KR20190082233A

KR20190082233A - 중합효소연쇄반응의 수행방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 장치

Info

Publication number: KR20190082233A
Application number: KR1020197014410A
Authority: KR
Inventors: 페데리코 부어스젠스; 에이만타스 루섹카스; 라스 울러리치; 조아킴 스터; 리디야 오신키나
Original assignee: 지엔에이 바이오솔루션즈 지엠비에이치
Priority date: 2016-10-21
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2019-07-09
Also published as: JP2020504596A; DE102016120124B8; CN109862965B; JP7140759B2; EP3528954A1; CN109862965A; DE102016120124B4; WO2018073435A1; EP3528954B1; CA3041042A1; AU2017345281A1; US20200063173A1; DE102016120124A8; EP3733292B1; ES2890411T3; DE102016120124A1; EP3733292A1

Abstract

본 발명은 반응부피에서 중합효소연쇄반응에 의해 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것으로, 반응부피는 전기에너지를 사용하여 가열된다. 중합효소연쇄반응의 증폭주기 중 적어도 하나의 경로에서, 반응부피를 반응부피의 크기로 가열시키는 변성단계에서 사용되는 전기에너지의 비율은 20 Joule/ml 미만이다. 또한, 본 발명은 반응부피를 수용하기 위한 반응용기와, 반응부피를 가열하기 위해 반응부피와 접촉하는 하나 또는 복수 개의 가열요소(1)로 구성된 가열수단을 포함하는 장치의 사용에 관한 것으로, 상기 가열요소 중 적어도 하나는 반응부피 내의 핵산의 증폭을 위해 올리고뉴클레오티드(5)에 접합된다. 마지막으로, 본 발명은 반응부피 내의 핵산 증폭장치에 관한 것으로서, 반응부피를 수용하기 위한 반응용기 및 하나 또는 복수의 가열요소(1)로 구성된 가열수단을 포함하며, 이를 가열하기 위해 반응부피와 접촉된다.

Description

중합효소연쇄반응의 수행방법 및 상기 방법을 수행하기 위한 장치

본 발명은 가열되는 반응부피에서 핵산을 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 반응부피를 수용하기 위한 반응용기 및 핵산의 증폭을 위한 가열수단을 갖는 장치의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 반응부피를 수용하기 위한 반응용기 및 가열수단을 갖는 반응부피 내의 핵산의 증폭장치에 관한 것이다.

미국등록특허 US 7569366B1호는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 핵산의 증폭방법을 개시하고 있으며, 여기서 반응용기는 가열블록 상에 배열되어 어닐링 온도로 예열된다. 반응용기에는 저항 와이어 코일 또는 박막 형태의 가열수단이 구비되어 있으며, 이를 일시적으로 신장온도 및 변성온도로 가열하기 위해 반응용기 내의 반응부피와 직접 접촉한다. 이 목적을 위해, 전류펄스가 가열수단에 공급된다. 펄스 지속시간은 적어도 밀리초(milliseconds) 정도이고, 변성시간은 적어도 10 밀리초정도이다. 예시적인 실시예에서, 펄스 지속시간은 100 ms (milliseconds)이고 반응용기의 부피는 200 ㎕ (microlitres)이다.

미국등록특허 US 6586233 B2호는 상부 온도구역 및 하부 온도구역을 갖는 챔버뿐만 아니라 상부 및 하부 온도구역을 서로 연결시키는 덕트를 갖는 PCR을 수행하기 위한 시스템을 개시하고 있다. 대류 펌핑에 의해, 시료 액체는 온도 변화를 달성하기 위해 상부 및 하부 온도구역을 통해 반복적으로 가이딩된다.

국제공개 WO 2007/143034 A1호에서 PCR을 수행하기에 적합하고 온도변화가 광학적으로 유도되는 방법이 개시되어 있다. 예를 들어, 티타늄-사파이어 레이저 또는 나노입자 또는 아르곤-이온 레이저가 있는 금 박막의 펨토초 펄스를 가진 나노입자에 조사하는 것이 제안되었다.

유럽공개특허 EP 2809806A1호는 열방출을 위한 레이저에 의해 여기되는 반응부피 내의 나노입자 상의 PCR에 의한 핵산의 증폭방법이 개시되어 있다. 나노입자는 PCR의 프라이머에 접합된다.

독일공개특허 DE 19543060 A1에는 전해질 용액의 끓는점을 초과하는 온도에서 직접 가열된 와이어-형태의 전극에서 전기화학적 측정을 수행하기에 적합한 방법이 개시되어 있다. 이를 위해 시료는 단기간의 강한 교류 펄스로 전해질 용액의 끓는점보다 높은 고온으로 가열되지만 나머지 용액의 온도는 사실상 영향을 받지 않는다. 그 후, 국소적인 과잉 온도가 급격히 떨어져 전해질 용액의 비등 및 다른 방해 유발 효과는 피해야 한다.

독일공개특허 DE 199600398 B4에는 생화학적 분석에 적합한 방법이 개시되어 있으며, 여기서, 전기화학적 센서의 전극은 그 표면에서 핵산분자 또는 그 분획으로 변형되고, 타겟서열의 검출을 위한 프로브 서열로 작용한다. 상기 센서는 교류에 의해 직접 가열되는데, 여기서 전극 표면에 가까운 검사중인 용액의 단순히 매우 얇은 층이 가열되지만 용액의 대부분은 실질적으로 변하지 않는 온도로 유지된다.

Reske, Flechsig 등은 "보호 스트랜드에 의한 오스뮴 테트록사이드로 라벨링된 PCR 제품의 전기화학적 검출", Talanta 74(2007), pages 393-397에서 중합효소연쇄반응의 제품의 전기화학적 검출방법을 보고하고 있다. 여기서, 우선 검출하고자 하는 DNA를 증폭하기 위해 통상적인 PCR이 수행된다. 그런 다음 증폭된 DNA 이중가닥을 분리하고 전기화학적으로 활성인 오스뮴테트록사이드 바이피리딘(osmium tetroxide bipyridine)으로 표시한다. 이것들은 금 전극과 접촉하게 되고, 그 위에 DNA-프로브 가닥이 고정화된다. 볼타메트릭(voltammetric) 측정을 통해, 저자들은 프로브 스트랜드에 표시된 스트랜드의 하이브리드화을 감지하고자 하였다.

Duwensee, Flechsig 등은 "비대칭 대류 중합효소연쇄반응의 전기화학적 생성물 검출"; Biosensors and Bioelectronics 25 (2009), pages 400-405에서 대류에 의한 PCR을 수행하는 방법을 보고하고 있다. 이를 위해, 백금 와이어를 시료 튜브의 하부 영역을 통해 유도하고 최대 45분의 실험기간 동안 열전류를 공급함으로써 89℃의 예상 온도로 가열하였다. 또한, 시료 튜브를 50℃의 수조에 방치하였다. 상기 저자들은 반응부피 내에서 두 개의 (와류) 소용돌이가 있고 가열 와이어와 평행하게 달려 있는 중심축을 가진 대류가 발생했다고 보고하고 있다.

본 발명의 목적은 가열되는 반응부피에서 핵산의 증폭을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 또한, 반응부피를 수용하기 위한 반응용기 및 가열수단을 갖는 장치의 새로운 용도를 제공하는 것이다. 마지막으로, 본 발명의 목적은 반응부피를 수용하기 위한 반응용기 및 가열수단을 갖는 반응부피에서 핵산의 증폭을 위한 개선된 장치를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 관점에서 그 목적은 반응부피에서 PCR에 의한 핵산의 증폭방법을 통해 달성되는데, 여기서 상기 반응부피는 전기에너지를 사용하여 가열되며, PCR의 증폭주기 중 적어도 하나에서, 반응부피를 반응부피의 값으로 가열시키는 변성단계에서 사용되는 전기에너지의 비율은 20 Joule/mL 미만이다.

본 발명에 있어서, PCR은 변성, 하이브리드화 및 신장단계로 구성된 증폭주기가 반복적으로 통과하고, 실제로 바람직하게는 이 순서로 수행되는 핵산의 증폭방법이다. 사이클의 각 단계에서 핵산분자의 수는 증가할 수 있어(최상의 경우 시나리오에서는 일반적으로 두 배가 됨), 핵산분자의 수가 기하급수적으로 증가할 수 있다. 증폭되는 핵산을 이하 "원본(original)"이라 칭한다. 원본은 단일가닥이며 상보적 가닥과 함께 "보체(complement)"라고 이중가닥을 형성할 수 있다. 원본 및 보체 또한, 더 큰 핵산의 일부가 될 수 있다. 특히 PCR에서, 증폭주기의 하나의 경로에서 생성된 원본의 카피는 후속의 경로에서 보체를 형성하기 위한 주형을 형성할 수 있고 생성된 보체의 카피는 주기의 후속 경로에서 원본의 형성을 위한 주형이 될 수 있다. 증폭산물에 대한 일반적인 용어는 "앰플리콘(amplicon)"이다.

변성단계는 핵산 이중가닥을 변성시키는데, 즉 2개의 단일가닥으로 분리시킨다. 예를 들어, 변성단계에서 원본은 보체와 분리될 수 있다. 본 발명에 따라 바람직한 변성유형은 열변성("용융(melting)"이라고도 함)이다. 이를 위해, 핵산 이중가닥 또는 전체 이중가닥의 적어도 일부가 핵산 이중가닥의 분리를 야기하거나 적어도 권장하는 "변성온도"로 설명되는 온도에 노출된다. 바람직한 변성온도는 한편으로는 핵산 이중가닥을 분리할 수 있을 정도로 높게 선택된다. 반면에, 바람직한 변성온도는 너무 낮아서 시료에도 존재할 가능성이 있는 DNA 중합효소가 현저하게 손상되지 않도록 선택된다. 변성온도의 일반적인 값은 95℃이다.

본 발명의 하기 설명을 용이하게 하기 위해, "변성단계"가 본 발명의 용어에서 사용되는데, 여기서 반응부피를 가열하고 이렇게 이중가닥 핵산 분자의 변성을 야기하기 위하여 가열수단이 열을 생성한다. 따라서, 변성단계의 기간은 가열수단이 변성단계와 관련된 PCR 사이클의 경로에서 열을 생성하는 시간의 합이다. 가열수단으로 사용되는 발열 저항체의 경우, 변성단계의 지속시간을 의미하며, 따라서 반응부피를 가열하고 이러한 방식으로 이중가닥 핵산분자의 변성을 일으키기 위해 가열수단에 의한 전기 전달의 지속시간을 의미한다. 증폭주기의 경로 내의 가열수단이 하나의 시간이 아닌 서로 분리된 시간 간격으로 열을 발생시키는 경우(후술된 바와 같이, 효과적일 수 있음), 변성단계의 지속시간은 이들 간격의 지속시간의 합이다. 이러한 방식으로 정의된 변성단계에서, 특히 존재하는 온도가 여전히 변성에 필요한 범위 내에 있다고 할지라도 가열수단 그 자체의 열용량에 기초한 열방출은 포함되지 않으며 가열수단에 인접한 반응부피의 부분에서 온도가 내려가지도 않는다. 이는 특히, 본 발명에 따른 방법에서, 변성이 이와 같이 정의된 변성단계 후에도 여전히 일어날 수 있음을 의미한다. 또한, 변성단계에서 방출되는 열은 일반적으로 변성단계에서 생성되는 열보다 작다는 것을 의미한다.

더욱이 PCR은 바람직하게는 "프라이머"로 기술되는 적어도 2개의 올리고뉴클레오티드, 즉 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 사용한다. 정방향 프라이머는 원본의 3'- 말단에 상보적이고, 역방향 프라이머는 보체의 3'-말단에 상보적이다. 하이브리드화 단계("어닐링 단계"라고도 함)에서, 정방향 프라이머 및/또는 역방향 프라이머는 원본 또는 보체 또는 앰플리콘에서 이에 상보적인 서열과 하이브리드화한다. 하이브리드화 단계는 통상적으로 정방향 및 역방향 프라이머의 원본 또는 보체 또는 앰플리콘에서의 그 상보적인 서열에 대한 하이브리드화를 초래하거나 적어도 촉진시키는 온도에서 발생한다. 가능한 한 특이적인 프라이머의 하이브리드화를 촉진시키도록 바람직하게 선택된다. 하이브리드화 온도는 일반적으로 50℃ 내지 72℃이다.

신장단계에서, 하이브리드화된 프라이머는 중합효소에 의해 상보적으로 연장된다. 따라서, 정방향 프라이머, 보체로부터 시작하고, 역방향 프라이머로부터 시작하여 원본을 합성할 수 있다. 신장의 목적을 위해, 중합효소는 신장을 용이하게 하거나 적어도 촉진하는 온도에 노출된다. 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, Taq) 중합효소를 사용하는 경우 72℃의 신장온도가 일반적으로 사용된다. PCR의 일부 실시예에서 하이브리드화 및 신장온도는 동일하며, 즉 두 단계 모두 동일한 온도에서 일어난다(이는 PCR 동안 결합된 하이브리드화 및 신장온도 및 변성온도 동안 단지 2 개의 온도 수준이 있음을 의미한다.).

"핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 본 발명의 문맥에서, 상기 언급된 것이 바람직하더라도, (데옥시)-리보핵산 및 (데옥시)-올리고리보뉴클레오티드뿐만 아니라 백본(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptic nucleic acids, PNA), 특히 슈가 백본(2'-O- 알킬 유도체, 3'- 및/또는 5'-아미노리보스, 고정된 핵산(locked nucleic acid, LNA), 헥시톨 핵산, 모르 폴리노(morpholinos), 글리콜 핵산(GNA), 트레오핵산(TNA) 또는 트리시클로-DNA - 이와 관련하여 "Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA", J. Am. Chem. Soc, 2002, Volume 124, pages 5993 논문에 따라 참조) 상에 변형을 갖는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 염기 유사체, 예를 들어 7- 데아사 퓨린(7-deazapurine) 또는 유니버설 염기, 예컨대 니트로인돌 또는 변형된 천연 염기, 예컨대 N4-에틸-시토신을 함유하는 핵산 및 올리고뉴클레오디드를 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서, 핵산 또는 올리고뉴클레오티드는 비뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 PNA와의 콘쥬게이트 또는 키메라이다. 본 발명의 일 실시예에서, 핵산 또는 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 위치에 스페이서(spacer)와 같은 비뉴클레오시드 유닛, 예를 들면, 헥사에틸렌글리콜 또는 3 내지 6의 n을 갖는 Cn-스페이서를 포함한다. 핵산 또는 올리고뉴클레오티드가 변형물을 함유하는 경우, 이들은 변형과 함께 천연 DNA/RNA 분석물과 하이브리드화가 가능하도록 선택된다. 바람직한 변형은 용융거동, 바람직하게는 용융온도에 영향을 미치며, 특히 이들의 염기의 상이한 정도의 상보성을 갖는 혼성체를 분화할 수 있다(불일치 차별). 바람직한 변형은 LNA, 8-아자-7-데아사퓨린(8-aza-7-deazapurine), 5-프로피닐-우라실 및 시토신 및/또는 핵산 또는 올리고뉴클레오티드에서의 무분별한 중단 또는 변형을 포함한다. 본 발명의 의미에서의 추가의 변형은 예를 들어 바이오틴, 티올 및 형광 도너 및 형광수용체 분자에 의한 변형이다.

