中，加热元件与引物缀合，最特别优选与PCR方法的正向和反向引物缀合。本发明的优选实施方案中，正向引物但无反向引物附着于加热元件或部分加热元件，和/或反向引物但无正向引物附着于加热元件或部分加热元件。在各个情况下，其他引物分子可以自由悬浮在反应体积中。如果分隔层用于加热部件的发热组件和反应体积之间，官能化必须以寡核苷酸可从液体体积接近的方式实现，即它们优选附着于分隔层的表面。
在进一步优选的实施方案中，至少一个加热元件与正向引物缀合并且同样与反向引物缀合。在特别优选的实施方案中，加热部件的全部加热元件与正向引物缀合并且同样与反向引物缀合。通过本发明的该实施方案，可以有利地实现正向引物与相同加热元件的反向引物杂交的PCR产物，仅需要短距离行进，使得可以更快发生杂交并且因此可以更快进行PCR法。
在本发明的优选实施方案中，在加热元件表面提供有允许核酸键合的材料。例如镀金表面可用于在加热元件上通过一个或多个硫醇键结合引物。另外，例如链霉亲和素生物素键可用于将引物结合至加热元件，如果例如优选预先将两个参与物之一(链霉亲和素或生物素)结合至加热元件并且通过两个参与物中的另一个修饰引物(在5’端)并且因此随后键合至加热元件。其他例如氨基或羧基的修饰也可用于将引物结合至加热元件；为此目的，加热元件的表面可以例如优选预先通过环氧树脂修饰。优选以引物5’端与加热元件键合的方式实现键合，使得3’端为游离的并且因此在PCR期间通过聚合酶延伸。
正向引物和反向引物均固定在加热元件上的实施方案中，可以有目的地选择不同类型的引物分子之间的距离，使得它们彼此间隔一定距离，例如小于1nm(纳米)，小于3nm，小于5nm，小于15nm和小于50nm。通过该实施方案可以有利利用的是，一旦正向引物在加热元件表面上延伸，该新写成的核酸链在变性后与表面上相应相邻的反向引物分子或附近的反向引物分子杂交。由于这个过程发生在加热元件的表面，局部浓度极高。因此，新核酸链不需要为找到反向引物分子而通过扩散移动很多微米，因为在直接附近-仅几纳米远-存在多种反应参与物(反之亦然，同样适用于在附近寻找固定正向引物分子的延伸的反向引物分子)。
在一个实施方案中，除引物分子外，为了防止扩增子或靶核酸与加热元件表面的非特异性(因而不通过引物的靶向杂交)结合，在加热元件上还存在填充寡核苷酸或填充分子，即在PCR中不主动参与作为引物或荧光探针或靶核酸而仅用于表面饱和或钝化的寡核苷酸和分子。填充寡核苷酸优选具有5和50核苷酸之间的长度，特别优选在10和40核苷酸之间并且最特别优选在20和30核苷酸之间。特别地，它们可由仅一种核苷酸类型组成，例如30腺嘌呤碱基的A30序列。为了在加热元件表面固定填充分子，填充分子可为例如生物素或聚乙二醇，例如另外提供有例如硫醇等官能团。然而，填充分子还可为例如牛血清白蛋白。
在该方法进一步优选的实施方案中，加热元件上的寡核苷酸具有作为子序列的间隔序列。因此间隔序列在相应的寡核苷酸面对加热的一侧上。因此间隔序列用于剩余寡核苷酸的间隔子。在优选实施方案中，寡核苷酸包含具有引物功能并被称为引物序列的子序列和为间隔序列的子序列。由于引物序列通过间隔序列与加热元件更远的隔开的事实，待扩增核酸和DNA聚合酶有利地更好接近引物序列。
根据本发明方法的的优选实施方案中，在间隔序列和引物序列之间具有一个或多个非碱基(无碱基)修饰，这些无碱基修饰防止通过聚合酶重写(overwriting)间隔序列。专利申请DE 102013215168 A1在这方面的内容通过对其的引用而视为本公开的一部分。这样的修饰可为例如1’,2’-二脱氧核糖(dSpacer)、三甘醇间隔子(间隔子9)或六甘醇间隔子(间隔子18)，其防止在3’方向上进一步的聚合酶活性。通过该方式可以实现间隔序列不作为用于通过聚合酶合成的核酸链的模板并且产生的PCR产物不变得不必要的长。延伸的PCR产物还包含间隔序列的互补序列，则将具有与纳米颗粒上寡核苷酸的熔融温度显著增加和在随后的杂交步骤中将不必要地非特异性杂交，并且因此使得整个PCR更加非特异性。
加热的持续时间
通过加热部件的供热优选在PCR期间变化。通过加热部件的供热特别优选在PCR扩增循环的至少一个代次期间变化，特别优选在PCR扩增循环的至少三个代次、特别优选至少10个、特别优选至少20个期间，特别优选周期性地。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选至少三个中，特别优选至少10个中，特别优选至少20个中，在变性步骤中通过加热部件加热的持续时间(下文中在变性步骤中通过加热部件加热还称为“热脉冲”)，为100ns(纳秒)和30ms之间的间隔，特别优选0.5μs(微秒)和10ms之间，特别优选1μs和5ms之间的间隔，特别优选1μs和3ms之间，特别优选1μs和1ms之间，特别优选1μs和800μs之间，并且最特别优选1μs和500μs之间的间隔。本发明的该实施方案可实现的优势为加热的局部化和因此导致的温度分布。换而言之，由于加热持续时间短，有限的热通过加热元件借助于热扩散传输至溶液中。同时，本发明的该实施方案可以实现加热持续时间不为太短，使得在局部加热期间允许足够的核酸双链熔融或解离(extrication)，和/或可以在局部加热期间，两条单链可以通过布朗运动(和/或其他力)彼此移动足够远使得不再彼此重新杂交。
在本发明的优选实施方案中，变性步骤的持续时间仅占PCR总持续时间的一小部分。在PCR扩增循环的至少一个代次期间，特别优选在PCR扩增循环的至少三个代次期间、特别优选至少10个期间、特别优选至少20个期间，变性步骤的比例为小于PCR扩增循环的整个代次实际时间的10％，此外，优选小于5％，特别优选小于3％，特别优选小于1％，特别优选小于0.5％，特别优选小于0.05％，并且特别优选小于0.01％。通过本发明的该实施方案，可以有利地实现在几乎整个PCR持续时间中发生杂交。由于局部PCR中的聚合酶可几乎在整个持续时间起作用，因此可以缩短过程时间。由于仅在局部实现加热并且加热非常短，同样可以实现保护参与的聚合酶和其他反应参与物使其更慢失去持续合成能力(processivity)。
在本发明的优选实施方案中，在扩增循环的至少一个代次期间，特别优选在PCR扩增循环的至少三个代次期间、特别优选至少10个期间、特别优选至少20个期间，变性步骤的持续时间theat为短于theat≤(s1·|x|)2/D，其中s1为比例因子，|x|为临界距离，D为温度传导率。比例因子s1优选s1＝100，特别优选s1＝10，特别优选s1＝1，特别优选s1＝0.1，特别优选s1＝0.01。临界距离|x|为与加热部件最近的间接相邻部分的距离，例如与加热部件最近的加热元件的距离。如果加热元件构建自2D结构(例如点阵、织物、蜂窝等)，则网格尺寸或孔/凹缝的尺寸为相关值|x|。如果加热元件由3D结构组成，则孔径为相关值|x|。
通过本发明的该实施方案可以实现，加热持续时间很短使得热扩散范围远小于平均距离|x|，因此加热部件的相邻加热元件或者大体相邻、非邻接(non-abutting)部分的热场不重叠。特别地，比例因子大于1对于非常长的扩增子可以是有利的，其中两个核酸链的解旋需要更长时间(直到核酸双链可通过布朗运动解旋所需的时间)增加至长度的四次幂。比例因子低于1可有利于最佳可能的加热和冷却动态。
电力储存器
配置根据本发明的优选装置使其电功耗在PCR期间任何时间不超过50W，特别优选20W，特别优选10W，特别优选3W，特别优选2.5W，特别优选1.5W，特别优选0.5W。该限制不适用于装置接通过程期间可能更高的功耗，这可能是由于接通电流的技术原因导致的。这样增加的功耗不视为PCR期间的功耗，因此在此不予考虑。通过本发明的该实施方案可以有利地实现在普通便携式电源上操作该装置，例如在汽车蓄电池上、汽车点烟器上或者PC、平板电脑或移动电话的端口上，例如在USB或Apple闪电接口上操作。