본 발명에 따른 방법은 반응부피에서 일어난다. 본 발명에 따라 이는 핵산의 증폭이 응집반응부피의 적어도 일부에서 일어난다는 것을 의미한다. 반응부피는 용매 또는 현탁 매질, 바람직하게는 물 이외에 통상 증폭되는 핵산(또한 "타겟핵산"이 또한, 이후에 사용됨)을 함유하는 액체 용액 또는 현탁액이다. 또한, 일반적으로 현탁되거나 용해될 수 있는, 원본 및 보체 및/또는 다른 구성요소, 예를 들어 중합효소(들), dNTPs 및 염류가 포함된다.

본 발명의 의미에서 "가열에 사용된 전기에너지"는 반응부피를 가열하기 위해 직접 또는 간접적으로 사용되는 에너지이다. 이 정의에 따르면 이는 일반적으로 반응부피에 공급되는 열과는 다르다. 이 차이는 예를 들면 가열수단으로 발열 저항체를 사용할 때 거의 볼 수 없거나 전혀 볼 수 없는데, 왜냐하면 이 경우에 가열에 사용된 전기에너지는 발열 저항기의 적절한 배치로 가열에 사용된 전기에너지가 거의 완전하게 상기 반응부피에 공급될 수 있는 방식으로 가열에 사용되는 전기에너지가 전류 흐름을 통해 발열 저항체에서 거의 완전히 열로 변환되기 때문이다. 그러나 이 경우의 가열에 사용되는 전기에너지는 레이저가 작동하는 전기에너지이기 때문에, 열방출을 위해 레이저로 나노입자가 여기되는 유럽공개특허 EP 2809806 A1에서 공지된 방법의 경우에, 그 차이가 확연하여 레이저 및 나노입자를 통한 우회로까지는 반응부피를 가열하지 않는다. 레이저 및 나노입자를 통한 우회로의 낮은 정도의 효율로 인해 가열에 사용되는 전기에너지의 작은 부분만이 실제로 반응부피에 열로 공급된다.

본 발명과 관련하여 "반응부피의 가열"과 관련하여 언급되는 경우, 이는 본 발명의 의미에서 모든 반응부피가 가열되어야 한다는 것을 의미하는 것은 아니며, 고르게 가열될 필요는 없다. 그 대신, 본 발명의 의미에서 반응부피의 부분의 비균질 가열 또는 가열만이 반응부피의 가열로 간주된다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 반응부피에서 PCR에 의하여 핵산을 증폭시키는 방법에 의해 달성되는데, 여기서 하나 또는 복수 개의 전기적으로 접촉하는 가열요소로 구성된 가열수단이 반응부피와 접촉하고, 반응부피를 가열하고, PCR의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서 가열수단은 변성단계에서 생성된 열을 C_R*5℃(섭씨온도)보다 반응부피에 적게 공급한다. C_R은 가열수단에 의한 가열 동안의 반응부피의 열용량이다(여기 및 이후에서 몸체의 열용량은 대문자 "C"로 표시되지만, 비열용량(specific heat capacity)은 소문자 "c"로 표시함). 다시 말하면, 다른 열 유입 및 유출을 고려하지 않고 가열수단은 반응부피를 평균 5℃ 미만으로 가열한다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 반응부피에서 PCR에 의하여 핵산을 증폭시키는 방법에 의해 달성되며, 여기서 반응부피와 접촉하는 가열수단은 반응부피를 가열하는데, PCR의 증폭주기 중 적어도 하나의 경로에서, 변성단계를 통해 일어나는 평균온도의 최대 증가(이하, 반응부피의 "MGTE"라고도 함)는 10℃ 미만이다.

따라서, 본 발명의 의미에서의 가열수단은 가열요소의 합이다. 본 발명의 의미에서 "접촉"은 가열요소 및 반응부피에 관하여 반응부피가 가열요소의 영역에 인접한다는 것을 의미한다. 가열요소가 가열요소의 열 생성성분과 반응부피 사이에 배치된 물질(이하 "분리층"이라고도 함)을 포함하는 경우, "접촉"은 가열요소가 접촉하는 것을 의미하고, 반응부피를 향한 이 분리층의 면을 통해 반응부피와 접촉한다는 것을 의미한다. 가열요소와 반응부피 사이의 이러한 접촉의 달성가능한 이점은 반응부피가 가열요소 근방에 있는 가열요소에 의해 가열될 수 있다는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 반응부피에서 PCR에 의하여 핵산을 증폭시키는 방법에 의해 달성되며, 여기서 가열수단은 PCR의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서 상기 반응부피와 접촉하는, 반응부피를 가열하는 하나 또는 그 이상의 가열요소로 이루어지며, 가열수단은 변성단계에서 생성된 열을 C_R*5℃보다 반응부피에 적게 공급하고, C_R은 가열수단을 통한 가열 동안의 반응부피의 열용량이며, 전체 변성단계 동안 반응부피와 접촉하는 가열수단의 면적의 10% 이상에서 일시적으로 안정한 온도경사가 확립되지 않는다.

온도경사는 가열요소에 의한 가열의 개시 t₀ 후의 시간 t₁에서, 시간 t₂= t₀ +2^*(t₁-t₀)에서의 최대 경사량 시점 t₁에서의 최대 경사량에 대하여 20% 미만으로 변화한다면 본 발명의 의미에서 "일시적으로 안정한"것으로 간주된다. 일시적 안정성을 확인하기 위해, 이는 관련성이 있는 최대 경사량의 비교일 뿐, 가열수단이 시간 t₂에서 열을 발생시키는지 여부에 관한 것이 아니다. 바람직하게는, 시간 t₂에서 경사량은 10% 미만, 특히 바람직하게는 5% 미만, 특히 바람직하게는 3% 미만, 특히 바람직하게는 1% 미만으로 변한다. 경사는 일반적으로 가열수단의 표면에서 최대 기울기를 갖는다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 반응부피를 수용하기 위한 반응용기 및 반응부피를 가열하기 위하여 반응부피와 접촉하는 하나 또는 그 이상의 가열요소로 구성된 가열수단을 포함하고 반응부피에서 핵산의 증폭을 위해, 가열요소 중 적어도 하나는 올리고뉴클레오티드에 접합되어 있는 장치의 사용에 의해 달성된다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은, 반응부피를 가열하기 위하여 반응부피와 접촉할 수 있는 하나 또는 그 이상의 가열요소로 구성된 가열수단을 포함하는 반응부피에서 핵산을 증폭시키는 장치에 의해 달성된다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 반응부피에서 핵산을 증폭시키는 장치에 의해 달성되는데, 상기 장치는 전기에너지를 사용하여 반응부피를 가열하기 위한 하나 또는 그 이상의 가열요소로 구성된 가열수단과, 상기 전기에너지를 상기 장치로 전달하는 수단을 포함하고, 상기 장치는 그 전력소비가 임의의 시점에서 50 W(Watt)를 초과하지 않도록 설계된다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 반응부피를 수용하기 위한 반응용기, 전기에너지를 사용하여 반응부피를 가열하기 위한 하나 또는 그 이상의 가열요소로 구성되는 가열수단 및 전기에너지를 장치로 가져오는 수단을 포함하는 반응부피 내의 핵산의 증폭장치에 의하여 달성되고, 상기 장치는 PCR 동안 임의의 시점에서 전력소비와 반응용기의 용량 사이의 비율이 1 W/㎖(밀리리터 당 와트)를 초과하지 않도록 설계된다. 이 제한은 기술적 기반의 기동전류로 인해 발생할 수 있는 장치의 스위치 온 프로세스 동안의 더 높은 전력소비에는 적용되지 않는다. 이러한 증가된 전력소비는 PCR 동안 전력소모로 간주되지 않으므로 여기서는 고려하지 않는다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 반응부피를 수용하기 위한 반응용기, 하나 또는 그 이상의 가열 저항체로 구성된 가열수단 및 제어장치를 포함하는 PCR에 의해 반응부피에서 핵산을 증폭시키는 장치에 의해 달성되며, 상기 반응부피를 가열하기 위해 상기 가열수단에 전류를 인가하고, 상기 제어장치는 PCR의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서, 변성단계에서 제어장치에 의해 가열요소에 인가된 전기에너지와 반응용기의 용량 사이의 비율이 40 J/mL(쥴/밀리리터) 미만이다.

본 발명의 또 다른 관점에서, 본 발명의 목적은 반응부피를 위한 반응용기, 상기 반응부피를 가열하기 위한 적어도 하나의 가열요소로 구성되는 가열수단, 상기 반응부피로 상기 가열수단의 열방출을 조절하기 위한 제어장치를 포함하는 PCR에 의하여 반응부피에서 핵산의 증폭장치에 의하여 달성되고, 상기 제어장치는 상기 PCR의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서, 변성단계에서 상기 가열수단에 의해 상기 반응부피로 방출되는 열량과 반응부피를 수용하기 위한 상기 반응용기의 용량이 20 J/mL 미만이고, 상기 가열수단의 하나 이상의 가열요소가 하나 이상의 방향에서 1.5㎛(마이크로미터)보다 큰 확장부를 가진다.

본 발명은 그 중에서도 공지된 증폭방법에서, 핵산 증폭의 상이한 단계에 대해 확립될 필요가 있는 반응부피의 온도에 요구되는 열처리의 지속시간이 방법 기간에 대해 상당히 기여하고 이들 상을 단축시킴으로써 상기 방법 기간을 단축할 수 있다. 또한, PCR에 요구되는 하나 이상의 온도가 반응부피의 일부에서만 달성될 때 상기 방법을 효율적으로 수행할 수 있다는 것도 본 발명가의 인식에 기초한다. 본 발명은 또한 종래기술에서보다 훨씬 낮은 에너지 사용으로 이것이 달성될 수 있다는 인식에 기초한다.

특히, 예를 들어 짧은 전기 임펄스의 도움으로, 바람직하게는 반응부피에서 핵산분자의 변성을 수행하기 위하여 가열수단의 가열요소(들)의 바로 근처만이 짧은 시간 동안 가열되는 반면, 대다수의 반응부피는 특히 신장, 바람직하게는 하이브리드화가 일어날 수 있는 (이 의미에서 "글로벌(global)") 기저 온도로 유지된다. 이는 바람직하게는 가열수단을 통한 가열의 지속시간이 너무 짧아서 주변 반응부피에서 발생하는 열필드가 단지 수 마이크로미터 확산될 수 있고, 이러한 방식으로 가열부피를 생성하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 반응부피의 단지 작은 분획을 포함한다. 특히, 열량이 너무 낮아서 반응부피의 실질적으로 전체적인 가열이 일어나지 않을 수 있다.

본 발명의 의미에서 "전체 온도(global temperature)"는 반응부피의 부피에 대한 평균온도이고, 그 열처리 후에 반응부피에서 설정되거나 설정될 온도이다. "전체 가열(global heating)"은 이런 방식으로 정의된 전체 온도 상승이다.

또한, 가열 후, 특히 변성단계에서, 가열 영역(heating-up zone)으로부터 나머지 반응부피로 확산되는 열은 단지 무시할 정도로 전체 온도 상승을 초래한다는 것이 본 발명에 의해 달성될 수 있다. 여기서 "무시할 수 있는(Negligible)" 것은 온도 상승이 바람직하게는 핵산분자의 변성에 대해 너무 낮고, 특히 바람직하게는 온도 상승이 너무 낮아 하이브리드화 및 신장을 방해하지 않는다는 것을 의미한다.

따라서, 변성 및 바람직하게도 핵산 증폭의 다른 단계는 가열요소의 바로 근처에서 국부적으로 일어날 수 있고, 여기서 필요한 프라이머 중 적어도 하나는 앰플리콘이 거기에서 형성되고, 따라서 국소 가열에 의한 변성을 촉진시키기 위하여 가열수단 상에 고정(이하, "기능화된(functionalised)"이라 칭한다)되어 있다. 다시 말하면, 가열수단의 기능화에 기초하여, PCR의 단계의 위치, 특히 하이브리드화, 신장 및/또는 변성뿐만 아니라 바람직하게는 PCR의 진행을 관찰하기 위한 신호의 생성은 가열수단의 바로 근처에서 이루어지며, 반응부피의 가열은 반응부피의 일부분으로 제한될 수 있다.

본 발명으로 핵산이 보다 신속하게 증폭될 수 있다는 것이 달성된다. 특히, 가열 및 냉각 공정이 수초 지속되는 종래의 열순환기와 대조적으로, PCR의 지속시간은 가열 및 냉각속도와 같은 기술적 한계에 의해 더 이상 결정되지 않는다는 것이 본 발명에 의해 달성될 수 있다. 열이 가열수단의 부근에서 일정하게 생성되기 때문에 반응용기 내에서의 가열시간도 생략될 수 있다. 본 발명자들은 PCR의 증폭주기가 40회인 경우에도 핵산분자의 변성 및 신장 및 혼성화 온도로의 냉각이 단지 수 밀리초만 걸린다는 것을 확인하였다. 본 발명을 통해 PCR의 지속시간은 확산 및 반응 공정 및 중합효소에 의한 신장과 같은 생화학적 공정에 필요한 변성단계 사이의 기간에 의해 주로 결정된다는 것을 알 수 있다.

또한, 핵산이 보다 낮은 에너지 사용으로 증폭될 수 있다는 것도 본 발명으로 달성할 수 있다. 또한, 본 발명은 증폭 공정이 보다 효과적으로 제어되도록 하고, 예를 들어 공지된 방법에서 온도 제어 내에서 발생하는 반응부피의 온도 변동을 광범위하게 피할 수 있다. 핵산의 증폭을 위한 보다 비용적으로 효율적이고 보다 컴팩트한 장치가 본 발명에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 범용 직렬 버스 (universal serial bus, USB) 스틱 형태의 핵산의 증폭을 위한 본 발명에 따른 장치를 제공하는 것이 달성될 수 있다.

도 1a는 스위치가 개방될 때 전류 흐름이 없는 프라이머로 기능화된 가열요소를 개략적으로 도시한 도면이다. 가열요소의 근처에 프리 DNA 서열이 있다.
도 1b는 스위치가 개방될 때 전류 흐름이 없는 DNA-기능화된 가열요소를 개략적으로 도시한 도면이다. 프라이머 및 타겟핵산의 이중체가 가열요소 상에 형성되고 이미 부분적으로 신장되어 있다.
도 1c는 스위치가 폐쇄될 때 전류가 흐르는 DNA-기능화된 가열요소를 개략적으로 도시한 도면이다. 이중가닥의 변성이 가열요소 상에서 일어나므로 신장된 프라이머 만이 남아있게 된다.
도 2a는 이전에 가열된 원통형 가열요소의 냉각 단계에서의 온도의 공간적 및 시간-기반 진행을 도시한 도면이다.
도 2b는 가열 중에 상이한 직경의 원통형 가열요소의 표면 온도의 시간-기반 진행을 도시한 도면이다.
도 2c는 냉각 중에 상이한 직경의 원통형 가열요소의 표면 온도의 시간-기반 진행을 도시한 도면이다.
도 2d는 가열되지 않은 원통형 캐리어상의 미리 가열된 금 필름의 냉각 단계에서의 온도의 공간적 및 시간-기반 진행을 도시한 도면이다.
도 3a는 전류 펄스를 발생시키는 전자 회로를 도시한 도면이다.
도 3b, 도 3c 및 도 3d는 가열요소를 포함하는 반응용기의 가능한 실시예를 도시한 도면이다.
도 3e는 상이한 전류 흐름, 즉 가열요소로 가열하는 수용액에서의 전체 온도 상승을 도시한 도면이다.
도 4는 게놈 템플릿으로 국소적으로 가열하는 실시간 PCR을 보여준 도면이다.
도 5a, 도 5b 및 도 5c는 가열수단의 작동을 위해 상이한 전압을 사용하여 게놈 템플릿으로 국소적으로 가열된 실시간 PCR을 도시한 도면이다.
도 5d, 도 5e, 도 5f 및 도 5g는 많은 다른 가열요소를 사용하여 게놈 템플릿으로 국소적으로 가열된 실시간 PCR을 보여준 도면이다.
도 6a는 전기적으로 가열될 수 있는 허니컴 구조를 도시한 도면이다.
도 6b는 전기적으로 가열될 수 있는 허니컴 구조체의 상세 도면이다.
도 6c는 국소 가열을 위한 허니컴 구조체를 사용하여 게놈 탬플릿으로 국소적으로 가열하는 실시간 PCR을 도시한 도면이다.
도 7은 정방향 및 역방향 프라이머가 모두 기능화된 국부적 가열 및 가열요소를 갖는 실시간 PCR을 도시한 도면이다.

개별적으로 또는 서로 조합하여 사용될 수 있는 바람직한 실시예 및 세분화는 종속항의 주제이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서 반응부피의 크기에 대한 반응을 가열하기 위한 변성단계에서 사용된 전기에너지의 비가 20 J/mL 미만, 바람직하게는 10 J/mL 미만이다. 본 발명의 상기 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 방법의 낮은 에너지 소비가 유리하게 달성될 수 있다. 또한, 변성단계에서의 에너지의 첨가가 너무 커서 반응부피의 과도한 전체 가열을 유도하는 것이 유리하게 회피될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서 반응부피의 크기에 대한 반응을 가열하기 위한 변성단계에서 사용된 전기에너지의 비가 0.01 내지 30 W/mL (Watt/millilitre), 바람직하게는 0.05 내지 10 W/mL, 특히 바람직하게는 0.1 내지 5 W/mL이다.

본 발명의 일 실시예에서, 변성단계는 서로 이격된 복수의 시간 간격을 포함하고, 여기서 가열수단은 변성단계와 관련된 PCR 사이클의 경로에서 열을 생성한다. 각각의 경우에, 전류 펄스의 시간 간격의 시간-기반 거리는 시료 열화시간보다 훨씬 작아야 한다; 특히 바람직하게는 전류 펄스들의 시간 간격의 시간-기반 거리가 시간 간격들 사이에 가열수단의 온도가 20% 미만이 되도록 선택되어야 한다. 본 발명의 이러한 실시예는, 예를 들어 스위칭 전원이 에너지 공급에 사용되는 경우에 유리할 수 있다. 특히 바람직하게는 변성단계는 전류 임펄스 또는 복수의 전류 임펄스를 통해 실현되며, 바람직한 실시예에서 시간 지속기간 또는 전류 임펄스(들) 동안의 전류 세기의 절대량은 10% 미만만큼 변한다. 이러한 방식으로 반응부피의 가열에 대한 매끄러운 동역학을 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 반응부피의 크기에 대한 반응을 가열하기 위한 변성단계에서 사용된 전기에너지의 비가 10 mJ/mL (millijoules/millilitre) 초과, 바람직하게는 30 mJ/mL 초과, 특히 바람직하게는 100 mJ/mL 초과이다. 에너지는 일 실시예에서 이 사용된 전력과 변성단계의 지속시간의 곱으로부터 단지 일정한 전력을 사용하여 계산된다. 에너지가 충분히 크다는 것이 본 발명의 실시예의 달성가능한 이점이다. 반응부피와 접촉하는 영역을 갖는 가열수단을 작동시키기 위해서는 PCR의 반응 속도론을 실시하는 데에 있어서 그 크기가 통상적인 요건을 충족시키기에 충분하다.

바람직하게는 PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 특히 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개에서, 가열수단은 반응부피에 C_R * 5℃(섭씨)보다 변성단계에서 발생된 열을 덜 공급한다. C_R은 가열수단에 의한 가열 동안 반응부피의 열용량이다. 다시 말하면, 다른 열 유입 및 유출이 고려되지 않은 경우, 가열수단은 반응부피를 평균 5℃ 미만으로 가열한다.

바람직하게는 PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 특히 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 반응부피의 최대 MGTE는 10℃ 미만, 특히 바람직하게는 7℃ 미만, 특히 바람직하게는 5℃ 미만, 특히 바람직하게는 4℃ 미만, 특히 바람직하게는 3℃ 미만, 특히 바람직하게는 2℃ 미만, 특히 바람직하게는 1℃ 미만, 특히 바람직하게는 0.75℃ 미만, 특히 바람직하게는 0.5℃ 미만 및 가장 특히 바람직하게는 0.3℃ 미만이다.

MGTE에 대한 4℃ 이상의 값은 PCR 과정에서 결합된 하이브리드화 및 신장 온도가 증가하면 특히 유리할 수 있는데(예를 들어, 가열요소 상의 국소 앰플리콘 밀도가 PCR 과정에서 많이 증가하기 때문이다), 즉 국부 가열을 통해 전체 온도 또한 (약간) 변화시키기 위해서이다. 또한, 이러한 방식으로, 예를 들어 온도-조절 블록에 의해 외부적으로 제공되는 열 전력이 감소될 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 장치의 전체 전력 요구를 더욱 감소시킬 수 있다. MGTE에 대한 낮은 값은 매우 빠르게 연속적으로 PCR 증폭주기의 경로를 순차적으로 수행할 수 있거나 근방에 대하여 시료를 잘 단열시킬 수 있게 하기 위하여 유리할 수 있으며 그럼으로써 주변 환경과 무관하게 만든다. 예를 들어 결합된 하이브리드화 및 신장온도가 70℃이고 변성단계 후의 반응부피의 용적 측정된 평균 온도가 70.6℃로 증가하면 MGTE = 0.6℃가 된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서 변성단계 동안 가열수단과 반응부피의 접촉면의 10% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 특히 바람직하게는 50% 이상, 특히 바람직하게는 80% 이상에서 일시적으로 안정한 온도구배가 확립되지 않는다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 변성 단계의 지속시간의 적어도 절반 동안 PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 온도 경사의 최대 기울기는 0.5℃/㎛보다 크고, 특히 바람직하게는 1℃/㎛보다 크고, 가장 특히 바람직하게는 3℃/㎛보다 크다. 본 발명의 이 실시예의 달성 가능한 이점은 온도 상승의 위치 파악이 반드시 경사의 형성이 필요하기 때문에 가열요소에 의해 초래되는 온도 증가의 양호한 위치 파악을 달성하는 것이다(따라서 이 실시예에서 온도 경사는 일시적으로 일정한 필요가 없다).

본 발명의 바람직한 실시예에서, 변성 단계의 지속시간의 적어도 절반 동안 PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 세 개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 온도 경사의 최대 기울기는 1000℃/㎛ 미만, 특히 바람직하게는 300℃/㎛ 미만이다. 본 발명의 이 실시예의 달성가능한 장점은 용액에서의 열확산 효과(thermophoretic effects)를 피할 수 있다는 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 사이클 지속기간 t_c는 60s(초) 미만, 바람직하게는 40초 미만, 특히 바람직하게는 20초 미만, 특히 바람직하게는 15초 미만, 특히 바람직하게는 10초 미만이다. 본 발명의 의미에서, 사이클 지속기간 t_c는 변성, 하이브리드화 및 신장단계가 이 순서로 이루어진 중합효소연쇄반응의 증폭주기의 경과기간이다. 특히 짧은 사이클 지속시간 t_c을 선택함으로써, 본 발명의 이 실시예에서 특히 신속한 PCR 방법이 실현될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서 PCR t_PCR의 지속시간은 45분 미만, 특히 바람직하게는 30분 미만, 특히 바람직하게는 20분 미만, 특히 바람직하게는 15분 미만, 특히 바람직하게는 10분 미만이다. 지속시간은 PCR의 시작부터 종료까지의 시간이며, 여기서 PCR의 시작은 변성단계, 하이브리드화 단계 및 신장단계가 이 순서로 구성된 증폭주기의 첫 번째 완전한 경로의 변성단계의 시작 시점이고, PCR의 종료는 변성단계, 하이브리드화 단계 및 신장 단계가 이 순서로 이루어진 증폭주기의 최종 완전한 경로의 변성단계의 종료이다.

가열수단

본 발명의 바람직한 실시예에서, 반응부피는 하나 또는 그 이상의 가열요소로 구성된 가열수단에 의해 가열되고, 여기서 특히 바람직하게는 가열요소 또는 적어도 하나의 가열요소, 특히 바람직하게는 모든 가열요소가 전기적으로 접촉되어 있다. 이러한 방식으로 전류가 가열요소를 통해 흐를 수 있다는 것이 유리하게 달성될 수 있다. 본 발명의 이 실시예는 전기적으로 접촉하는 가열요소가 전기 제어장치에 의해 특히 간단하게 작동되고 조절될 수 있다는 사실을 이용할 수 있다.

가열요소 또는 가열요소 중 하나는 바람직하게는 전류 흐름을 예를 들어 그 옴저항을 통해 열로 변환하는 장치이다. 본 발명의 이러한 실시예는 이러한 가열요소가 전기에너지를 효율적으로 열로 변환할 수 있다는 사실을 이용할 수 있다. 바람직한 가열요소는 발열 저항체 또는 펠티에 소자(Peltier element)이다. 다수의 가열요소의 경우, 이들은 직렬 또는 병렬로, 또는 부분적인 직렬 및 부분적인 병렬로 배열될 수 있다. 바람직한 가열요소는 가열요소의 열 발생 성분과 반응부피 사이에 배열되는 물질을 가질 수 있다. 이러한 물질은 예를 들어 PCR 화학과의 부식 또는 다른 화학적 상호작용으로부터 가열요소를 보호하고/하거나 전기적으로 절연하기 위해 유용 할 수 있으며(따라서 "분리층"으로 여기에서 설명됨), 예를 들어 고분자 화합물로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 가열요소 및 반응부피는 500㎛ 미만, 바람직하게는 100㎛ 미만, 바람직하게는 20㎛ 미만의 두께, 바람직하게는 5㎛ 미만, 바람직하게는 1㎛ 미만의 두께, 바람직하게는 0.2㎛ 미만의 두께, 바람직하게는 0.05㎛ 미만의 두께의 분리층에 의해 최대로 분리된다. 가장 특히 바람직한 추가의 실시예에서 가열요소와 반응부피 사이에 분리층이 존재하지 않거나 또는 분리층의 열적 특성은 반응부피에 대한 가열수단의 열 방출에 대한 효과가 무시할 수 있도록 선택된다.

가열요소의 모든 곳에서 가능한 한 균등하거나 안정한 온도에 도달하는 것이 유리할 수 있다. 이것은 예를 들어, 발열 저항체의 각 서브-피스(sub-piece) 또는 서브-볼륨(sub-volume)에서, 가열시 균등한 전류밀도 및 일정한 표면/체적비(OVV)가 된다는 점에서 발열 저항체의 경우에 달성될 수 있다. 이는 전체 가열요소에서 도체의 길이 단위당 일정한 도체 단면 및 일정한 전압 강하가 보장된다는 점에서 유리하게 달성될 수 있다. 복수 개의 가열요소의 경우, 이들은 동일한 방식으로 본 발명의 바람직한 실시예에서 반응부피를 가열한다. 그러나 본 발명은 또한 가열요소가 예를 들어 상이한 길이의 시간 또는 상이한 강도로 반응부피를 다르게 가열하는 실시예를 포함한다. 가열수단의 가열요소는, 예를 들어 그 길이 또는 기하학적 구조와 관련하여 동일하거나 상이할 수 있다.

반응부피는 하나 또는 그 이상의 가열요소로 구성된 가열수단에 의해 바람직하게 가열되며, 여기서 특히 바람직하게는 가열요소 또는 하나 이상의 가열요소, 특히 바람직하게는 모든 가열요소가 반응부피와 접촉한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 가열요소 중 적어도 하나는 그 전체 표면상에서 반응부피에 접한다. 특히 바람직하게는 모든 가열요소가 전체 표면상의 반응부피에 접한다. 반응부피가 가열요소 부근의 각각의 가열요소에 의해 효율적으로 가열될 수 있다는 것이 본 발명의 이 실시예의 달성가능한 장점이다. 또한, 본 발명의 이 실시예를 통해, 높은 반응 동역학(특히, 하기에 나타낸 바와 같이 바람직하게는 가열요소 상에 배열되는 프라이머에 대한 핵산분자의 하이브리드화 동력학)을 보장하기 위해, 가열수단은 가능한 한 큰 접근 가능한 표면을 갖는다.

가열요소는 (직접적인) 부근에 가능한 한 효과적인 열 방출을 촉진하기 위해 가능한 한 높은 표면/부피비(OVV)를 갖는 것이 바람직하며 동시에 가열요소의 낮은 열용량을 보장하기 위해, 가능한 한 낮은 부피를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 바람직한 실시예는 가열요소에 대한 표면/부피비가 10³m^-1 (/미터) 초과, 바람직하게는 10⁴m^-1 초과, 특히 바람직하게는 5*10⁴m^-1 초과이다. 그러나 너무 큰 표면/부피비는 어떤 경우에는 매우 금줄세공(filigree)적이고 기계적으로 불안정한 구조를 유도할 수 있어, 본 발명에 따르면 표면/부피비를 10⁹m^-1미만, 바람직하게는 10⁸m^-1 미만, 일부 경우에는 10⁷m^-1미만으로 유지하는 것이 유리할 수 있다.