装置优选包括电力储存器。优选设计为保存在电力储存器中的电能相对于反应容器的容量为大于0.1J/mL，特别优选大于1J/mL，特别优选大于2J/mL，特别优选大于3J/mL。用于加热部件电力需求的、同样由于供热的变化而变化的电力可以通过电力储存器中间储存。
根据本发明的包括电力储存器的装置，优选设计为保存在电力储存器能量中的电能相对于反应容器的容量为小于100J/mL，特别优选小于50J/mL，特别优选小于30J/mL。本发明的该实施方案可利用如下的事实：由于通过加热部件的特别有效的加热，电力储存器可具有小的配置。通过该方法，根据本发明的装置可有利地设计为特别紧凑、成本效益好并且便携。
优选的电力储存器包括一个或多个电容器、线圈或电池或前述的组合。在本发明的优选实施方案中，能量储存的储存容量配置为可以有效形式保存至少20％，特别优选至少40％，特别优选至少50％，特别优选至少60％，特别优选至少80％，特别优选至少100％，特别优选至少150％，特别优选至少200％，特别优选至少300％的PCR扩增循环代次的变性步骤所需的电能。通过本发明的该实施方案，可以避免必须使在整个变性步骤持续时间期间内提供变性步骤所需电能的电源可用的情况。反而，有利的是，在变性步骤之间的时间中，其通常比变性步骤持续时间长得多，可以为电力储存器充电。以该方式可以实现根据本发明的装置可装备有相对于其电力输出较弱的电源，例如装备有较弱的网络装置。如果电力储存器提供小于100％的用于PCR扩增循环代次的变性步骤所需能量，可有利地在变性步骤期间保持非常小，但剩余能量必须通过另外的相应尺寸的例如电力网络连接等电源提供。100％和更高的值为有利的，这是因为供给电容器的电源则可以相应地保持得小，另外电压不由于加热的负载而崩溃。特别地，可以有利地实现根据本发明的装置的电源仅需要具有如下的尺寸，使得其可以提供用于PCR扩增循环持续时间内、但还不是在显著更短的变性时间内的变性步骤所需的能量。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选至少三个中，特别优选至少10个中，特别优选至少20个中，装置的电功耗和反应容器容量之间的比率在PCR期间任何时间不超过1W/mL，优选0.5W/mL，特别优选0.25W/mL，特别优选0.1W/mL。该限制不适用于装置接通过程期间可能更高的功耗，这可能是由于接通电流的技术原因导致的。这类增加的功耗不视为PCR期间的功耗并且因此在此不予考虑。
在本发明的优选实施方案中，电力储存器配置为可以任何形式保存的用于在至少5个、特别优选至少10个、特别优选至少20个、特别优选至少40个、特别优选至少100个PCR扩增循环代次中变性步骤的能量。以该方式，可有利地创建可独立于其他电源进行一个或甚至几个聚合酶链式反应的装置，特别是便携装置。
优选电容器为高容量电容器，优选电解质电容器或超级电容器，特别优选具有低ESR值。这类电容器可在市场上成本效益好地获得并且易于尺寸化。例如，使用式
Figure GDA0003559070300000221
或者
Figure GDA0003559070300000222
可以计算2222μF(微法拉)电容、30V电压U的足以提供1J(焦耳)电能的电容器-根据用于1mL反应体积的变性步骤的实施方案，这足以几乎无损耗地将电能转化为热。然而，电容器则将在热脉冲结束时完全放电，因此在实践中如果电源不能提供相当大部分的功率，推荐使用至少1.5倍高电容的电容器。
根据本发明的优选电力储存器中，电容器的电容或在多个电容器情况中为该多个电容器的电容的和，为大于100μF，特别优选大于200μF，特别优选大于500μF，特别优选大于1mF(毫法拉)，特别优选大于1.5mF。在根据本发明的优选能量储存器中，电容器的电容或在多个电容器情况中为该多个电容器的电容的和，与反应体积的尺寸之间的比率为大于0.01mF/mL(毫法拉每毫升)，特别优选大于0.1mF/mL，特别优选大于1mF/μL，特别优选大于5mF/mL，特别优选大于10mF/mL。通过本发明的该实施方案，可以有利地中间储存足够能量以实现在变性步骤中加热元件的充分加热。
特别优选的电池为高电流电池或蓄电池，特别为锂聚合物蓄电池、锂离子或磷酸锂铁蓄电池。本发明的一个实施方案中，电池/多个电池与一个或多个电容器一起使用。在其他实施方案中，电池/多个电池特别优选为磷酸锂铁蓄电池，其特征在于有利地低的内电阻并且未另外使用电容器。为了减少入口管线的引起干扰的电感和欧姆电阻，根据本发明，如果在电容器和/或电池和远至加热元件之间运行的入口管线尽可能短，则可以为有利的。
反应容器
用于扩增核酸的优选装置具有用于接收反应体积的反应容器。根据本发明方法的适合的反应容器可为例如PCR管或PCR管的复合体(例如所谓的8联管)或多孔板等常规PCR反应容器，但还可为例如平板或其他可填充的形状/形式。加热部件可以已在生产过程(例如注射成形)中进入反应容器，例如穿过多孔板或PCR管的壁的导线，或者在生产过程后添加(例如在线圈形式的导线情况下，其可以悬挂在多孔板的各个孔中)。
控制装置
根据本发明的优选装置包括控制装置，其将电流施加于加热部件以加热反应体积。控制装置优选配置为，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选至少三个中，特别优选至少10个中，特别优选至少20个中，在变性步骤中用于加热反应体积的电能和反应容器的容量之间的比率为小于40J/mL(焦耳每毫升)，特别优选小于20J/mL，特别优选小于10J/mL，特别优选小于3J/mL。
在根据本发明的优选装置中，控制装置配置为加热部件的至少一个加热元件具有在至少一个方向上的大于1.5μm的膨胀。特别优选加热部件的各个加热元件具有在至少一个、特别优选在两个方向上的大于1.5μm的膨胀。膨胀可例如为细长加热元件的长度或直径。优选的细长加热元件具有至少1μm的直径，特别优选至少2μm，特别优选至少5μm。优选的细长加热元件具有至少0.1mm的长度，特别优选至少1mm，特别优选至少2mm。在网状或蜂巢状加热元件的情况中，膨胀也可为例如网状物的厚度(意味着网状物的膨胀垂直于网状或蜂巢状的表面)或直径。优选网状物具有至少1μm的厚度或直径，特别优选至少5μm，特别优选至少10μm。
优选的控制装置设计为为了引起电流脉冲，允许或增加在变性步骤起始时-或者如果变性步骤由多个彼此分隔的时间间隔构成则在变性步骤的各时间间隔的起始时，流过加热部件的电流，并且在变性步骤结束之后-或者在变性步骤的各个时间间隔结束之后，再次抑制或降低所述电流。在加热元件中，电流脉冲可转换为热脉冲。优选的控制装置包括电源，其本身可以包括例如电网组件、一个或多个电池或蓄电池或燃料电池。优选的控制装置包括一个或多个电容器。优选的控制装置包括开关，其优选具有可选择的时间持续，可以接通和断开通过加热部件的来自电源的电流。合适的开关包括MOSFET、SSR、非常迅速的继电器和晶体管。控制装置可以具有用于时间控制的一个或多个脉冲或频率发生器、DAC或微控制器。
PCR的观察和PCR产物的检测
优选地，在根据本发明的方法中，检测扩增子或检测样品中靶核酸的原始存在。这可以例如通过PCR后凝胶电泳，与扩增子或其部分互补的固定化寡核苷酸和扩增子的杂交，通过借助于例如荧光染料或通过电子方法的检测来实现。在进一步优选的实施方案中，实时检测已在反应体积中在PCR期间发生以便借助于光学方法观察聚合酶链式反应的进展。为此，特别优选光学方法，特别是例如以TaqMan方式的荧光方法。US 5210015 A的相关公开和Holland等人，Proc Natl Acad Sci USA，88(16)，1991，7276至7280页的出版物通过引用并入而视为本公开的一部分。在该方法中，PCR期间产生特定荧光信号，其允许实时观察扩增反应并且甚至定量原始使用的靶核酸的数量。其他实时检测方法同样可行，例如使用例如SybrGreen的嵌入染料或者使用分子信标探针。然而，本发明同样包括核酸扩增的意义纯粹为制备且扩增子进一步例如在后续过程中使用的实施方案。
根据本发明的优选装置包括光源，例如半导体光源，如发光二极管或激光二极管。通过光源可以有利地在反应体积中激发染料，优选借助于光学方法以观察聚合酶链式反应的进展。
根据本发明的优选装置包括光传感器，例如半导体光传感器，如光电二极管。通过光传感器可以有利地在反应体积中激发染料，优选借助于光学方法以观察聚合酶链式反应的进展。光传感器可以装备有一个或多个滤波器。
当涉及与本发明相关检测或观察方法有关的“光”时，其包括全部适用于光学检测方法的合理的类型和波长的光，特别是那些也适用于激发或检测荧光染料的光。光优选可见光，但同样可为紫外光或红外光。光可为激光。
附图说明
图1A示意性地显示出在开关打开时无电流流过的与引物官能化的加热元件。在加热元件附近存在游离DNA序列。
图1B示意性地显示出在开关打开时无电流流过的DNA官能化加热元件。在加热元件上已形成引物和靶核酸的双链体并且部分已经延伸。
图1C示意性地显示出在开关闭合时有电流流过的DNA官能化的加热元件。加热元件上已发生双链的变性，导致仅保留延伸的引物。
图2A显示出预先加热的圆柱形加热元件在冷却阶段中温度的基于空间和时间的进展。
图2B显示出不同直径的圆柱形加热元件在加热期间的表面温度基于时间的进展。
图2C显示出不同直径的圆柱形加热元件在冷却期间的表面温度基于时间的进展。
图2D显示出未加热的圆柱形载体上预先加热的金膜在冷却阶段的温度的基于空间和时间的进展。
图3A显示出用于产生电流脉冲的电子电路。
图3B、3C、3D显示出包含加热元件的反应容器的合理实施方案。
图3E显示出通过不同电流的水溶液中的整体温度增加，即加热元件的加热。
图4显示出通过基因组模板局部加热的实时PCR。
图5A、5B、5C显示出使用不同电压操作加热部件并且通过基因组模板局部加热的实时PCR。
图5D、5E、5F、5G显示出使用多种不同加热元件并通过基因组模板局部加热的实时PCR。
图6A显示出可电加热的蜂窝状结构。
图6B显示出可电加热的蜂窝状结构的细节。
图6C显示出使用用于局部加热的蜂窝状结构并通过基因组模板局部加热的实时PCR。
具体实施方式
根据本发明的方法的过程
举例来说，PCR扩增循环的第一代次可根据本发明的方法如下进行：将核酸分子(在下文中描述为“靶核酸”)添加至反应体积后(并且可通过整体加热使其变性)，其与键合至一个或多个加热元件的正向引物杂交，聚合酶延伸正向引物并且因此产生靶核酸的互补链。变性，即靶核酸分子从延伸的正向引物分离，不是通过整个反应体积的整体加热实现变性的，而是通过加热部件的加热元件的电流脉冲引起的热脉冲实现的。
可以相似的方式实现随后的PCR扩增循环的第二代次。原始靶核酸分子再次与键合至一个或多个加热元件的正向引物杂交并且聚合酶延伸正向引物并且因此产生用于靶核酸(或至少部分靶核酸)的互补链。并行的，反向引物(其游离悬浮或同样为加热元件键合的)可与在PCR扩增循环第一代次中产生的延伸的加热元件键合的正向引物(现在正向引物构成至少部分靶核酸的互补链)的延伸部分结合，并且反向引物随后通过聚合酶相应地延伸。以该方式，产生至少部分原始靶核酸的首次真实拷贝。通过加热部件的电流脉冲导致的热脉冲再一次实现变性，即分离通过聚合酶延伸产生的双链(在任意情况中双链再次与加热部件键合)。在PCR扩增循环的第三代次的作用下，通过聚合酶延伸引物序列产生的原始靶核酸和核酸链(取决于实施方案：在反应体积中游离悬浮或加热元件键合的)均作为模板用于进一步扩增。它们通过与相应引物(根据实施方案：在溶液中游离或与加热元件键合)杂交来扩增，随后通过聚合酶延伸，然后通过加热部件的电流脉冲导致的局部热脉冲变性。最后描述的PCR扩增循环代次重复几次以在循环的各个进一步代次中产生进一步的至少部分靶核酸的拷贝。重复代次直至通常所必须的直至存在至少部分靶核酸的足够高的拷贝数，以便可以进行所进行的扩增和样品中原始存在的靶核酸的检测。使用上述方法之一，例如荧光法，可以检测因此产生的扩增子。
在本发明进一步的示例性实施方案中，并行扩增多个不同靶核酸(也称为“多重PCR”)。为此，各个扩增子需要多个彼此不同的引物对(在各情况中：正向和反向引物)(其中一个引物还可作为两个扩增子的引物，例如不同长度的扩增子，因此为两个引物对的一部分)。加热元件可运载多个引物对或在各情况下(至少)一种引物由多个引物对构成。然而，多个引物或引物对同样可以加热元件的不同子部分各自运载仅一个引物对或各自仅运载引物对中的一个参与物的方式分布。在示例性实施方案中，一个(可能每引物对仅一个或甚至各个)引物种类(primer sort)或引物序列可以加热元件键合形式和在反应体积中游离悬浮形式的两种形式存在。可以例如通过使用不同染料以产生的不同颜色信号(和不同波长)可以分配至不同扩增子的形成的方式来实现检测。然而可选地，不同扩增子还可产生不可区分的相同颜色信号。不同扩增子还可例如使用凝胶电泳或其他方法来区分。
设置或建立整体反应温度
在优选的示例性实施方案中，例如借助于常规外部加热器，例如温度调节块，或通过借助于加热元件的恒定(或调节的)偏移电流的加热元件的恒定(或调节的)激发，在PCR整个过程期间，(整体)延伸和杂交温度保持恒定。
(整体)延伸和杂交温度或加热温度的调节可以在反应体积中的温度传感器上实现，在多个反应体积中的一个中，通过反应体积外的传感器或通过加热器上的传感器或者用于反应体积的记录装置，通过相应反应体积中相应传感器独立地用于各独立的反应体积。在一个实施方案中，用于全部反应体积的(整体)延伸或杂交温度相同，在另一实施方案中，不同反应体积的(整体)延伸和杂交温度可不同。在另一实施方案中，(整体)延伸和杂交温度可在PCR持续时间期间或PCR之前或之后变化或改变。在一个实施方案中，加热器也可由多个部分组成，例如从底部和顶部，其中顶部具有相对于底部略高的温度以避免反应体积壁上的冷凝。加热器顶和底部之间的温度差优选1℃和30℃之间，特别优选2℃和20℃之间和最特别优选3℃和15℃之间。
在一个实施方案中，通过加热部件电加热对反应容器中的反应液体进行的整体加热可占热输入的一部分或达到期望的延伸和杂交温度所需的所有热。这可以例如通过如下来实现：选择加热部件的加热元件的占空比和/或连续电流(或电压)，使得或在PCR结束或在PCR起始或在PCR持续时间的大部分期间反应容器中反应液体的整体加热处于热平衡，导致反应液体中所需的延伸和杂交温度。因此外部加热(即不通过加热元件的热输入元件)可具有更小尺寸或完全省略。
根据本发明用于组合的杂交和延伸温度的优选温度优选30℃和85℃之间，特别优选40℃和80℃之间，特别优选50℃和75℃之间并且最特别优选55℃和72℃之间。
在一个实施方案中，整体加热步骤(整体温度大于之后的杂交和延伸温度)可在PCR循环的第一实际代次之前发生，其中所述整体加热步骤可用于双链存在的靶核酸(DNA或RNA或其他核酸)的初始变性，和/或用于PCR其他反应参与物例如(热启动)聚合酶等的热活化，和/或用于反应体积组成部分的失活，所述组成部分在PCR之前是活性的但在PCR期间不是活性的(例如酶尿嘧啶DNA糖基化酶)。
在一个实施方案中，具有相对于上述整体加热步骤更低整体温度的进一步整体加热步骤可在该整体加热步骤之前发生，其中可利用进一步整体加热步骤，例如释放酶，在PCR之前发生反应(例如通过转录酶将RNA重写至DNA)。
变性步骤期间和之后的空间热传播
一旦变性步骤中电流开始通过加热元件，加热元件开始升温。由于大多数导电材料(特别是金属)也非常好地热传递，在热脉冲的持续时间内大致均匀地将加热元件加热。在加热元件表面，其在优选的示例性实施方案中由水系反应体积包围，热传递至反应体积并在此处传播。反应体积中热场的传播通过应用根型规则(root-form rule)的热扩散实现。
Figure GDA0003559070300000281
其中d描述了在具有温度传导率D的反应体积中沿空间方向在时间t后通过热前缘(heat front)覆盖的路径距离并且在下文中称为“热扩散范围”。这意味着对于例如100μs的加热持续时间，加热元件产生的热可以扩散远至反应体积中，其中典型温度扩散率(也称为“温度传导率”)的值为D≈1.6·10-7m2/s。