긴 와이어 드래프트(wire draht, 직경보다 훨씬 긴 길이)의 경우 표면/부피 비율은 예를 들어 2/r로 계산되며, 여기서 r은 와이어의 반경이다. 얇은 필름 또는 호일(길이 및 측 방향 팽창보다 훨씬 작은 두께)에 대해, 표면/부피 비율은 1/d로 계산되며, 여기서 d는 상기 필름 또는 상기 호일의 두께이다. 본 발명에 따르면, 상기 실시예에 있어서, 반응부피와 접촉하는 표면만을 고려하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 반응부피와 접촉하는 표면(들)의 부피만을 고려하는 것이 바람직하다(즉, 예를 들면, 용액을 통과하지 않는 입구 라인은 관련된 부피와 표면으로 본 발명에 따라 고려되지 않는다). 이는 또한 부피충전인자(volume fill factor) 및 열용량에 대한 후속 고려 사항에 상응하여 적용된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 반응부피와 접촉하는 가열수단의 표면과 반응부피 간의 비는 0.1 m^-1 초과, 특히 바람직하게는 1 m^-1 초과, 특히 바람직하게는 5 m^-1 초과, 특히 바람직하게는 10 m^-1 초과, 특히 바람직하게는 20 m^-1 초과, 특히 바람직하게는 50 m^-1 초과, 특히 바람직하게는 100 m^-1 초과이다. 본 발명의 이 실시예는 반응부피의 많은 부분에서, 반응부피의 구성 부분이 확산을 통해 가열요소의 표면에 빠르게 도달하여 거기에서 일어나는 핵산증폭 방법의 단계에 참여할 수 있다는 점에서 유리한 반응 동역학이 유리하게 달성될 수 있게 한다. 또한, 가열요소에 대해 이하에서 더 설명되는 경우에, 반응 파트너(reaction partners) 중 하나 (예를 들어, 프라이머)를 가진 표면상에 적어도 일부에서 기능화되고, 더욱 많은 반응 파트너가 더 큰 표면을 통해 또한 이용 가능하다는 사실을 이용하는 것이 가능하다.

가열요소 구조체가 너무 금줄세공적이 되거나 반응부피 내에 위치한 핵산분자 및 다른 반응물의 운동이 너무 많은 표면에 의해 방해받게 될 것을 방지하기 위해, 가열요소 표면 또는 가열요소의 반응부피의 크기에 대한 비율이 10⁶m^-1 미만, 특히 바람직하게는 10⁵m^-1 미만, 특히 바람직하게는 10⁴m^-1 미만, 가장 특히 바람직하게는 10³ m^-1미만이다.

변성단계에서 가열수단에 의해 공급된 열을 가능한 한 낮게 유지하기 위해, 가열요소의 표면상에 특정한 온도증가를 달성하기 위해 가열수단의 열용량을 낮게 유지하는 것이 유리할 수 있다: 점점 더 많은 양의 에너지가 요구될수록, 가열수단의 열용량이 커진다. 이어서, 변성단계에서 가열수단에 의해 반응부피에 공급되는 에너지의 양이 전체 반응부피로 퍼진다. 가열요소의 열용량은 각각의 부피와 각각의 부피가 만든 각각의 물질의 비체적 열용량의 곱에 의해 주어진다. 가열수단의 구성에 상당한 자유도가 그 차원에 있다.

그러므로 가열수단의 부피, 특히 물질 두께를 가능한 한 낮게 유지하는 것이 유리할 수 있다. 이에 대하여 열확산 범위는 가열수단의 크기에 좌우되는 것이 아니라 대신에 단지 가열시간에 따른다는 것을 주목할 만하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 가열수단의 모든 가열요소의 부피는 반응부피의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 특히 바람직하게는 3% 미만 및 가장 바람직하게는 1% 미만이다. 본 발명의 이러한 실시예에 따르면, 가열수단의 낮은 열용량은 유리하게는 낮은 부피충전인자를 통해 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 가열수단은 반응부피에 의해 둘러싸인, 이들을 통해 흐르는 전류를 갖는 복수 개의 전도체의 배열을 포함한다. 여기서 가열수단은 반응부피의 많은 상이한 장소 또는 부분에서 효과적일 수 있다는 것이 유리하게 달성될 수 있다. 이는 PCR의 시작에는 매우 낮은 농도의 증폭될 핵산분자만이 고, 그럼으로써 가장 가까운 가열요소로부터 이들 분자의 평균거리가 길다는 전형적인 경우에 특히 유리하다. 100 염기쌍의 길이를 갖는 핵산 단일가닥은 그의 시작점으로부터 거리 x에 걸쳐 확산을 통해 스스로 이동하기 위해 시간 t = x²/D_DNA를 필요로 하는 것으로 추정할 수 있다(여기서, D_DNA

10^-11m²/s). 본 발명의 바람직한 실시예에서, 가장 가까운 가열요소로부터의 반응부피 내의 주어진 지점의 공간거리는 3 mm (밀리미터) 미만, 바람직하게는 2 mm 미만, 특히 바람직하게는 1 mm 미만, 특히 바람직하게는 0.75 mm 미만, 특히 바람직하게는 0.5 mm 미만, 특히 바람직하게는 0.25 mm 미만이다.

본 발명의 일 실시예에서, 가열요소들 중 하나 또는 모두는 전기전도성 금속 또는 금속합금 또는 탄소, 반도체 재료 또는 전도성 플라스틱과 같은 특정 전기저항이 낮은 다른 전기전도성 물질로 제조된다.

일 실시예에서, 가열요소 중 하나 또는 전부는 하나의 와이어 또는 하나의 전기전도체 또는 복수의 와이어 또는 전기전도체로만 구성된다. 이들은 직선, 구부러질 수 있거나 코일로 권취될 수 있다. 다수의 와이어 또는 전기전도체는 서로 동일하거나 불균일한 거리를 가질 수 있고, 서로 교차하거나 서로 교차하지 않을 수 있다. 각 와이어 또는 전기전도체는 원형, 타원형, 평면형 또는 임의의 다른 단면을 가질 수 있다. 가열요소는 단순히 통과가능한, 즉 통과 영역의 표면 영역, 예를 들어 금속으로 감쇠된 평평한 표면일 수도 있다.

가열수단의 특히 바람직한 실시예는 전도성 금속 와이어의 배열 또는 어레이, 바람직하게는 주기적인 배열이다. 특히 바람직하게는, 와이어는 서로 평행하게 배열된다. 어레이의 와이어는 바람직하게는 0.5 내지 100 ㎛ (마이크로미터), 특히 바람직하게는 1 내지 50 ㎛의 직경을 갖는다. 와이어는 바람직하게는 서로 50 내지 1500 ㎛ 이격되어 있다.

와이어는 바람직하게는 금 또는 다른 금속으로 제조되거나, 피복된 와이어로서 디자인되며, 여기서 코어는 보다 저렴하고 보다 안정한 물질, 바람직하게는 금속으로 구성된다. 스테인리스 강, 몰리브덴 또는 특히 바람직하게는 불활성 재료의 피복을 갖는 텅스텐 코어, 바람직하게는 금을 갖는 피복된 와이어가 특히 바람직하다. 코어의 강도가 높기 때문에, 이러한 와이어는 매우 얇게 (따라서 표면/부피 비율이 높아지도록) 유리하게 디자인될 수 있지만, 피복재를 통해 바람직하게는 스테인레스 스틸 피복의 원하는 화학적 특성을 여전히 용이하게 한다. 특히 바람직하게는 5 내지 40㎛의 코어 직경 및 0.1 내지 2㎛의 두께를 갖는 금 피복을 갖는 텅스텐 코어(텅스텐은 유리하게는 금보다 훨씬 높은 인장강도를 가짐)를 갖는 전선이 바람직하다.

다른 실시예에서, 예를 들어 스탬핑/펀칭, 전기주조, 레이저 또는 하이드로 제트(hydro-jet) 절단, 에칭기술 또는 다른 방법을 통해, 반응부피를 가로지르고 격자로서 설계된 가열요소로서 금속 호일이 사용된다.

본 발명의 다른 실시예에서, 가열요소는 전기 전도성이 없거나 전기 전도성이 약한 물질에 적용된다. 바람직한 가열요소는 가압 방법 또는 다른 방법을 통해 PVD를 통해 갈바니전기적으로, 화학적으로, 비도전성 구조물에 적용된 금속 필름으로 제조된다. 비도전성 구조체는 예를 들어 매우 미세한 사출성형 부품(바람직한 구조체 크기는 300 ㎛ 미만이다) 또는 신속한 프로토타이핑(prototyping) 방법으로 설계 될 수 있다. 직물 구조는 가열요소 또는 가열요소용 캐리어로 사용하기 위해 고려될 수도 있다. 특히, 20 ㎛ 내지 3 ㎜, 특히 바람직하게는 100 ㎛ 내지 1.5 ㎜의 메쉬 크기를 갖는 이러한 물질은 가열요소 또는 가열요소용 캐리어로서 사용될 수 있다. 직물 구조 자체가 전도성이면, 가열요소로서 전체적으로 유리하게 사용될 수 있다. 비전도성 물질(예를 들면 플라스틱)로 제조된 경우 금속 도금이 가능하여 전류가 얇은 표면층(일반적으로 <10 ㎛)을 통해서만 흐르고 표면이 커진다. 다시 말하면, 격자 직물의 와이어 또는 섬유는 비교적 큰 표면을 가지지만 얇고 가해진 금속 부피만이 활발하게 가열된다. 본 발명의 의미에서, 가열요소로 간주되는 것은 전류가 본질적으로 흐르는 부분일 뿐이다. 예를 들어, 금 필름을 갖는 PMMA의 플라스틱 구조가 증발된다면, 가열요소로 간주되는 금 필름 만이 증발된다.

가열수단의 기능화

본 발명의 바람직한 실시예에서, 가열수단의 가열요소 중 적어도 하나는 올리고뉴클레오티드에 접합되며, 즉 올리고뉴클레오티드는 가열요소에 결합된다. 특히 바람직하게는 가열수단의 모든 가열요소가 올리고뉴클레오티드에 접합되어 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 방법의 일부인 올리고뉴클레오티드는 가열 되어야 하는 전체 반응부피 없이 가열수단에 의해 특이적으로 가열되는 것이 유리하게 달성될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 가열요소(들)는 프라이머에, 가장 특히 바람직하게는 PCR 방법의 정방향 및 역방향 프라이머에 접합된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 역방향 프라이머가 아닌 정방향 프라이머는 가열요소 또는 가열요소의 일부에 부착되고/되거나, 정방향 프라이머가 아닌 역방향 프라이머는 가열요소 또는 가열요소의 일부에 부착된다. 각각의 경우에 다른 프라이머의 분자는 반응부피에 자유롭게 현탁될 수 있다. 분리층이 가열수단의 열발생 성분과 반응부피 사이에서 사용된다면, 올리고뉴클레오티드가 액체부피로부터 접근 가능하도록, 즉 바람직하게는 분리층의 표면상에 부착되는 방식으로 기능화가 이루어져야한다.

추가의 바람직한 실시예에서, 가열요소 중 적어도 하나는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머에 접합된다. 특히 바람직한 실시예에서, 가열수단의 모든 가열요소는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머에도 접합된다. 본 발명의 이 실시예에 있어서, 동일한 가열요소의 역방향 프라이머와 하이브리드화하기 위한 정방향 프라이머의 PCR 산물은 단거리 이동만 하면 하이브리드화가 보다 신속하게 일어나 보다 신속하게 PCR 방법을 수행할 수 있다는 장점이 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 핵산의 결합을 허용하는 물질로 가열요소가 그 표면에 제공된다. 예를 들어 금-도금 표면은 가열요소 상의 하나 이상의 티올 결합을 통해 프라이머를 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 예를 들어 스트렙 타비딘 비오틴 결합은 프라이머를 상기 가열요소에 결합시키는 데에 사용할 수 있고, 예를 들어, 바람직하게는 두 파트너 중 하나(스트렙타비딘 또는 비오틴)가 가열요소에 결합되었고 프라이머(5'-말단에서)가 두 파트너 중 다른 하나에 의해 변형되고 이어서 가열요소에 결합된다. 예를 들어, 아미노 또는 카복시기와 같은 다른 변형물도 프라이머를 가열요소에 결합시키는데 사용될 수 있다; 이 목적을 위해, 가열요소의 표면은 예를 들어 바람직하게는 사전에 에폭시로 변형될 수 있다. 결합은 바람직하게는 프라이머의 5'-말단이 가열요소에 결합되어 3'-말단이 자유롭고 중합효소에 의한 PCR 동안 신장 될 수 있는 방식으로 실현된다.

정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두가 가열요소 상에 고정화되는 실시예에서, 상이한 유형의 프라이머 분자 사이의 거리는 의도적으로 서로 평균적으로 떨어져서, 예를 들어 1 nm(나노미터) 미만, 3 nm 미만, 5 nm 미만, 15 nm 미만 또는 50 nm 미만에서 선택될 수 있다. 이 실시예에서, 정방향 프라이머가 가열요소의 표면상에서 연장되자마자, 이 새로 기술된 핵산 가닥은 변성 후에 표면상의 상응하는 인접 역방향 프라이머 분자에 하이브리드화되거나, 부근의 역방향 프라이머 분자에 결합된다. 이 과정이 가열요소의 표면에서 일어나기 때문에 국소적인 농도가 매우 높다. 따라서, 바로 인접한 - 겨우 몇 나노 미터 떨어진 - 많은 반응 파트너가 있기 때문에(역으로 부근의 고정화된 정방향 프라이머 분자를 발견하는 신장된 역방향 프라이머 분자에도 동일하게 적용된다. 새로운 핵산 가닥은 역방향 프라이머 분자를 찾기 위해 확산을 통해 많은 마이크로 미터를 이동하지 않아야 한다.

일 실시예에서, 프라이머 분자(들) 외에, 가열요소 상에 충전 올리고뉴클레오티드(fill nucleotides) 또는 충전 분자(fill molecules), 즉 PCR에서 프라이머 또는 형광 프로브 또는 표적 핵산으로 활발하게 참여하지 않는 올리고뉴클레오티드 또는 분자가 존재하지만, 대신에 가열요소의 표면으로의 앰플리콘 또는 타겟 핵산의 비특이적(따라서 프라이머로 타겟화된 하이브리드화를 통하지 않음) 결합을 방지하기 위해 단지 표면 포화 또는 패시베이션(passivation)을 제공한다. 충전 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 5 내지 50 뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 10 내지 40 뉴클레오티드, 가장 특히 바람직하게는 20 내지 30 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 특히 그들은 뉴클레오티드 유형, 예를 들어 30개의 아데닌 염기를 갖는 A30 서열만으로 이루어질 수 있다. 충전 분자는 예를 들어 비오틴 또는 폴리에틸렌글리콜일 수 있으며, 예를 들어 가열요소 표면상에 충전 분자를 고정시키기 위해 예를 들어 티올과 같은 작용기를 부가적으로 제공할 수 있다. 그러나 충전 분자는 또한 예를 들어 소혈청 알부민일 수 있다.