Figure GDA0003559070300000291
换而言之，在加热元件中例如通过欧姆损耗产生的热在100μs后传播进入包围加热元件的反应体积中，即幅度在4μm的范围内。
通过相应于上式的热的空间传播，带来的热量分布在不断增大的体积上，使得垂直于加热元件的表面，其温度ΔΤ高于整体平均温度，得到温度梯度值ΔΤ/d，其促进热传输。在对于加热元件相应几何结构的热脉冲期间和之后的空间热膨胀的更精确估计可以通过有限元方法实现，例如，通过例如Comsol的商业解决方法，其促进热扩散式的数值解。在具有热扩散范围厚度的层内的反应体积优选在加热部件周围加热至少超过10℃。
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选至少三个中，特别优选至少10个中，特别优选至少20个中，热扩散范围在变性步骤结束时为优选0.05μm和200μm之间，特别优选0.2μm和100μm之间，特别优选0.5μm和50μm之间和最特别优选1μm和25μm之间。本发明的该实施方案的可实现的优势为，一方面可实现垂直于加热元件表面的加热区的充足的空间膨胀，并且加热元件上形成的通常具有0.02和3μm之间的长度(相应地约在60至10000碱基对)的PCR扩增子可尽可能均匀地加热并因此变性，并且加热扩散范围不为太大而使得加热区与未加热被动体积的体积比率变为太低。
在本发明意义上的“加热区”为反应体积的在变性步骤期间热可以在其中扩散的部分。垂直于加热元件表面的加热区的膨胀的扩张可以通过上述定义的加热扩散范围大致估计。不在加热区中的反应液体的体积被称为“未加热被动体积”。这意味着，例如在圆柱形加热元件(例如加热导线)的情况中，加热区可以估计为位于从圆柱表面起热扩散范围d的距离处的体积(即具有厚度d的圆柱壳体)。如果加热元件为例如半径r和长度l(例如导线)的细长圆柱，则加热区的体积可大致估计为
VAHZ≈π·l·((r+d)2-r2)
式2
在本发明的优选实施方案中，加热区与未加热被动体积的体积比率在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选至少三个中，特别优选至少10个中，特别优选至少20个中，在变性步骤结束时为小于10％，优选小于5％，特别优选小于2％，特别优选小于1％，特别优选小于0.5％，特别优选小于0.25％和最特别优选小于0.1％。通过本发明的该实施方案可以实现热的高度局部化，其意味着变性步骤中带来的热量可以在变性步骤后传播至未加热被动体积。由于未加热被动体积相对于加热区大许多倍，在整个反应体积(＝加热区+未加热被动体积)上热量的分布可以导致整个反应体积的优选可忽略的整体温度的增加，因此可以非常迅速地冷却加热区并且另外冷却过程(普遍地)独立于将热放出至样品的外部。
变性步骤中局部温度增加的估计
对于85℃和98℃之间的双链核酸的典型变性温度，在一个实施方案中，必须在加热元件表面上和待变性的双链核酸长度上达到大约20℃和40℃之间的相对于组合的杂交和延伸温度的局部温度升高。
在本发明的优选实施方案中，与反应体积接触的加热部件的区域的温度在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选至少三个中，特别优选至少10个中，特别优选至少20个中，在变性步骤期间为70℃和250℃之间，特别优选75℃和150℃之间，特别优选80℃和120℃之间，最特别优选80℃和100℃之间。
在本发明的优选实施方案中，与反应体积接触的加热部件的区域的平均温度为大于100℃。通过本发明的该实施方案，可有利地特别快速分离双链。本发明的该实施方案在加热部件表面上还可发生反应体积的短时过热而无蒸汽气泡形成(尤其，由于加热元件表面的曲率导致的高拉普拉斯压力-参见杨-拉普拉斯公式专题文献。
在加热部件的复杂几何结构和/或为确保高精确度的情况中，可使用有限元方法(例如Comsol)以确定作为电操作参数的函数的加热元件温度。在这种模拟中，在最简单的情况下，可以假定恒定的体积加热密度或可以模拟通过加热部件的电流。然而，在许多情况下，加热部件带来的温度增加可以通过简单计算估计，其通过下述实例陈述。
首先，确定具有电流通过的导体释放的热量。在电热脉冲期间可用于将加热元件加热的电功率P可根据加热元件电阻R、在加热元件处提供的电压U通过P＝U2/R计算。然后，加热元件释放的热量Q为电功率P与加热持续时间theat的乘积。
Q＝U2·theat/R
式3
其中，在此，在热脉冲的持续时间内假定时间上的恒定电压和恒定电阻。如果不为该情况，则适用下式：
Figure GDA0003559070300000311
如果一个实施方案(部分)中加热部件由具有恒定截面积的均质导体构成，则均质导体的电阻R可以根据其截面积A和其长度l以及该导体元件的比电导率σ以下式计算。
Figure GDA0003559070300000312
比电导率的典型值显示在专题文献中并且如下所述，对于典型材料如金：
Figure GDA0003559070300000313
对于钨：
Figure GDA0003559070300000314
并且对于V2A(不锈钢)：
Figure GDA0003559070300000315
如果假定热脉冲持续时间过短使得能量最初仅将加热元件和加热区加热，加热部件的局部温度增加并确实加热至变性温度，可如下估计：
Figure GDA0003559070300000321
在此，cMH描述加热元件的比热容(每单位质量xx)，mMH描述其质量以及cAHZ为加热区的(质量相关的)比热容(对于PCR水溶液其为cAHZ＝4.2J/(℃·g))，并且mAZ为加热区的质量。加热区的热容量相对于加热元件的热容量越小，上述近似值全部越精确。这是由于上式未考虑加热区中温度快速下降的事实(即在加热元件周围形成固体温度梯度)。
如果选择的加热持续时间过短使得加热区的尺寸保持非常小(明显小于加热元件本身)并且因此其热容量相对于加热元件的热容量为可忽略的，可简化上式为：
Figure GDA0003559070300000322
虽然式6仅可用于特定情况中并且用于非常短的加热持续时间，式5可用于确定加热元件表面上局部温度的近似值，其中必须在各个情况下从几何形状和实际电流中检查，重要的是可以如何计算加热区的质量。在许多情况下，可通过考虑加热元件的几何结构和热扩散范围从其体积估计加热区的质量(参见上述)。
以下将考虑根据本发明特别相关的情况，其中加热元件至少部分(近似)圆柱地形成并且至少部分为均质的并且具有恒定的截面积。下述计算视为加热部件的圆柱几何结构的实例并且也可以非常容易地转移至其他几何结构。然后，式5中的加热元件质量可从其体积和密度计算：
mMH＝pMH·A·l
其中A为截面表面积并且l为加热元件的长度(或其所考虑的部分)。然后，热量Q可通过式3和式4计算。
使用式2，其近似描述包围半径r和长度l的(近似)圆柱形导体部分的加热区的体积，可以在式5中估计加热区的质量为：
mAZ＝VAHZ·pAHZ＝π·l·((r+d)2-r2)·pAHZ，
其中，反应体积中加热区的密度等于水的密度
Figure GDA0003559070300000331
因此，对于(近似)圆柱地形成的、在至少部分为均质的并且具有恒定截面的加热元件，可使用式2、式3、式4、式5给出下述估计：
Figure GDA0003559070300000332
对于圆柱导体部分，截面积可根据半径A＝πr2计算，使得与式1一起得出下述简化：
Figure GDA0003559070300000333
通过上式，在加热持续时间theat期间加热的(近似)圆柱形导体的温度可因此大致估计，以便优选地能够确定用于实现变性温度的参数。如果仅考虑部分加热元件(例如由于加热元件由复杂几何结构的串联导体组成)，对于电压，显然仅在相应考虑的导体中下降的电压为相关的。
因此，上式中的第一因子