상기 방법의 또 다른 바람직한 실시예에서, 가열요소 상의 올리고뉴클레오티드는 서브-서열(sub-sequence)로서 스페이서 서열을 갖는다. 따라서, 스페이서 서열은 각 올리고뉴클레오티드의 가열 방향을 향한 측면 상에 존재한다. 따라서, 스페이서 서열은 올리고뉴클레오티드의 나머지를 위한 스페이서로서 작용한다. 바람직한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 프라이머의 기능을 가지며 프라이머 서열로서 기술되고 또한 스페이서 서열인 서브-서열 모두를 함유한다. 프라이머 서열이 스페이서 서열에 의해 가열요소로부터 더 멀리 이격되어 있다는 사실 때문에, 증폭될 핵산 및 DNA 중합효소는 유리하게도 프라이머 서열에 더 잘 접근할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시예에서, 스페이서 서열과 프라이머 서열 사이에 하나 또는 그 이상의 비-염기적(무염기) 변형이 존재하며, 이들 무염기 변형은 중합효소에 의한 스페이서 서열의 겹쳐쓰기(overwriting)를 방지한다. 이 점에서의 특허출원 DE 102013215168 A1의 내용은 본원에 참조됨으로써 본 개시의 부분으로 간주된다. 이러한 변형은 예를 들어 3'-방향으로 추가의 중합효소 활성을 방지하는 1', 2'-디데옥시리보스(dSpacer), 트리에틸렌글리콜 스페이서(스페이서 9) 또는 헥사에틸렌글리콜스페이서(스페이서 18)일 수 있다. 이러한 방식으로, 스페이서 서열은 중합효소에 의해 합성된 핵산 가닥의 주형으로 작용하지 않으며, 결과적인 PCR 산물이 불필요하게 길어지지 않는다는 것이 달성될 수 있다. 스페이서 서열에 대한 상보적 서열을 함유하는 신장된 PCR 산물은 나노입자상의 올리고뉴클레오티드로 현저히 증가된 용융온도를 가지며, 후속 하이브리드화 단계에서 불필요하게 비특이적으로 하이브리드화하여 전체 PCR을 더욱 비특이적으로 만든다.

가열의 지속시간

가열수단을 통한 열 공급은 바람직하게는 PCR 동안 변화한다.

특히 바람직하게는, 가열수단을 통한 열 공급은 PCR의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서, 특히 바람직하게는 PCR의 증폭주기의 경로의 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개 동안 특히 바람직하게는 주기적으로 변한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 변성단계에서의 가열수단에 의한 가열의 지속시간(이하, 변성단계에서의 가열수단에 의한 가열은 또한 "열 펄스(heat pulse)"라고도 함)은 적어도 하나, 바람직하게는 PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서 100 ns(나노초) 내지 30 ms, 특히 바람직하게는 0.5 ㎲(마이크로초) 내지 10 ms의 간격, 특히 바람직하게는 1 ㎲ 내지 5 ms, 특히 바람직하게는 1 ㎲ 내지 3 ms, 특히 바람직하게는 1 ㎲ 내지 1 ms, 특히 바람직하게는 1 ㎲ 내지 800 ㎲의 간격 및 가장 바람직하게는 1 ㎲ 내지 500 ㎲의 간격이다. 본 발명의 이 실시예의 달성가능한 이점은 열의 국부화 및 결과적으로 생성되는 온도 분포이다. 다시 말하면, 짧은 가열 지속시간으로 인해 제한된 열이 가열요소에 의해 열확산을 통해 용액으로 전달된다. 동시에, 가열 지속시간이 너무 짧아서 국부적 가열 동안 핵산 이중가닥의 충분한 용융 또는 윤활을 허용하지 못하고/못하거나 국부 가열의 시간 동안 양 단일가닥 모두가 브라운 운동(및/또는 다른 힘)을 통해 서로 충분히 멀어져 서로가 다시 하이브리드화되지 않도록 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 변성단계의 지속시간은 PCR의 총 지속시간 중 단지 작은 부분만을 설명한다. 바람직하게는, 변성단계는 PCR의 증폭주기의 적어도 하나의 경로 동안, 특히 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, PCR의 증폭주기의 전체 경로에 의해 시간의 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만, 특히 바람직하게는 3% 미만, 특히 바람직하게는 1% 미만, 특히 바람직하게는 0.5% 미만, 특히 바람직하게는 0.05% 미만, 특히 바람직하게는 0.01% 미만으로 설명된다. 본 발명의 이러한 실시예를 통해, 실질적으로 PCR의 전체 기간 동안 하이브리드화가 발생할 수 있다는 것이 유리하게 달성될 수 있다. 국소적 PCR의 중합효소가 사실상 전체 지속시간 동안 작동할 수 있기 때문에 공정시간이 단축될 수 있다. 또한, 국부적으로만 실현되는 가열에 더해 매우 짧은 가열로 인해 참여하는 중합효소 및 다른 반응 파트너가 보호되고 이들의 생산성이 덜 빨리 잃는 결과를 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나의 경로 동안, 특히 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 20개의 PCR의 증폭주기의 경로에서, 변성단계의 지속시간은 t_heat≤(s1·|x|)²/D보다 짧으며, 여기서 s1은 스케일링 인자(scaling factor)이며, |x|는 임계거리이며 D는 온도 전도도이다. 스케일링 인자 s1은 바람직하게는 s1=100, 특히 바람직하게는 s1=10, 특히 바람직하게는 s1=1, 특히 바람직하게는 s1=0.1, 특히 바람직하게는 s1=0.01이다. 임계거리 |x|는 예를 들어 가열수단의 가장 가까운 가열요소로부터 가열수단의 가장 가까운 간접적으로 인접한 부분으로부터의 거리이다. 가열요소(들)가 2D 구조(예를 들어, 격자, 직물, 허니컴 등)로 구성되는 경우, 메쉬 크기 또는 홀/리세스(recesses)의 크기는 관련 값 |x|이다. 가열요소(들)가 3D 구조로 구성되면, 기공 크기는 관련 값 |x|이다.

가열 지속시간이 너무 짧아서 열 확산 범위가 인접한 가열요소의 열적 필드 또는 일반적으로 가열수단의 인접한, 인접하지 않아 중첩되지 않은 부분의 평균거리 |x|보다 훨씬 작다는 것이 본 발명의 이 실시예에 의해 달성될 수 있다. 특히, 1보다 큰 스케일링 인자는 매우 긴 앰플리콘에 유리할 수 있는데, 더 오래 걸리는 두 핵산 가닥의 풀림(핵산 이중가닥이 브라운 운동을 통해 풀릴 때까지 걸리는 시간)은 길이의 4승으로 증가한다. 1보다 작은 스케일링 인자는 최상의 가능한 가열 및 냉각 동역학에 유리할 수 있다.

전기저장부

본 발명에 따른 바람직한 장치는, 그 전력소비가 PCR 중 어느 시점에서도 50 W, 특히 바람직하게는 20 W, 특히 바람직하게는 10 W, 특히 바람직하게는 3 W, 특히 바람직하게는 2.5 W, 특히 바람직하게는 1.5 W, 특히 바람직하게는 0.5 W를 초과하지 않도록 구성된다. 이러한 제한은 스위치-온 전류에 의한 기술적인 이유로 야기될 수 있는, 장치의 스위치-온 프로세스 동안의 더 높은 전력소비에는 적용되지 않는다. 이러한 증가된 전력소비는 PCR 동안 전력 소모로 간주되지 않으므로 여기서 고려되지 않는다. 본 발명의 이 실시예에 따르면, 장치는 통상적인 휴대용 전원, 예를 들어 자동차 배터리, 자동차의 담배 라이터 또는 PC의 포트, 태블릿 컴퓨터 또는 예를 들어 USB 또는 Apple 라이트닝 연결상의 이동전화 상에서 작동될 수 있다.

상기 장치는 바람직하게는 전기저장부를 포함한다. 바람직하게는, 반응용기의 용량에 대해 전기저장부에 보유된 전기에너지가 0.1 J/mL 초과, 특히 바람직하게는 1 J/mL 초과, 특히 바람직하게는 2 J/mL 초과, 특히 바람직하게는 3 J/mL 초과되도록 설계된다. 가열수단의 전기 필요량에 대한 전기는 변화하는 열공급으로 인해 변할 수 있으며, 전기저장부에 중간에 저장될 수 있다.

전기저장부를 포함하는 본 발명에 따른 장치는 바람직하게는 반응용기의 용량과 관련하여 전기저장부에 보유된 전기에너지가 100 J/mL보다 작고, 특히 바람직하게는 50 J/mL, 특히 바람직하게는 30 J/mL 미만이 되도록 설계된다. 본 발명의 이 실시예는 가열수단을 통한 특히 효율적인 가열으로 인해 전기저장부가 작은 구성을 가질 수 있다는 사실을 이용할 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 장치는 유리하게도 특히 콤팩트하고, 비용효율적이며, 휴대가능하도록 설계될 수 있다.

바람직한 전기저장부는 하나 이상의 캐패시터(들), 코일(들) 또는 배터리/배터리들 또는 전술한 것들의 조합을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 에너지저장부의 저장용량은 이용가능한 형태로, PCR의 증폭주기의 경로의 변성단계에 필요한 전기에너지의 적어도 20%, 특히 바람직하게는 적어도 40%, 특히 바람직하게는 적어도 50%, 특히 바람직하게는 적어도 60%, 특히 바람직하게는 적어도 80%, 특히 바람직하게는 적어도 100%, 특히 바람직하게는 적어도 150%, 특히 바람직하게는 적어도 200%, 특히 바람직하게는 적어도 300%를 유지하도록 설계된다. 본 발명의 이 실시예에 따르면, 변성단계의 전체 지속시간에 걸쳐 변성단계에 필요한 전력을 제공할 수 있는 사용할 수 있어야 하는 전력원의 상황을 피할 수 있다. 대신에, 일반적으로 변성단계의 지속시간보다 상당히 긴 변성단계들 사이의 시간에 유리하게, 에너지저장부가 충전될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 장치는 예를 들어 더 약한 네트워크 장치를 사용하여 그 전기 출력에 관하여 보다 약한 전력원을 구비할 수 있다는 것이 달성될 수 있다. 전기저장부가 PCR의 증폭주기의 한 경로의 변성단계에 필요한 에너지의 100% 미만을 제공한다면, 그것은 유리하게도 매우 작게 유지될 수 있으나, 나머지 에너지는 변성 단계 동안에 예를 들어 전력 네트워크 연결과 같은 전력원을 이에 상응하는 치수로 추가적으로 제공되어야 한다. 커패시터를 공급하는 전력원이 상응하게 작게 유지될 수 있고, 또한 가열의 부하로 인해 전압이 붕괴되지 않기 때문에. 100% 이상의 값은 유리하다. 특히, 본 발명에 따른 장치의 전력원은 PCR의 증폭주기의 지속시간에 걸쳐 변성단계에 필요한 에너지량을 제공할 수 있는 치수를 가질 필요가 있으나, 현저하게 더 짧은 변성시간 동안 이미 존재하지는 않는다는 것이 유리하게 달성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 장치의 전력소비와 반응용기의 용량 사이의 비율이 PCR 동안 어느 시점에서도 1 W/mL, 바람직하게는 0.5 W/mL, 특히 바람직하게는 0.25 W/mL, 특히 바람직하게는 0.1 W/mL를 초과하지 않는다. 이러한 제한은 스위치-온 전류에 의한 기술적인 이유로 발생할 수 있는, 장치의 스위치-온 과정에서 발생할 수 있는 더 높은 전력소비에는 적용되지 않는다. 이러한 증가된 전력소비는 PCR 동안 전력소모로 간주되지 않으므로 여기서 고려되지 않는다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 전기저장부는 적어도 5, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개, 가장 바람직하게는 적어도 40개, 특히 바람직하게는 적어도 100개의 PCR의 증폭주기의 경로의 변성단계 동안 에너지를 이용 가능한 형태로 유지할 수 있도록 구성된다. 이러한 방식으로, 장치, 특히 휴대용 장치가 유리하게도 하나 또는 심지어 몇몇 중합효소연쇄반응을 또 다른 전력원과 독립적으로 수행할 수 있도록 생성될 수 있다.

바람직한 커패시터는 대용량 커패시터, 바람직하게는 전해질 커패시터 또는 수퍼-캡(super-caps)이며, 특히 바람직하게는 낮은 ESR 값을 갖는다. 이러한 커패시터는 시장에서 비용-효율적으로 얻을 수 있으며 치수 측정이 용이하다. 예를 들어 수학식 Q = 1/2·CU²혹은C=2Q/U²를 사용하여, 2222 μF(마이크로패럿)의 커패시턴스를 가진 커패시터가 1 J(줄)의 전기에너지를 공급하기에 충분할 것이라고 계산할 수 있다 - 30 V의 전압 U로 1 mL의 반응부피의 변성단계에 대한 실시예에 따라, 전기에너지를 열로 실질적으로 손실 없이 전환시키기에 충분하다. 그러나 상기 열 펄스의 끝에서 상기 커패시터는 완전히 방전될 것이므로, 실제로는 전원 공급 장치가 전력의 상당 부분을 공급할 수 없다면 적어도 1.5배의 더 큰 커패시턴스를 가진 커패시터의 사용이 권장된다.

본 발명에 따른 바람직한 에너지 저장부에서, 커패시터의 커패시턴스, 또는 복수의 커패시터의 경우,이 복수의 커패시터의 커패시턴스의 합은 100 μF 초과, 특히 바람직하게는 200 μF 초과, 특히 바람직하게는 500 μF 초과, 특히 바람직하게는 1 mF(밀리패럿) 초과, 특히 바람직하게는 1.5 mF 초과이다. 본 발명에 따른 바람직한 에너지 저장부에서, 커패시터의 커패시턴스, 또는 복수의 커패시터의 경우, 이 복수의 커패시터의 커패시턴스와 반응부피의 크기의 합사이의 RATIO는 0.01 mF/mL (밀리패럿/밀리리터) 초과, 특히 바람직하게는 0.1 mF/mL 초과, 특히 바람직하게는 1 mF/μL 초과, 특히 바람직하게는 5 mF/mL 초과, 특히 바람직하게는 10 mF/mL 초과이다. 본 발명의 이 실시예에 있어서, 변성단계에서 가열요소의 충분한 가열을 달성하기에 충분한 에너지가 유리하게 중간에 저장될 수 있다.

특히 바람직한 배터리는 고전류 배터리 또는 축전지, 특히 리튬-폴리머 축전지, 리튬-이온 또는 리튬-철 포스페이트 축전지이다. 본 발명의 일 실시예에서, 배터리/배터리들은 하나 또는 그 이상의 커패시터와 함께 사용된다. 다른 실시예에서, 배터리/배터리들은 특히 바람직하게는 캐패시터의 추가 사용없이 유리하게 낮은 내부저항을 특징으로 하는 리튬-철 포스페이트 축전지이다. 입구라인의 간섭-유발 인덕턴스 및 옴저항을 줄이기 위해, 커패시터(들) 및/또는 배터리 사이에서 작동하는 입구라인 및 가열요소가 가능한 한 짧다면, 본 발명에 따라 유리할 수 있다.