Figure GDA0003559070300000334
为体积加热密度，其在下文描述为q，即
Figure GDA0003559070300000335
这反过来意味着式8中的增加温度与体积加热密度成比例。
如果加热元件例如设计为来自金(Au)的导线，其中导线长度l＝0.1m，导线半径r＝12.5μm，以及材料参数
Figure GDA0003559070300000336
和
Figure GDA0003559070300000337
基于根据式7的电压U＝10.5V(在V之前间隔)和加热持续时间theat＝200μs，这导致加热元件上的局部温度增加ΔTlocal≈14.4℃。(当使用用于加热区中包含的反应体积的典型值
Figure GDA0003559070300000338
和
Figure GDA0003559070300000339
时)。根据使用的操作参数，体积功率和加热密度q可以通过
Figure GDA00035590703000003310
计算≈5·1011W/m3，因此可与图2B的有限元模拟的结果进行比较。这表明，在所述加热密度为5·1011W/m3的圆柱形加热导线的200μs加热持续时间后，加热仅约17℃。
电源和能量密度的提供
在本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选至少三个中，特别优选至少10个中，特别优选至少20个代次中，加热部件的平均体积功率密度为大于109W/m3，优选大于1010W/m3，特别优选大于1011W/m3。本发明的该实施方案可实现的优势为甚至在短热脉冲的持续时间下也可足够快地将加热元件加热。
本发明的优选实施方案中，在PCR扩增循环的至少一个代次中，优选至少三个中，特别优选至少10个中，特别优选至少20个中，加热部件的平均比功率密度为优选小于1016W/m3，特别优选小于1015W/m3并且特别优选小于1014W/m3。通过本发明的该实施方案，可以有利避免损伤加热元件。
在加热电阻器用作加热元件的情况中，在加热元件中产生的比功率密度q为
Figure GDA0003559070300000341
即，电压U尽可能高，电导率σ尽可能高并且长度l短，加热元件上电压下降导致高比功率密度。因此，用于提供热脉冲的整个电功率需求可从所需体积功率密度和加热部件的全部加热元件组合的体积计算，其中尤其取决于待处理的反应体积。
通过用于变性的局部加热步骤整体加热样品
本发明的优选实施方案中，选择通过加热部件的电脉冲使得仅将加热部件表面直接附近显著加热的加热部件和反应体积，因此仅发生局部加热。在整个变性步骤过程中带来的热量Q在加热部件中局部地产生并且最初分布在加热部件其自身和其直接附近，这是由于如下所解释的通过扩散的放热仅逐步发生。这意味着带来的热量Q为最初分布在非常小体积并且适时传播(“流动”)至周围的反应体积中的能量。如果加热元件和其直接附近的热量(通常也描述为“热”)仍为空间集中的，则在此处带来大量升温。然而一旦该热量分布在不断增大的体积中，由于初始带来的热量自然保持恒定，其还是会带来温度增加但会相应地更小(如果仅考虑反应体积的液体体积，温度降低与热量在其上分布的体积成反比)。
仅在一定时间后，在下文中称为“样品热能化时间”并在下述段落中定义，热量分布至整个反应体积并且在那里导致整体温度增加。
取决于反应体积的绝缘程度或其与外部热水箱的耦合程度，所带来的热量可保留在反应体积中(非常好的绝缘性导致在PCR扩增循环的每个代次中反应体积的整体温度逐渐轻微的增加)，或在反应体积的良好热能的热接触的情况中热流失，使得反应体积回到原始温度(在加热步骤前)。实际上，在大部分情况中，所带来的热量在两个变性步骤之间的时间中流失，使得反应体积的整体温度在PCR扩增循环的第一代次至形成平衡态期间略微增加(通常小于3℃)，对各个循环，所带来的热量与流失的热量相同。
样品热能化时间为直至所带来的热量已从加热部件传播至整个反应体积的时间。样品热能化时间可以通过最初确定的自最近加热元件起的最大距离dmax的点(在许多情况下，这些点通常位于界定反应体积的表面)来估计。然后，样品热能化时间为直至热扩散范围等于dmax的时间，即根据图像所述，直至加热元件中产生的热已扩散至反应体积最后一个“角落”的时间。例如，如果反应体积为半径1.01mm的圆柱形，加热元件由一根半径0.01mm的圆柱形导线组成，其同心地穿过圆柱轴，反应体积中的点可以距离最近(在该情况下唯一)的加热元件的最远距离为dmax＝1mm。通过式1，在6.3s后产生1mm的热扩散范围，使得在该特殊情况下，样品热能化时间为大约6.3s。
MGTE，其为通过变性步骤发生的平均温度的最大增加，可如下述由热量Q和通过加热步骤带入反应体积的热电容估计，
Figure GDA0003559070300000351
利用反应体积的密度p、其体积V、其比热容c并且借助于相关性C＝c·p·V可以估计
Figure GDA0003559070300000352
小于号表明这里未考虑加热部件和反应容器的热容量。反应体积的密度和热容量通常实质上为水的密度和热容量，即p＝1g·cm3和c＝4.2J·℃-1·g-1。热量Q可由电操作参数决定：如果热脉冲tHeat连续并且如果热脉冲期间的电压U和电流I恒定，则Q＝U·I·theat(在电流和电压随时间变化的情况中，应用下式：
Figure GDA0003559070300000361
这意味着在第一种情况下，MGTE的上限可以通过下式确定
Figure GDA0003559070300000362
(体积V以毫升表示)。当然，在此，仅考虑通过反应体积V中的加热部件中下降的电压U以及实际流过反应体积V中的加热部件的电流I。(这意味着：例如不考虑在入口管线中电压的下降。)
MGTE可通过在单一变性步骤之前和之后获得的反应体积的温度实验地确定，其中在后一种情况下，其仅在样品热能化时间后进行反应体积温度的物理测量。两个测量的温度之间的差等于MGTE。根据本发明的该步骤为有利的，这是因为反应体积的完全热能化，即确保反应体积中热的均匀分布并且温度传感器不检测加热区的温度，例如随机地)。MGTE的该测量可例如实际上通过反应体积中的温度传感器检测，优选其具有特别小的热容量。
加热部件的实例
图1A在示意图中示出形成加热部件的加热元件，其可与电压源2连接，其中用于产生电脉冲3的装置改变时间电流模式4。在此，用于产生电脉冲的装置3为开关，其在所示状态下为打开，因此在时间/基于时间相关的电流模式4中不能看到脉冲。加热元件1与引物5官能化，其上可杂交游离靶核酸6。在图右侧显示加热元件中和周围的温度分布的空间进展。在开关打开的时间点，相对于周围液体不将加热元件加热并且因此温度曲线为平坦的。
图1B再次在示意图中示出加热元件1。在引物5与靶6杂交后，该引发的靶核酸7可通过聚合酶延伸以形成核酸双链8。
图1C显示出在核酸延伸之后，用于产生电脉冲3的装置变为有效(此处所示开关为闭合状态)，因此在时间电流模式4可看到电脉冲。这导致加热元件1及其局部附近的加热(在图右侧显示出加热元件中和周围的温度分布的空间进展)，因此，在充分局部加热的情况下，核酸双链变性并且再次形成游离靶和扩增子6，并且加热元件上延伸的引物9保留。游离靶和扩增子以及延伸的引物都可在随后的扩增循环中作为模板用于进一步扩增。
模拟的温度模式
图2A显示出在热脉冲起始后的不同时间点，即50、100、200、400、800和1600μs，在加热导线(其代表例如加热元件)及其附近中的空间温度模式的有限元模拟。纵轴上，相对于热脉冲起始之前的值记录温度增加。在横轴上，记录距离导线圆柱轴的距离。在此假定直径为25μm的由金构成的导线，其在水性附近通过2·1012W/m3的体积功率密度(根据式
Figure GDA0003559070300000371
对应于210V电压每米加热导线长度)加热50μs。
可以认识到，在50μs后，导线表面上达到大约25.5℃的温度增加，但温度增加在表面几微米外已经下降。另一方面，在1600μs(即在热脉冲结束后1550μs)后，热已经扩散至距离加热导线表面10μm远外并且因此填充更大体积。这导致导线表面的温度相对于热脉冲前仅加温约3℃。
应该指出曲线进展与体积功率密度成比例缩放。这意味着，例如，对于4x功率密度(对应于具有恒定导线长度的电压的两倍)，整个空间温度模式的温度提升乘四。
图2B显示出自热脉冲开始在不同加热导线上(其代表例如加热元件)的基于时间的温度模式的有限元模拟，即显示加热导线的加热行为。在纵轴上记录相对于热脉冲开始前的值的温度增加。在横轴上记录自热脉冲开始的时间。认为将具有直径10、25、50和100μm的由金构成的全导线通过5·1011W/m3的体积功率密度(对应于104V电压每米加热丝长度)加热。应注意，恒定体积功率密度导致更大直径的导线以更高功率加热(由于其具有更大体积)，最终由于其较低电阻，因此导致具有恒定电压的更高电流。
可以看出，最初(在第一微秒中)，导线表面上的温度增加相对于加热持续时间近似线性增加，然后-尤其是对于小导线直径-变平并且相对于线性增加更小。这种效果是由于如下事实：加热元件的直径小、加热区的热容量起更大作用，或者换而言之，由于对小导线直径而言较高的体积/表面比率造成通过扩散的热的运输、带走、除去在早期时间点是十分重要的。应该指出曲线模式与体积功率密度成比例缩放。这意味着，例如对于4x四倍的功率密度(对应于具有恒定导线长度的电压的两倍)，导线表面上达到的温度也增加四倍。
图2C显示出在持续时间为200μs的热脉冲结束后，在不同加热导线(其代表例如加热元件)上标准化基于时间的温度模式的有限元模拟，即显示加热导线的冷却行为。在纵轴上，相对于热脉冲开始前的值记录仍存在的标准化温度增加。在横轴上记录自热脉冲开始的时间。这里认为存在具有直径10、25、50和100μm的由金构成的全导线，其已加热200μs。可以发现，对于所有导线直径，在10ms后，原始温度增加(在热脉冲结束时)已降至一部分。对于导线直径为10和25μm的，剩余的温度增加甚至降低至小于其初始值的5％，其显示本发明的潜力，即在10μm直径的导线的情况下，下一个热脉冲(即变性步骤或PCR循环)在10ms后可能已经进行了。导线直径越小，表面/体积比率越高并且热脉冲后发生的冷却更快。
图2D显示出自热脉冲开始加热元件的时间温度模式的有限元模拟，即显示加热行为。加热元件由200nm(纳米)厚金膜组成，其应用于直径200μm的非导电性PMMA圆柱。在纵轴上，记录相对于热脉冲开始前的值的温度增加。横轴上的值以其数量表明距离圆柱轴的距离。这里认为存在由金构成的200nm厚圆柱护套，其通过水平为2.2·1013W/m3的体积功率密度(对应于692V电压每米圆柱护套长度)加热200μs持续时间，然而，在圆柱内侧(其由塑料制成)，通过与周围水系反应体积中相同的方式，没有热产生(即在此处的体积功率密度为0W/m3)。在200μs的加热持续时间后，温度分布(在径向上)仍强力地位于金膜周围，并且热不能在水性外层区域或圆柱的中间在短时内传播。在脉冲结束后(t>200μs)，金膜冷却并且热传播至水性外部区域和圆柱的内侧。在约6.4ms后，可以看到，圆柱形护套中产生的热场在圆柱形的中间一起运行，使得在此温度最初在进一步的过程中增加。另一方面，在外部区域可以看到，已在25ms后，温度增加为仅小于2℃。这里可以看到金属薄膜作为加热元件的根据本发明的用途的两个优势，即其可应用至大表面上(在此为直径200μm的圆柱)并且同时具有非常小的体积(以及因此的热量)，使其在非常短时间内(＜＜1s)再次几乎完全冷却。
实验转换
图3A显示电路10作为控制装置用于产生电脉冲以施加电流至加热部件的实施例。构建电路使其在接地(GND)和U+之间供给将加热部件加热的电压(在本文件中通常表示为“U”)(例如在30和100V之间)。在R3“负载”点，设置加热部件，使得R3为加热部件的电阻器。作为实例使用的电力MOSFET Q(IRFP4468,International Rectifier)在连接中产生接触点(contact)T2和接触点T3之间的低欧姆连接，通过该方式使得电流通过加热部件R3。在MOSFET的接地与栅极(gate)(接触点T1)之间，例如通过脉冲或频率发生器或数字模拟转换器提供的控制电压通过控制终端FET GND rt/ge供给。特别合适允许MOSFER的纯净连接的具有5V电平和持续时间为例如10和1000μs之间的脉冲。在C1点，提供具有例如4mF的足够电容和最低可能的ESR值的电容器，即使在低欧姆加热部件的情况下-全部加热元件一起的电阻通常小于1Ω(欧姆)-其也允许维持供给的电压达热脉冲持续时间。电阻器R1、R2、R7和R9，具有例如1、100、24和24kΩ(千欧姆)的欧姆值。
图3B示意性地并且以简化方式显示出本发明实施方案的截面，其中加热部件通过部分的与电压源11连接的连续导线12形成。省略用于产生电脉冲的装置以简化说明。另外附图不符合比例。彼此分离的导线穿过多个反应容器，在位于两部分温度调节块14之间的样品板13中以样品液体室(也称为“孔”)形式存在。温度调节块14具有将样品液体室中的反应体积带至杂交/延伸温度并且保持在那里的功能。在此所的示实施方案中，在各个样品液体室下方的温度调节块14的下部，具有用于激发相应反应体积中染料的激发光源(在该情况下，以具有光学低通量滤波器的发光二极管15的形式)，并且，在各个样品液体室之上/上方的温度调节块14的上部，具有作为光传感器的用于检测相应反应体积中激发的染料的荧光的光电二极管16(具有允许荧光通过的光学高通量滤波器)。
图3C示意性地并且以简化方式显示出不同于图3B的示例性实施方案的本发明进一步的实施方案的截面，其中加热元件设计为由与电压源11连接的导线12构成的线圈。也已省略用于产生电脉冲的装置以简化说明。导线卷绕成线圈形式的加热元件与相应反应容器中的反应体积接触。与它们在附图中显示的相反，它们优选完全被反应体积包围。该示例性实施方案中的反应容器为多个彼此分离的、反应管形式的样品液体室，其位于用于将反应体积带至杂交/延伸温度并且保持在那里的温度调节块14中。在此所示的实施方案中，在各个样品液体室下方的温度调节块14的下部，具有作为激发光源用于激发反应体积中染料的发光二极管15，并且在各个样品液体室上方，具有作为光传感器用于检测反应体积中激发的染料的荧光的光电二极管16。
具有导线加热元件的样品板的生产
图3D示意性地示出了组件，由此根据本发明的装置的样品板可利用导线加热元件产生。此处使用的加热元件为直径为25μm的镀金护套导线12的部分(23μm钨芯和约1μm金护套，LUMA METALLAB，卡尔马，瑞典)。其卷绕在厚度为0.5mm(中间，较轻的板)的丙烯酸系玻璃板17周围。在板上有7个开口(6mmx6mm)，借此定义其样品液体室(孔)。通过卷绕，在各个样品液体室中存在两个平行层，各个层具有十五个平行加热元件；加热部件的两层的距离由于板为0.5mm，层内的加热元件的距离约为0.4mm。从两侧，通过双面粘合箔18(深色显示，3M的100-250μm厚的VHB粘合带)和用于样品液体室的相应容器，具有相等开口的另一个丙烯酸系玻璃板19(下板厚度为0.5mm并且上板厚度为3mm)粘至板17，并且根据粘合带18的厂商指示压住。从下面，将孔各自用薄箔20(附图中为浅色，粘合PCR箔密封，4titute)封闭，将其粘至底部丙烯酸系玻璃板。通过该方式形成具有7个孔的样品板，通过其可拉动平行导线12。导线12在板的两个外侧端部彼此相连(即全部导线/加热元件并联连接)并且电接触。通过该方法可以将电流脉冲串联通过所有的孔。样品板的开口(此处在顶部)可用薄箔21(浅色显示)封闭。样品板具有20mm的宽度和90mm的长度(因此如果考虑用于接触目的的导线末端3mm的突出，热脉冲的电压本质上在约96mm的长度上下降)。
整体温度增加的测量