반응용기

핵산의 증폭을 위한 바람직한 장치는 반응부피를 수용하기 위한 반응용기를 갖는다. 본 발명에 따른 방법의 적합한 반응용기는 PCR 튜브 또는 PCR 튜브의 복합체(예를 들어, 소위 8 스트라이프(8 stripes)와 같은) 또는 멀티웰 플레이트와 같은 종래의 PCR 반응용기일 수도 있으나, 예를 들어 평판 또는 채울 수 있는 기타 형상/형태일 수 있다. 가열수단은 반응용기, 예를 들어 이미 생산 공정(예를 들면 사출 성형) 중에 있는 멀티웰 플레이트 또는 PCR 튜브의 벽을 통과하는 와이어, 또는 생산 공정 후에 추가될 수 있다(예를 들어 멀티웰 플레이트의 개별 웰에 매달릴 수 있는 코일 형태의 와이어의 경우).

제어장치

본 발명에 따른 바람직한 장치는 반응부피를 가열하기 위해 가열수단에 전류를 인가하는 제어장치를 포함한다. 제어장치는 바람직하게는 PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 변성단계에서 상기 반응부피를 가열하기 위해 사용된 전기에너지와 반응용기의 용량의 비율이 40 J/mL(쥴/밀리리터) 미만, 특히 바람직하게는 20 J/mL 미만, 특히 바람직하게는 10 J/mL 미만, 특히 바람직하게는 3 J/mL 미만이다.

본 발명에 따른 바람직한 장치에서, 제어장치는 가열수단의 적어도 하나의 가열요소가 적어도 하나의 방향으로 1.5 ㎛ 초과의 팽창부를 갖도록 구성된다. 특히 바람직하게는, 가열수단의 각 가열요소는 적어도 하나, 특히 바람직하게는 2개의 방향으로 1.5 ㎛ 초과의 팽창부를 갖는다. 팽창부는 예를 들어 신장 가열요소의 길이 또는 직경일 수 있다. 바람직한 신장된 가열요소는 1 ㎛ 이상, 특히 바람직하게는 2 ㎛ 이상, 특히 바람직하게는 5 ㎛ 이상의 직경을 갖는다. 바람직한 신장 가열요소는 적어도 0.1 mm, 특히 바람직하게는 적어도 1 mm, 특히 바람직하게는 적어도 2 mm의 길이를 갖는다. 네트워크-형태 또는 허니컴-형태의 가열요소의 경우, 팽창부는 또한 예를 들어 두께(네트워크-형태 또는 허니컴의 표면에 수직으로 웹의 팽창부를 의미) 또는 웹의 직경일 수 있다. 바람직한 웹은 1 ㎛ 이상, 특히 바람직하게는 5 ㎛ 이상, 특히 바람직하게는 10 ㎛ 이상의 두께 또는 직경을 갖는다.

바람직한 제어장치는 변성단계가 시작될 때 - 또는 변성단계가 서로 분리된 복수개의 시간 간격으로 구성된다면, 변성단계의 각 시간 간격으로 시작될 때 가열수단을 통한 전류흐름을 허용하거나 증가시키도록 설계되고, 상기 변성단계의 종료 후 - 또는 변성단계의 각 시간 간격의 종료 후에 전류 펄스를 발생시키기 위해 상기 전류흐름을 다시 억제 또는 감소시키도록 설계된다. 가열요소에서 전류 펄스는 열 펄스로 변환될 수 있다. 바람직한 제어장치는, 예를 들어 전력 네트워크 부품, 하나 또는 그 이상의 배터리(배터리들) 또는 축전지 또는 연료전지를 포함할 수 있는 전력원을 포함한다. 바람직한 제어장치는 하나 또는 그 이상의 커패시터를 포함한다. 바람직한 제어장치는, 바람직하게는 선택가능한 지속시간을 갖는 스위치를 포함하여, 가열수단을 통해 전력원으로부터 전류 흐름을 스위치 온 및 오프할 수 있다. 적절한 스위치에는 MOSFETs, SSRs, 초고속 릴레이 및 트랜지스터가 포함된다. 제어장치는 시간 제어를 위해 하나 또는 그 이상의 펄스 또는 주파수 생성기, DAC 또는 마이크로컨트롤러를 가질 수 있다.

PCR의 관찰 및 PCR 생성물의 검출

바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서, 앰플리콘이 검출되거나 또는 시료에서의 타겟 핵산의 원본의 존재가 검출된다. 이는 예를 들어 PCR 후 겔 전기영동, 앰플리콘 또는 그의 일부에 상보적인 고정화된 올리고뉴클레오티드에 대한 앰플리콘의 하이브리드화, 예를 들어 형광 염료와 같은 수단에 의한 검출 또는 전자 방법에 의한 검출을 통해 실현될 수 있다. 추가의 바람직한 실시예에서, 광학적 방법에 의해 중합효소연쇄반응의 진행을 관찰하기 위해 반응부피에서 PCR 동안 실시간 검출이 이미 일어난다. 이를 위해, 광학 방법, 특히 TaqMan 포맷과 같은 형광 방법이 특히 바람직하다. US 5210015 A 및 Holland et al., Proc Natl Acad Sci USA, 88 (16), 1991, 7276~7280페이지의 관련 개시 내용은 본원에 참조됨으로써 본 개시의 부분으로 간주되어야 한다. 이 방법에서는 PCR 동안 특정 형광 신호가 생성되어 증폭반응을 실시간으로 관찰하고 원래 사용된 타겟 핵산의 수를 정량화도 할 수 있다. SybrGreen과 같은 인터칼레이팅 염료(intercalating dyes)의 사용과 분자 비콘 프로브(Molecular beacon probe)의 사용과 같은 다른 실시간 검출 방법도 가능하다. 그러나 본 발명은 또한 앰플리콘이 예를 들어 후속 공정에서 추가로 사용된다는 점에서 핵산의 증폭이 순수하게 제조되는 실시예를 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 장치는 광원, 예를 들어 발광 다이오드 또는 레이저 다이오드와 같은 반도체 광원을 포함한다. 염료는 광학적 방법에 의해 중합체 사슬 반응의 진행을 관찰하기 위해 바람직하게는 광원을 가진 반응부피에서 유리하게 여기될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 장치는 광센서, 예를 들어 포토다이오드와 같은 반도체 광센서를 포함한다. 염료는 광센서를 가진 반응부피에서, 바람직하게는 광학 방법에 의해 중합체 사슬 반응의 진행을 관찰하기 위해 유리하게 검출될 수 있다. 광센서에는 하나 또는 그 이상의 필터가 장착될 수 있다.

본 발명과 관련된 검출 또는 관찰 방법과 관련하여 "광(light)"에 대해 언급되는 경우, 이것은 광학 검출 방법, 특히 형광 염료의 여기 또는 검출에 적합한 모든 가능한 유형 및 파장의 빛을 포함한다. 상기 광은 바람직하게는 가시광선이지만, 자외선 또는 적외선일 수도 있다. 광은 레이저광이 될 수 있다.

[실시예]

본 발명에 따른 방법의 과정

예를 들어, PCR의 증폭주기의 제1 경로는 본 발명에 따른 방법에서 다음과 같이 수행될 수 있다: 핵산분자(이하, "타겟핵산"으로 기재됨)를 반응부피 (및 아마도 전체 가열에 의한 그 변성일 수 있음)에 첨가하고 하나 이상의 가열요소에 결합된 정방향 프라이머에 하이브리드화 시킨 후에 중합효소는 정방향 프라이머를 신장시켜 타겟핵산에 상보적인 가닥을 생성한다. 변성, 즉 신장된 정방향 프라이머로부터의 타겟핵산 분자의 분리는 전체 반응부피의 전체 가열에 의해 실현되는 것이 아니라 가열수단의 가열요소(들)를 통한 전류펄스에 의해 야기된 열펄스를 통해 실현된다.

PCR의 증폭주기의 후속 제2 경로는 유사한 방식으로 실현될 수 있다. 원본 타겟핵산 분자는 하나 또는 그 이상의 가열요소(들)에 결합된 정방향 프라이머에 다시 혼성화되고 중합효소는 정방향 프라이머를 길게 하여 타겟핵산에 대한 (또는 적어도 타겟핵산의 비율을 위한) 상보적 가닥을 생성한다. 병행하여, (자유롭게 현탁되거나 가열요소에 결합된) 역방향 프라이머는 PCR의 증폭주기의 제1 경로에서 생성된 신장된 가열요소-결합 정방향 프라이머의 신장된 부분에 결합할 수 있고(정방향 프라이머는 이제 타겟핵산의 적어도 일부에 대한 상보적 가닥을 구성한다.), 이어서 역방향 프라이머는 중합효소에 의해 상응하여 신장된다. 이러한 방식으로, 원본 타겟핵산의 적어도 일부의 진짜 카피가 처음으로 생산된다. 변성, 즉 중합효소에 의한 신장을 통해 생성된 이중가닥의 분리(이중가닥은 어떠한 경우에도 가열수단에 다시 결합됨)는 가열수단을 통한 전류 펄스에 의해 야기된 열 펄스를 통해 다시 한번 실현된다. PCR의 증폭주기의 제3 경로로부터의 효과로서 원본 타겟핵산 및 중합효소를 통한 프라이머 서열의 신장에 의해 생성된 핵산 가닥(실시예에 따라: 반응부피 내에 자유롭게 현탁되거나 또는 가열요소에 결합됨)을 추가 증폭을 위한 주형으로 사용한다. 이들은 대응하는 프라이머(실시예에 따르면, 가열요소에 결합된 용액에서 자유롭게)에 대한 하이브리드화에 의해 증폭되고, 중합효소를 통한 후속 신장이 일어나고 그 후에 국소 열 펄스의 수단에 의한 변성이 일어나는데, 이는 가열수단을 통한 전류 임펄스에 의하여 야기된다. PCR의 증폭주기의 마지막으로 기술된 경로는 사이클의 각각의 추가 경로에서 타겟핵산의 적어도 일부를 추가로 복제하기 위해 수회 반복된다. 상기 경로는 수행된 증폭의 검출 또는 시료 내에 타겟핵산의 원본의 존재를 수행할 수 있도록 타겟핵산의 적어도 일부분이 충분히 높은 수의 카피가 존재할 때까지 필요한 만큼 빈번히 반복된다. 상기 기술된 방법들 중 하나, 예를 들어 형광법을 사용하여, 이렇게 생성된 앰플리콘이 검출될 수 있다.

본 발명의 또 다른 예시적인 실시예에서, 복수의 상이한 타겟핵산이 병렬로 증폭된다(또한 "다중-PCR(multiplex-PCR)"로 기술됨). 이를 위해, 서로 다른 복수의 프라이머 쌍(각각의 경우: 정방향 및 역방향 프라이머)이 각각의 앰플리콘에 필요하다(여기서, 프라이머는 또한 예를 들어 상이한 길이의 2개의 앰플리콘에 대한 프라이머로서 작용할 수 있으므로, 2개의 프라이머 쌍의 일부가 된다). 가열요소는 복수의 프라이머 쌍 또는 각각의 경우에 (적어도) 복수의 프라이머 쌍으로 구성된 하나의 프라이머를 지닐 수 있다. 그러나 복수의 프라이머 또는 프라이머 쌍이 또한 가열요소의 상이한 하위 부분이 단지 하나의 프라이머 쌍만을 운반하거나 프라이머 쌍 중 하나의 파트너만을 운반하는 방식으로 분포될 수 있다. 예시적인 실시예에서, 하나의 (프라이머 쌍당 또는 심지어 각각 하나씩) 프라이머 종류 또는 프라이머 서열이 가열요소-결합 형태 및 또한 반응부피에서 자유로이 현탁된 형태 모두로 존재할 수 있다. 상이한 색 신호가 생성되는 (상이한 파장을 갖는) 상이한 앰플리콘의 형성에 할당될 수 있는 방식으로 상이한 염료를 사용함으로써 검출이 실현될 수 있다. 그러나 그 대신에 다른 앰플리콘은 또한, 분화될 수 없는 동일한 색 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어, 겔 전기영동 또는 다른 방법을 사용하여 상이한 앰플리콘을 또한 분화시킬 수 있다.

전체 반응온도의 설정 또는 확립

(전체) 신장 및 하이브리드화 온도는 예를 들어 종래의 외부 히터, 예를 들어 온도-조절 블록 또는 가열요소를 통한 일정한 (또는 조절된) 오프셋 전류에 의한 가열요소의 일정한 (또는 조절된) 여기의 PCR의 전체 과정 동안 바람직한 실시예에서 일정하게 유지된다.

(전체) 신장 및 하이브리드화 온도 또는 가열온도의 조절은 복수의 반응부피 중 하나의 반응부피 내의 온도 센서 상에서 반응부피의 외부의 센서에 의해 또는 히터 내의 센서 또는 반응부피를 위한 기록장치를 통해 각각의 반응부피 내에 각 센터를 통한 를 위한 기록장치를 통해 각각의 개별적인 반응부피에 대해 개별적으로 실현될 수 있다. 하나의 실시예에서, 모든 반응부피에 대한 (전체) 신장 및 하이브리드화 온도는 동일하고, 또 다른 실시예에서 (전체) 신장 및 하이브리드화 온도는 상이한 반응부피에 대해 상이할 수 있다. 또 다른 실시예에서, (전체) 신장 및 하이브리드화 온도는 PCR 동안 또는 PCR 전후에 변화가 있거나 변할 수 있다. 일 실시예에서, 히터는 또한 예를 들어 바닥부 및 상부로부터의 복수의 부분으로 이루어질 수 있으며, 상부는 반응부피의 벽에 응축을 피하기 위해 바닥부보다 다소 높은 온도를 갖는다. 히터의 상부와 바닥부 사이의 온도차는 바람직하게는 1 ℃ 내지 30 ℃, 특히 바람직하게는 2 ℃ 내지 20 ℃, 가장 특히 바람직하게는 3 ℃ 내지 15 ℃이다.

일 실시예에서, 가열수단의 전기 가열을 통한 반응용기 내의 반응 액체의 전체 가열은 입력된 열의 일부 또는 원하는 신장 및 하이브리드화 온도에 도달하기 위해 필요한 열의 전부로 설명할 수 있다. 이것은, 예를 들어 열평형 상태 또는 PCR 종료시 또는 PCR 개시시 또는 PCR 지속 시간의 상당 부분 동안 반응 용기 내에서 반응액의 전체적인 가열이 원하는 신장 및 하이브리드화 온도를 유도할 수 있도록 선택될 가열수단의 가열요소(들)에서의 듀티 사이클(duty cycle) 및/또는 연속 전류(또는 전압)에 의해 달성될 수 있다. 외부 가열 (즉, 가열요소를 통해 들어오지 않는 열 입력을 위한 요소)은 더 작은 치수를 갖거나 완전히 생략될 수 있다.

결합된 하이브리드화 및 신장 온도에 대한 본 발명에 따른 바람직한 온도는 바람직하게는 30 ℃ 내지 85 ℃, 특히 바람직하게는 40 ℃ 내지 80 ℃, 특히 바람직하게는 50 ℃ 내지 75 ℃, 가장 특히 바람직하게는 55 ℃ 및 72 ℃이다.

일 실시예에서, (후속 하이브리드화 및 신장 온도보다 큰 전체 온도를 갖는) 전체 가열단계가 PCR 사이클의 제1의 실제 경로 전에 일어날 수 있고, 여기서 상기 전체 가열 단계는 타겟핵산(DNA 또는 RNA 또는 다른 핵산)이 존재하는 이중가닥 결합의 초기 변성에 기여할 수 있고/있거나 예를 들어 (핫-스타트) 중합효소와 같은 PCR의 다른 반응 파트너의 열 활성화 및/또는 반응부피의 구성 부분의 불활성화를위하여 제공될 수 있고, PCR 전에 활성화되어야 하나, PCR 동안에는 그러지 않아야 한다(예를 들어 효소 Uracil-DNA-글리코실라제).

하나의 실시예에서, 전술한 전체 가열단계에서 보다 낮은 전체 온도를 갖는 추가의 전체 가열단계가 이 전체 가열단계 전에 이루어질 수 있으며, 여기서 전체 가열단계가 이용될 수 있는데, 예를 들어, 효소가 방출되고, 반응 PCR 전에 일어난다(예를 들어 트랜스크립타제(transcriptase) 효소에 의한 DNA로의 RNA의 덮어쓰기와 같은).

변성단계 동안 및 이후의 공간 열 확산

변성단계에서 가열요소를 통과하는 전류 흐름이 시작되자마자 가열요소가 가열되기 시작한다. 대부분의 전류 전도 물질 (특히 금속)도 열을 매우 잘 전달하기 때문에 가열요소는 열 펄스의 지속시간 동안 거의 균일하게 가열된다. 바람직한 예시적인 실시예에서 수성 반응부피에 의해 둘러싸인 가열요소의 표면에서, 열은 반응부피로 전달되고 확산된다. 써멀 필드(thermal field)의 확산은 루트-형태(root-form) 규칙이 적용되는 열 확산을 통한 반응부피에서 실현된다.

[수학식 1]

여기서, d는 온도 전도도 D를 갖는 반응부피에서 공간 방향을 따라 시간 t 후에 열 전 방면에 의해 커버되는 경로 거리를 나타내며, 이하에서 "열 확산 범위(heat diffusion range)"로 지칭된다. 이는 예를 들어 100μs의 가열 지속시간 동안 가열요소에서 생성된 열이 값의 측면에서 D

1.6·10^-7 m²/s의 전형적인 온도 확산도("온도 전도도"라고도 함)를 갖는 반응부피로 멀리 확산될 수 있다는 것을 의미한다.

다시 말하면, 예를 들어 옴 손실에 의해 가열요소에서 발생된 열은 가열요소를 둘러싸는 반응부피로 100μs 후에, 즉 4 ㎛의 범위의 크기로 퍼진다.

상기 수학식에 상응하는 열의 공간적 확산을 통해 가져 오는 열의 양은 전체 평균온도보다 온도 ΔT 더 뜨거운 가열요소의 표면에 수직으로 점점 더 큰 부피에 걸쳐 분포하고, 값 ΔT/d의 온도 경사가 발생하여 열 수송을 용이하게 한다. 가열요소의 각각의 기하학적 구조에 대한 열 펄스 동안 및 이후의 공간 열 팽창의 더 정밀한 추정은, 예를 들어 Comsol과 같은 상업용 솔루션과 같은 유한 요소 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이는 열 확산식의 수치 솔루션을 용이하게 한다. 열 확산 범위의 두께를 갖는 층 내의 반응부피는 바람직하게는 가열수단 주위에서 적어도 10 ℃ 초과 가열된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 변성 단계의 말에 열 확산 범위는 PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로이며, 변성단계는 바람직하게는 0.05 ㎛ 내지 200 ㎛, 특히 바람직하게는 0.2 ㎛ 내지 100 ㎛, 특히 바람직하게는 0.5 ㎛ 내지 50 ㎛, 가장 바람직하게는 1 ㎛ 내지 25 ㎛이다. 한편으로, 가열요소의 표면에 수직인 가열된 영역의 충분한 공간적 확장이 달성될 수 있고 전형적으로 0.02 내지 3 ㎛의 길이(이에 따라 대략 60 내지 10000 염기쌍)를 갖는 가열요소 상에 형성된 PCR 앰플리콘이 가능한 한 균일하게 가열되어 변성될 수 있고 열 확산 범위는 그렇게 크지 않아 가열되지 않은 수동적 부피에 대한 가열-업 존의 부피비가 너무 낮아진다는 것이 본 발명의 이 실시예의 달성가능한 장점이다

본 발명의 의미에서 "가열-업 존(heating-up zone)"은 반응부피의 일부로서, 여기서 열이 변성단계 동안 확산할 수 있다. 가열요소의 표면에 수직인 가열-업 존의 팽창의 확장은 상기에서 정의된 열 확산 범위를 통해 대략 예측할 수 있다. 가열-업 존에 있지 않은 반응액체의 부피는 "비가열 수동적 부피(unheated passive volume)"로 지칭된다. 이것은 예를 들어 원통형 가열요소(예를 들면 가열 와이어)의 경우, 가열-업 존이 실린더 표면(즉, 두께 d를 가진 실린더 쉘)으로부터 열확산 범위 d의 거리에 위치한 부피로 평가될 수 있음을 의미한다. 가열요소가 예를 들어 반경 r 및 길이 I(예를 들어, 와이어)를 갖는 신장 실린더인 경우, 가열-업 존의 부피는 다음과 같이 대략 예측할 수 있다.

[수학식 2]

본 발명의 바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 증폭주기의 경로에서 가열-업 존의 비가열 수동적 부피에 대한 부피 비율은, 변성단계의 말기에 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 특히 바람직하게는 2% 미만, 특히 바람직하게는 1% 미만, 특히 바람직하게는 0.5% 미만, 특히 바람직하게는 0.25% 미만이고, 특히 가장 바람직하게는 0.1% 미만이다. 본 발명의 이 실시예에 따르면, 열의 높은 국지화가 달성될 수 있는데, 이는 변성단계에서 가져온 열의 양이 변성단계 후에 비가열 수동적 부피로 확산될 수 있음을 의미한다. 비가열 수동적 부피가 가열 영역보다 몇 배나 크기 때문에, 전체 반응부피(= 가열-업 존 + 비가열 수동적 부피)에 걸친 열량의 분포는 바람직하게 무시할 수 전체 반응부피의 전체 온도의 증가를 초래할 수 있어, 가열-업 존의 매우 빠른 냉각이 가능하며, 또한 냉각공정은 시료의 외부로 열이 방출되는 것과 (광범위하게) 독립적이다.

변성단계에서 국부적인 온도 증가의 평가

85 ℃ 내지 98 ℃의 이중가닥 핵산의 전형적인 변성온도에 대해서, 일 실시예에서 결합된 하이브리드화 및 대략 20 ℃ 내지 40 ℃의 신장온도에 대한 국부적인 온도상승은 가열요소의 표면 및 변성될 이중가닥 핵산의 길이에 걸쳐 도달되어야 한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 PCR의 증폭주기의 경로에서 반응부피와 접촉하는 가열수단 영역의 온도는 변성단계 동안 70 ℃ 내지 250 ℃, 특히 바람직하게는 75 ℃ 내지 150 ℃, 특히 바람직하게는 80 ℃ 내지 120 ℃, 가장 특히 바람직하게는 80 ℃ 내지 100 ℃이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 반응부피와 접촉하는 가열수단의 영역의 평균온도는 100 ℃ 초과이다. 본 발명의 이 실시예에 있어서, 이중가닥의 특히 신속한 분리가 유리하게 가능하다. 본 발명의 이 실시예는 증기 버블이 형성되지 않고 (그 중에서도, 가열요소의 표면의 곡률로 인한 높은 라플라스 압력(Laplace pressure)으로 인해 - Young-Laplace 방정식에 대한 전문 문헌 참조) 가열수단의 표면에서 반응부피의 단기간 과열이 가능하다는 사실을 이용한다.

가열수단의 복잡한 형상의 경우 및/또는 높은 정확도를 보장하기 위해, 전기적 동작 파라미터로서 가열요소의 온도를 결정하기 위해 유한 요소 방법(예를 들면, 컴솔(Comsol))의 사용이 권장된다. 그러한 시뮬레이션에서, 가장 단순한 경우에, 일정한 체적 가열밀도가 가정될 수 있거나 가열수단을 통한 전류 흐름이 시뮬레이션될 수 있다. 그러나 많은 경우에, 가열수단에 의해 초래된 온도 증가는 간단한 계산에 의해 추정될 수 있으며, 이는 하기의 실시예에 의해 제시된다.

첫째, 이를 통하여 전류가 흐르는 전도체에서 방출되는 열의 양이 결정된다. 가열요소를 가열하기 위한 전기 열펄스 동안 이용가능한 전력 P는 가열요소 R의 저항과 가열요소에 공급된 전압 U로부터 P = U²/ R로 계산된다. 가열요소에서 방출된 열량 Q는 전력 P와 가열 지속시간 t_heat의 곱이다.

[수학식 3]

여기서, 열 펄스의 지속시간에 걸쳐 일시적으로 일정한 전압 및 일정한 저항이 가정되었다. 그렇지 않은 경우 다음이 적용된다:

가열수단이 일정한 단면적을 갖는 균질한 전도체의 일 실시예(일부분)로 구성된다면 균질한 전도체의 저항 R은 그 단면적 A와 그 길이 ㅣ 및 이 전도체의 비 전도율 σ로부터 계산될 수 있다.

[수학식 4]

비전도율에 대한 전형적인 값은 전문 문헌의 표에 나타나 있으며 금과 같은 전형적인 물질에 대해서는 다음과 같다:

, 텅스턴은

이고, V2A(스테인레스 스틸)은

이다.

열 펄스의 지속시간이 너무 짧아서 에너지가 처음에 가열요소(들) 및 가열- 업 존만을 가열한다고 가정하면, 실제로 변성온도로 가열될 가열수단의 국부적인 온도 증가는 다음과 같이 계산할 수 있다:

[수학식 5]

여기서, C_MH는 가열요소의 비열 용량(질량 xx의 유닛 당)이고, m_MH는 그 질량이며, C_AHZ는 가열-업 존의 (질량-관련) 비열 용량(수용성 PCR 용액에 대한 c_AHz = 4.2J/(℃·g)이며 m_Az는 가열-업 존의 질량이다. 상기 근사치는 가열요소의 열용량과 비교하여 모두 보다 정확하고 작은 가열-업 존의 열용량이다. 이는 상기 식이 온도가 가열-업 존에서 급격히 떨어지는 것을 고려하지 않는다는 사실에 기인한다 (즉, 고체 가열 경사가 가열요소 주위에 형성된다).

가열 지속시간이 너무 짧아서 가열-업 존의 크기가 매우 작아서 (가열요소 자체보다 현저히 작아서) 가열요소의 열용량에 대한 열용량이 무시할 수 있을 정도로 작은 경우, 상기 식은 다음과 같이 단순화 될 수 있다:

[수학식 6]

수학식 6은 특수한 경우 및 매우 짧은 가열 지속시간에만 적용될 수 있지만, 수학식 5는 가열요소(들) 표면의 국부적 온도를 결정하기 위한 근사치로서 사용될 수 있으며, 여기서 각 경우에서 기하학적 구조 및 실제 전류 흐름으로부터 확인되어야 하고, 무엇보다도 가열-업 존의 질량을 계산할 수 있다. 대부분의 경우, 가열-업 존의 질량은 가열요소의 기하학적 구조와 열 확산 범위 (상기 참조)를 고려하여 그 부피로부터 예측할 수 있다.

본 발명에 의하여 특히 관련되는 경우가 하기에 고려될 것이며, 여기서 가열수단은 적어도 부분적으로 (대략) 원통형으로 형성되고 적어도 부분적으로 균질하고 일정한 단면을 갖는다. 다음의 계산은 가열수단의 원통형 구조에 대한 실시예로서 간주되어야 하며, 매우 쉽게 또한 다른 기하학적 구조로 전환될 수 있다. 수학식 5의 가열요소의 질량은 그 부피와 밀도로부터 계산할 수 있다:

여기서, A는 단면의 표면적이고 l는 가열요소 (또는 고려되는 부분)의 길이이다. 열량은 수학식 3 및 수학식 4를 사용하여 계산할 수 있다.

반경 r 및 길이 l을 가진 (거의) 원통형의 전도체 부분을 둘러싸고 있는 가열-업 존의 부피를 대략 나타내는 수학식 2에 의하여 가열-업 존의 질량을 하기와 같이 수학식 5에서 예측할 수 있다:

여기서 반응부피 내의 가열-업 존의 밀도는 물의 밀도와 같다(p_AHZ

P_H2O

lg·cm^-3). 따라서, (거의) 원통형으로 형성되고 적어도 일부분이 균질하고 일정한 단면을 갖는 가열요소에 대해, 수학식 2, 수학식 3, 수학식 4, 수학식 5를 사용하여 다음과 같이 예측할 수 있다:

원통형 전도체 부분에 대해서 단면적은 반지름 A = πr²으로부터 계산할 수 있으므로 수학식 1과 함께 다음과 같은 단순화된다:

[수학식 7]

상기 식을 사용하여 바람직하게는 변성온도를 달성하기 위한 파라미터를 결정할 수 있게 하기 위하여 (거의) 원통형 전도체가 가열 지속시간 동안 가열되는 온도를 대략 추정할 수 있다. 가열요소의 일부분만을 고려한 경우 (예를 들어 가열요소가 복잡한 기하학적 일련의 전도체로 구성되기 때문에), 전압에 대해 각각의 고려된 전도체 위로 떨어지는 전압만이 관련된다는 것이 명백하다.

따라서, 상기 식의 제1 인자

는 체적 가열 밀도(volumetric heating density)이고, 이는 하기에서 q, 즉

로 나타낸다. 이것은 수학식 8의 온도 증가가 체적 가열 밀도에 비례함을 의미한다.