图3E显示根据图3D的本发明示例性实施方案的反应体积中整体温度增加的测量结果。如图3D中所述生产的样品板的孔各自填充有100μl的水。作为温度传感器的PT100传感器附加地插入一个中间孔中。如果输送恒定电流3A穿过导线，水样品中200s时间内观察到约47℃的温度增加(带方块的曲线)。另一方面，如根据本发明每3s提供80A电流脉冲通过导线持续70μs(供给32V电压，导线负载电阻为0.4Ω)，通过该测量方法可测量到仅低于1℃的水样品的整体温度增加(带圆圈的曲线)。
基因组核酸PCR和背景
图4显示出在根据图3D所述的本发明示例性实施方案的相应反应体积中的基因组核酸和对照测量的聚合酶链式反应结果。如图3D所述生产的样品板的孔中的加热元件与正向引物官能化。对于官能化，使用正向引物ID1。硫醇用于与金表面键合，前五个胸腺嘧啶碱基用作间隔序列用于获得实际引物序列和金表面之间的更多空间或距离，并且因此防止例如可能的空间障碍物阻碍。官能化前，由此形成的寡核苷酸的硫醇修饰的保护基团，通过将寡核苷酸在0.5μm浓度的PBS缓冲液(5mM磷酸盐缓冲液，10mM NaCl，0.01％Tween20，1nMEDTA，pH7.5)中温育15min脱保护。用1mM三-(2-羧乙基)膦培养。随后，添加NaCl(5M)以达到500mM的NaCl最终浓度用于官能化。使用脱保护的寡核苷酸的悬浮液培养导线3小时后，使用PBS缓冲液进行2次清洗步骤以去除过量的非键合寡核苷酸。该方法制备的板现在可用于扩增反应。
扩增反应在每个孔90μl总体积中进行。反应混合物由36μl H2O；9μL MgCl2 120mM；18μl 5x Aptataq genotyping master(Roche)；9μl反向引物ID25μm；9μl Taqman探针，oligo ID3 2μm组成。向其中添加9μl样品，其取决于孔而包含煮沸的基因组核酸或仅水。选择正向和反向引物以及Taqman探针使得扩增并检测抗性基因MecA，由此例如在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus,MRSA)的基因组中产生。
在两个由铝制成的温度调节块之间放置板，下部块的温度为65℃且上部块的温度为70℃。温度差用于避免在上部覆盖箔上形成冷凝。包括加热元件的加热部件根据图3A在电路R3位置上配置，在此通过U+＝32V的电压操作。导线形成0.4Ω的负载电阻，在随后的PCR期间每3s通过其输送长度为70μs的电脉冲。
对于TaqMan格式的实时监测，在下部温度调节块上具有激发发光二极管，和相应的中心波长为478nm的带通滤波器和29nm的FWHM(ET480/30x，Chroma Inc.,USA)并且，在上部温度调节块上，具有通道面积为515至700nm的光电二极管和光学滤波器(ET510IP，Chroma Inc.,USA)。
图4可看到上述PCR的结果，其中显示PCR过程期间荧光信号I的百分比变化(相对于PCR起始时的荧光基础信号I0)。在第一个孔中，从MRSA分离的基因组核酸的106拷贝用作样品。由于该基因组核酸包括MecA基因并且因此包括PCR的靶序列，相应荧光曲线(实线曲线)在约190sPCR持续时间后增加，此时形成足够大量的扩增子(因此，通过聚合酶的核酸外切酶活性，从TaqMan探针释放足够大量的FAM染料)，以产生可与基础荧光区别的信号。在第二个孔中，使用源自相同生物的100x更少核酸，相应荧光曲线(粗略断开的虚线)在此之后从220sPCR持续时间开始增加。因此该方法允许(如通常在qPCR中)使用的靶浓度和荧光曲线增加的时间之间的相关性。在第三个孔中，除反应混合物外，仅添加水作为阴性对照(细碎的虚线)，在第四个孔中使用从大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli，基因组通常不包括MecA基因)分离的基因组核酸的106拷贝作为样品以展示PCR的特异性(点状线)。荧光曲线(水：细虚线，大肠杆菌：点状线)都不显示显著的增加。最后，在第五个孔中，分离自MRSA的基因组核酸的104拷贝和分离自大肠杆菌的基因组核酸的104拷贝用作样品。相应荧光曲线(虚线-点状线)与来自第二个孔的样品的荧光曲线的表现相似，其仅包括分离自MRSA的基因组核酸的104拷贝。这显示出大肠杆菌核酸的存在不抑制MRSA核酸的扩增。另外，在类似扩增实验中，借助常规热循环仪(Roche Lightcycler 1.5)进行产生的扩增子量的外部定量。对此，在可辨别的荧光曲线中的增加后不久中断上述PCR过程，去除样品，与水1:100稀释并将1μl该稀释样品插入使用相同引物序列(在此为正向引物但无硫醇或5T间隔序列)的qPCR中，如上述PCR情况。与已知靶浓度的连续稀释序列比较导致在清晰的信号增加的时间点，反应中的扩增子浓度约为3nM(纳摩尔或纳摩尔每升)。其还为用于区别信号的典型区域，在其他热循环仪的情况下都为荧光碱，并且这另外清晰地显示出在进行PCR期间，非常大量地产生所需扩增子。与图3E比较显示出，在给定条件下(提供32V电压，0.4Ω导线负载电阻)，在200s内仅可检测到<1℃的反应体积的温度增加，并且因此，可以排除到达反应体积的变性温度(约95℃)。然而，通过硫醇修饰的正向引物的官能化，扩增子仍与加热元件键合。显然，在加热步骤期间和电脉冲期间，局部温度为足够高以实现扩增子的变性。(此处未显示：如果使用添加至反应混合物但不与导线键合的具有序列ID4的游离未修饰正向引物代替硫醇修饰的正向引物，但在其他条件相同的情况下，不能观察到扩增。因此，在局部加热的情况下，扩增反应优选位于局部加热元件上，由此正向引物固定在加热元件上)。
不同体积功率密度情况下的测量
图5A至5C借助于本发明的示例性实施方案显示出PCR性能对所供给电压的依赖性，其中根据式
Figure GDA0003559070300000431
改变体积加热密度。在此，对供给有不同电压的加热部件进行测量系列。参数和反应混合物组成与图4的示例性实施方案中相同，其中仅通过孔中的样品，水用作阴性对照(虚线荧光曲线)并且，在两个孔中使用具有序列ID5的合成靶核酸，使得反应起始时的最终浓度分别为100fM(飞摩尔或飞摩尔每升)的靶核酸(具有实线荧光曲线的阳性对照)。从MecA基因切下的靶核酸可通过选择的引物对扩增。在第一测量中(图5A中的荧光曲线)，提供26V电压并且几乎看不到任何信号提升。在第二测量中(图5B中的荧光曲线)，提供28V电压并且阳性对照在此显示出微弱的、平坦增加、晚期出现的信号。在第三测量中(图5C中的荧光曲线)，提供36V电压，两个阳性对照在此自约180s PCR持续时间的作用下明显地急剧陡峭地增加，进而阴性对照不显示信号。该测量系列表明，加热部件带入反应体积的热必须足够大以在加热元件上局部地达到扩增子所需的变性温度。
图5D至5G显示出测量系列的结果，其中以上文图3D的描述中所述的方式精确地生产样品板。然而，在各个样品板中使用不同数量的导线。在图5D中使用3根导线，在图5E中使用5根导线，在图5F中使用10根导线，在图5G中使用30根导线(在样品板长度上并联连接：电阻为3700、2100、2210和400mΩ(毫欧)。为了进行PCR，使用如图4相关文本段落中相应化学物质和缓冲剂。为了产生热脉冲，使用U+＝40V电压、40μs持续时间的脉冲和3s脉冲重复频率(即PCR循环持续时间)之一。下部温度调节块的温度为63℃并且上部块的温度为68℃。通过靶核酸，使用合成DNA ID5，其在反应起始时以1fM浓度存在(实线)。在阴性对照中不使用靶(虚线)。可以看出，当在样品板中仅使用3根导线时(第一测量，图5D中荧光曲线)，甚至在阳性对照中也看不到信号出现(即无TaqMan信号，即无扩增)。在样品板中具有5根导线的情况下(图5E)，阳性对照展示出微弱信号。在样品板中具有10根导线的情况下(图5F)，信号显著更高，但仍显著弱于第四测量，其中使用通常数量(即30)的导线(图5G)。
蜂窝状结构的加热部件
图6A至6C显示出蜂窝状结构中的加热部件的实施方案。为了制造其，通过光化学精细蚀刻法从不锈钢箔中制造蜂窝状结构，并且随后将蜂窝状结构涂有金。在示例性实施方案中，其为六方点阵，但自然也可想到其他点阵。电流沿其长度流过xx，其中如图6A所示，仅在样品室的区域，因此在箔形成加热元件的地方，蚀刻出蜂窝状结构。加热元件的长度f为例如8.2mm，加热元件之间的距离g为例如3.8mm。样品室优选配置在加热元件的中心上方并且优选具有更小尺寸(例如6mmx6mm)以仅使用加热元件区域，其尽可能均匀地回火。箔的整个长度h为例如100mm，即电接触发生在短边上，使得电压在约100mm的长度上下降。蜂窝状结构的网状物由于穿过其的电流而加热并且可变性与其键合的双链核酸。
图6B为具有相邻边缘的图6A的加热元件的蜂窝状结构的放大说明。在蜂窝状结构的实例中，配置网状物宽度使得在蜂窝状结构整体中的电流密度尽可能均匀并且因此实现体积加热密度。在示例性实施方案中，这是通过纵向网状物的宽度d为横向网状物宽度b的精确地两倍来实现的。尺寸的实例为蜂窝直径a为0.87mm，横向网状物宽度b为0.065mm，网状物长度c为0.5mm，纵向网状物d的宽度为0.13mm并且长边3的宽度为0.57mm。首先，长边a用于机械稳定性并且经历与蜂窝状结构不同的电流密度。
如图4，图6C显示在PCR过程期间的荧光信号I的百分比变化(相对于PCR起始时的荧光基础信号I0)，其中现在，与图4中实例相反，图6A和6B中显示的结构为使用涂布有约0.5μm金的不锈钢箔(箔厚度20μm)的加热元件。该镀金点阵粘于两个具有七个孔开口的丙烯酸系玻璃板之间，如图3D中示例性实施方案中所使用的(下板厚度为0.5mm并且上板厚度为3mm)。因此，如图3D中示例性实施方案中已存在的，在此同样通过加热部件横穿样品板。蜂窝状结构与板的两个外侧端部电接触。因此可以使得输送电流脉冲串联通过所有孔。随后，样品板的开口可通过薄箔封闭。蜂窝状结构通过图3D和4中钨-金护套导线的相似官能化以实现官能化。现在反应体积为60μl每孔，反应混合物的组成和浓度与图4对应。提供41V电压和0.35Ω负载电阻。在此，在PCR期间每10s输送持续时间为150μs的电脉冲通过加热元件。由于不锈钢为明显比钨差的电流导体，在先前实例中由钨制造护套导线的芯，当在该实例中使用不锈钢加热元件时，兼顾使用更高电压以及更长加热持续时间。在图6C中，可看到来自三个孔的荧光曲线。使用水作为样品的阴性对照不显示信号增加(点状荧光曲线)，具有序列ID5的合成靶核酸的高初始浓度(100fM)的样品显示自400s PCR持续时间作用的荧光信号的增加(实线荧光曲线)，并且具有序列ID5的合成靶核酸的更低初始浓度(1fM)的样品显示出晚期增加的荧光信号(虚线荧光曲线)。
桥式PCR
在一个示例性实施方案中，在加热部件表面具有两种引物(正向引物和反向引物)。该示例性实施方案的过程基本上对应于图4的示例性实施方案。然而，为了加热部件官能化，使用一份正向引物ID6和三份反向引物ID7的混合物(两种引物在脱保护期间的总浓度为0.5μm)。两种引物进行硫醇修饰，其用于在加热部件表面上的固定。除间隔序列外，正向引物还在间隔序列和引物序列之间携带无碱基修饰间隔子9，其防止通过聚合酶重写间隔序列。由于加热元件上已存在反向引物，其不再需要存在于反应体积中；通过水替代相应缺少的体积。在荧光曲线中显示出以水为阴性样品和以序列ID5、合成靶核酸初始浓度100fM为阳性样品的信号模式进展。实际上，相对于先前的示例性实施方案，此处的荧光信号明显更小，但自PCR持续时间450s开始，其同样可清晰看到阳性样品的信号相对于阴性样品增加。该示例性实施方案说明两种引物固定在表面上(“桥式PCR”，参见Kawashima等人的WO 1998/044151 A1和Adams等人的US 5641658 A)的PCR过程在根据本发明的方法中的功能。
在以上描述、权利要求和附图中公开的特征可重要的单独地或以任何期望的组合用于在其不同实施方案中实现本发明。
附图标记说明
1 加热部件的导线型加热元件
2 电压源
3 用于产生电脉冲的装置
4 基于时间的电流进展说明
5 引物
6 游离靶核酸
7 与引物键合的靶核酸
8 双链核酸
9 延伸的引物
10 电路
GND 电路的接地
U+ 电路的电源供给连接
Q1 电路的MOSFER
T1 MOSFET Q1的栅极端
T2 MOSFET Q1的漏极端
T3 MOSFET Q1的源终端
C1 电路的电容器
FET GND 电路的控制终端
R1 电路的电阻器
R2 电路的电阻器
R3 加热部件
R7 电路1的电阻器
R9 电路的电阻器
11 电压源
12 导线
13 样品板
14 温度调节块
15 发光二极管
16 光电二极管
17 丙烯酸系玻璃板
18 双面粘合膜
19 丙烯酸系玻璃板
20 薄膜(底部)
21 薄膜(顶部)

Claims (12)

1.用于在反应体积中通过聚合酶链式反应扩增核酸的装置，所述装置包括用于接收反应体积的反应容器、由一个或多个在所述反应容器中并且与所述反应体积接触以使用电能加热所述反应体积的加热元件(1)组成的加热部件、和用于将所述电能传递至所述装置中的部件，其中配置所述装置使得所述装置的电功耗在聚合酶链式反应期间的任何时间不超过20瓦，并且所述装置可以在PC、平板电脑或移动电话的USB连接端口上操作。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，至少一个所述加热元件与寡核苷酸(5)缀合。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述装置包括光源(15)和光传感器(16)。
4.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述装置包括电力储存器并且设计为使得电力储存器中保持可用的电能相对于所述反应容器的容量为大于0.1J/mL。
5.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，其包括电力储存器，并且设计所述装置使得电力储存器中保存可用的电能相对于所述反应容器的容量为小于100焦耳每毫升。
6.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述一个或多个加热元件通过欧姆电阻将电流转换为热。
7.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，配置所述装置使得在PCR扩增循环的至少一个代次中，所述聚合酶链式反应的变性步骤的其中所述加热部件加热所述反应体积的持续时间为10ms或更短。
8.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，配置所述装置使得在所述聚合酶链式反应的扩增循环的至少一个代次中，所述加热部件向所述反应体积供给的、在变性步骤中生成的热小于CR＊5℃，其中CR为通过所述加热部件加热期间所述反应体积的热容量。
9.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，配置所述装置使得在所述聚合酶链式反应的扩增循环的至少一个代次中，通过变性步骤发生的、所述反应体积的平均温度的最大增加为小于10℃。
10.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，配置所述装置使得在所述聚合酶链式反应的扩增循环的至少一个代次中，与所述反应体积接触的所述加热部件的区域的温度为70℃和250℃之间。
11.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，配置所述装置使得所述装置的电功耗在聚合酶链式反应期间的任何时间不超过2.5W。
12.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述装置为USB棒。
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