예를 들어, 가열요소(들)가 와이어의 길이 l = 0.1 m 및 r = 12.5 ㎛를 가진 금(Au)의 와이어 그리고 V 전 간격의 전압 U = 10.5 V 및 t_heat = 200 ㎲의 가열 지속시간에 기초하여 수학식 7에 따라 물질 파라미터

로 지정된다면,

(

를 사용하는 경우, 이는 가열-업 존 내에 포함되는 반응부피에 대한 전형적인 값이다)의 가열요소 상에 국소적인 온도 증가가 일어난다. 사용된 작동 파라미터로부터 체적 전력 및 가열 밀도 q는

로 계산할 수 있어, 도 2b의 유한 요소 시뮬레이션의 결과와 비교할 수 있다. 이것은 5·10¹¹ W/m³의 상기 가열 밀도, 약 17 ℃의 가열에서 원통형 가열 와이어에 대해 200 ㎲의 가열 지속시간 후에 나타난다.

전력 및 에너지 밀도 제공

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 가열수단의 평균 체적 전력밀도는 바람직하게는 10⁹ W/m³ 초과, 바람직하게는 10¹⁰ W/㎥ 초과, 특히 바람직하게는 10¹¹W/㎥ 초과이다. 본 발명의 이 실시예의 달성가능한 이점은 가열요소가 짧은 열 펄스의 시간에 충분하게 빨리 가열된다는 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, PCR의 증폭주기의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 3개, 특히 바람직하게는 적어도 10개, 특히 바람직하게는 적어도 20개의 경로에서, 가열수단의 평균 비전력 밀도는 바람직하게는 10¹⁶W/㎥ 미만, 특히 바람직하게는 10¹⁵ W/㎥ 미만, 특히 바람직하게는 10¹⁴ W/㎥ 미만이다. 본 발명의 이 실시예에 따르면, 가열요소에 대한 손상을 유리하게 피할 수 있다.

가열요소로 사용되는 발열 저항체의 경우에 가열요소에서 발생하는 비전력 밀도(specific power density) q는 다음과 같이 주어진다.

즉, 가능한 한 높은 전압 U, 가능하면 높은 전도율 σ 및 짧은 길이 l이고, 여기서, 가열요소의 전압 강하가 높은 비전력 밀도를 유도한다. 따라서, 열 펄스의 공급을 위한 전체 전력 요구는 요구되는 체적 전력 밀도 및 가열수단의 모든 가열요소의 조합된 부피로부터 계산되며, 여기서 그것은 그 중에서도 진행되는 반응부피에 의존한다.

변성을 위한 국소 가열 단계를 통한 시료의 전체 가열

본 발명의 바람직한 실시예에서, 가열수단을 통과하는 전류 펄스는 가열수단 및 가열수단의 표면 바로 근처의 반응부피만이 상당히 가열되도록 선택되고, 따라서 단지 국소 가열이 일어난다. 이후에 설명한 바와 같이, 확산을 통한 열 방출이 점차적으로 일어나기 때문에, 전체 변성단계의 과정에서 야기된 열량 Q는 가열수단에서 국부적으로 생성되고 가열수단 자체 및 그 바로 근처에 걸쳐서 초기에 분포된다. 아래에 설명되어 있다. 이것은 열량 Q가 처음에는 매우 작은 부피에 분포하고, 시간 내에 주변 반응부피로 퍼지는("흐르는") 에너지의 양이라는 것을 의미한다. 열량(종종 "열"이라고도 함)이 가열요소와 그 바로 근처에서 공간적으로 여전히 집중되어 있으면 실질적인 온도 상승을 초래한다. 그러나 이 열량이 점점 더 큰 부피로 분배되자마자 원래 증가된 열량은 자연적으로 일정하게 유지되기 때문에 온도가 증가하지만 이에 따라 더 작아진다(단, 반응부피의 액체 부피를 고려하면, 열량이 분배되는 부피에 반비례하여 온도가 감소한다).

열량이 전체 반응부피로 분포되고 거기에서 전체 온도 상승이 일어난다는 것은 이후 "시료 열처리 시간(sample thermalisation time)"이라고 한, 일정시간이 지난 후이다.

반응부피를 얼마나 잘 절연시키느냐 또는 그것이 외부의 열탱크(thermic tank)에 얼마나 잘 결합되느냐에 따라, 열의 유입량은 반응부피에 남아있을 수 있거나(매우 좋은 단열재로 인해 점차적으로 약간의 PCR의 증폭주기의 각 경로에 따른 반응부피의 전체 온도의 상승을 유도한다.), 또는 반응부피의 양호한 열적 접촉의 경우, 열은 흘러나가서 반응부피가 원래의 온도로 되돌아 간다(가열 단계 전에). 실제로, 대부분의 경우 열의 유입량의 일부가 두 변성단계 사이의 시간에 흘러나가서 반응부피의 전체 온도가 PCR의 증폭주기의 첫 번째 경로에 걸쳐서 약간 (일반적으로 3 ℃ 미만) 증가한 후에야 평형상태가 형성되고, 각 사이클에 대해, 동일한 양의 열이 흘러 나가는 열의 양으로 유입된다.

시료 열처리 시간은 열의 유입량이 가열수단으로부터 전체 반응부피로 확산 될 때까지의 시간이다. 시료 열처리 시간은 가장 가까운 가열요소로부터 가장 먼 거리 d_max의 지점을 초기에 결정함으로써 예측할 수 있다(일반적으로 많은 경우에 이들 지점들은 반응부피를 제한하는 표면상에 있다). 시료 열처리 시간은 가열요소에서 생성된 열이 반응부피의 마지막 "코너(corner)"로 확산될 때까지 열 확산 범위가 d_max와 같을 때까지, 즉 이미지를 기준으로 한 시간이다. 예를 들어 반응부피가 반경이 1.01 mm인 원통형이고 가열요소가 실린더 축을 중심으로 동심을 이루는 반경 0.01 mm의 단일 원통형 와이어로 구성된 경우, 반응부피에서 가장 가까운 점 (이 경우 유일함)의 가열요소는 d_max = 1 mm이다. 수학식 1에 의해 6.3초 후에 1 mm의 열확산 범위가 생성되므로 이 특별한 경우에 시료 열처리 시간은 약 6.3초이다.

변성단계를 통해 일어나는 평균 온도의 최대 증가인 MGTE는 열량 Q와 가열 단계를 거쳐 반응부피로 들어가는 열 커패시턴스(heat capacitance)로부터

으로 예측할 수 있다. 반응부피의 밀도 p, 그 부피 V, 비열 용량 c 및 상관 계수

으로부터

라는 것을 예측할 수 있다. less-than 부호는 가열수단 및 반응용기의 열용량이 여기서 고려되지 않는다는 점에서 입증된다. 반응부피의 밀도 및 열용량은 일반적으로 물의 밀도 및 열용량, 즉 p = 1 g·cm³ 및 c = 4.2 J·℃^-1·g^-1이다. 열량 Q는 전기적 동작 파라미터로부터 결정될 수 있다: 열 펄스 t_Heat가 계속되고 열 펄스 동안 전압 U와 전류 I가 일정하면 Q = U·I·t_Heat (시간이 지남에 따라 전류 및 전압이 변함)이고, 하기 식이 적용된다:

이것은 첫 번째 경우에서 MGTE의 상한이 다음 식에 의해 결정될 수 있음을 의미한다.

[수학식 8]

(부피 V는 밀리리터 단위로 표시된다.). 여기서 물론, 반응부피 V에서 가열수단을 통해 떨어지는 전압 U만 및 반응부피 V 내에서 반응수단을 통해 실제로 흐르는 전류 I만이 고려되어야 한다(이는 예를 들어 입구 라인의 전압 강하는 고려되어야 할 필요가 없다는 것을 의미한다.)

MGTE는 단일 변성단계 전후에 수행되는 반응부피의 온도에 의해 실험적으로 결정될 수 있으며, 후자의 경우, 반응부피 내의 온도의 물리적 측정이 수행되는 것은 시료 열처리 시간 이후만이다. 두 측정 온도의 차이는 MGTE와 동일한다. 반응부피의 완전한 열처리, 즉 반응부피에서의 열의 균일한 분포가 보장되고 온도 센서가 가열-업 존의 온도를 예를 들어 무작위로 검출하지 않기 때문에 이 과정은 본 발명에 의하여 유리하다. 예를 들어 실제로 MGTE의 측정은 온도 센서로 감지할 수 있으며, 바람직하게는 반응부피로 가져오는 자체의 열용량이 특히 작다.

가열수단의 실시예

도 1a는 전압 소스(2)에 연결될 수 있는 가열수단을 형성하는 가열요소를 개략적으로 도시하고, 여기서 전기 펄스 생성 장치(3)는 일시적 전류 패턴(4)을 변화시킨다. 여기서, 전기 펄스 생성 장치(3)는 스위치이고, 도시된 상태와 같이 개방된 스위치로서, 일시적/시간-기반 관련 전류 패턴(4)에서 펄스가 보이지 않는다. 가열요소(1)는 자유 타겟핵산(6)이 하이브리드화될 수 있는 프라이머(5)로 기능화된다. 도면의 우측에는 가열요소 내부 및 주위의 온도 분포의 공간적인 진행이 도시되어 있다. 개방 스위치의 시점에서, 가열요소는 주변 액체에 대해 가열되지 않으며, 따라서 온도 프로파일은 평면이다.

도 1b는 가열요소(1)의 개략도를 다시 한번 도시한다. 프라이머(5)가 타겟(6)으로 하이브리드화한 후에 프라이밍된 타겟핵산(7)은 중합효소에 의해 신장되어 핵산 이중가닥(8)을 형성할 수 있다.

도 1c는 핵산의 신장 후에 전기 펄스 발생 장치(3)가 어떻게 활성화되는지를 도시하며(여기에 도시된 스위치는 이제 폐쇄 상태이다), 일시적 전류 패턴(4)에서 전기 펄스가 도시될 수 있다. 이는 가열요소(1) 및 국소적 그 근방의 가열(도면의 우측의 가열요소 내부 및 주위의 온도 분포의 공간적 진행으로 도시됨)을 유도하여, 충분한 국소 가열의 경우, 핵산 이중가닥은 변성되고, 다시 한번 자유 타겟과 앰플리콘(6)이 형성되고 가열요소상에서 신장된 프라이머(9)가 남는다. 자유 타겟과 앰플리콘 및 신장된 프라이머 모두 후속의 증폭주기에서 추가 증폭을 위한 주형으로서 작용할 수 있다.

시뮬레이션된 온도 패턴

도 2a는 열 펄스의 시작 후에 상이한 시점, 즉 50, 100, 200, 400, 800 및 1600 ㎲에서의 가열 와이어(예를 들어, 가열요소를 나타냄) 및 그 부근의 공간 온도 패턴에 대한 유한 요소 시뮬레이션을 도시한다. 세로축 상에서, 온도 증가는 열 펄스의 시작 전의 값과 관련하여 기록된다. 가로축에는 와이어의 실린더 축으로부터의 거리가 기록된다. 여기서, 직경 25 ㎛의 금으로 제조된 와이어로서, 체적 전력 밀도 2·10¹² W/㎥로 50 ㎲ 동안 수용성 근방에서 가열되는 것으로 가정된다(식

에 따라 가열 와이어 길이의 미터당 210V의 전압에 해당됨).

50 ㎲ 후 와이어의 표면에서 약 25.5 ℃의 온도 상승에 도달하지만 온도 상승은 이미 표면으로부터 수 마이크로미터 후에 이미 떨어진다는 것을 알 수 있다. 한편, 1600 ㎲ (즉, 열 펄스의 종료 후 1550 ㎲) 후에 열은 가열 와이어의 표면으로부터 약 10 ㎛ 정도 이미 확산되었고 따라서 훨씬 더 큰 체적을 채운다. 이것은 와이어 표면의 온도가 열 펄스 이전보다 약 3 ℃ 더 따뜻하도록 한다.

커브 진행은 체적 전력 밀도에 비례하여 조정된다는 것이 지적되어야 한다. 예를 들어, 4배의 전력 밀도(와이어 길이가 일정한 전압의 두 배에 해당)의 경우 전체 공간 온도 패턴의 온도 상승이 4배 증가한다.

도 2b는 가열 펄스의 시작, 즉 가열 와이어의 가열-업 거동이 나타나기 때문에 (예를 들어, 가열요소에 대한) 상이한 가열 와이어의 시간-기반 온도 패턴의 유한 요소 시뮬레이션을 나타낸다. 세로축에서 온도 증가는 열 펄스의 시작 전의 값을 기준으로 기록된다. 가로축에는 열 펄스가 시작된 이후의 시간이 기록된다. 여기서, 직경이 10, 25, 50 및 100 ㎛인 금으로 제조된 전체 와이어가 5 내지 10¹¹ W/㎥의 체적 전력 밀도로 가열된다고 가정한다(가열 와이어 길이의 미터당 104 V의 전압에 상응함). 여기서 일정한 체적 전력 밀도는 더 큰 직경을 갖는 와이어가 더 높은 전력으로 가열됨을 나타내며(더 큰 부피를 가지기 때문임), 궁극적으로는 전기 저항이 더 낮고 따라서 일정한 전압을 가진 더 높은 전류 흐름으로 인한 것이다.

초기에 (처음 수마이크로초 동안) 와이어 표면의 온도 상승은 가열 지속시간과 대략 선형으로 증가하고 - 무엇보다도 작은 와이어 직경과 함께 - 평평하게 퍼지고 선형보다 적게 증가하는 것을 볼 수 있다. 이 효과는 가열요소의 직경이 작으면 가열-업 존의 열용량이 더 큰 역할을 하거나 다시 말하면, 작은 와이어 직경에 대한 더 높은 부피/표면 비에 기인한 확산을 통한 열을 제거하는 운반은 더 이른 시점에서 중요하다는 사실에 기인한다. 커브 패턴은 체적 전력 밀도에 비례하여 조정된다는 것이 지적되어야 한다. 예를 들어, 4x 4배의 전력 밀도(일정한 와이어 길이가 가진 전압의 두 배에 해당됨)에 대하여 와이어 표면에 도달하는 온도도 4배 증가한다.

도 2c는 200 ㎲의 지속시간을 갖는 열 펄스의 종료 후 (예를 들어, 가열요소에 대한) 상이한 가열 와이어 상의 표준화된 시간-기반 온도 패턴의 유한 요소 시뮬레이션을 도시하는데, 즉, 가열 와이어의 냉각 거동을 나타낸다. 세로축 상에서, 여전히 존재하는 표준화된 온도 증가는 열 펄스의 시작 전의 값에 대하여 기록된다. 가로축에는 열 펄스가 끝난 이후의 시간이 기록된다. 여기서, 직경이 10, 25, 50 및 100 ㎛인 금으로 제조된 전체 와이어가 200 ㎲ 동안 가열되었다고 가정하였다. 모든 와이어 직경에 대해 이미 10 ms 후 원래의 온도 증가(열 펄스의 끝에서)가 분수로 감소한 것을 볼 수 있다. 와이어 직경이 10 및 25 ㎛인 경우, 나머지 온도 증가는 초기 값의 5% 미만으로 감소되어 본 발명의 잠재력을 나타내며, 즉 10 ㎛ 직경의 와이어의 경우, 다음 열 펄스(즉 변성단계 또는 PCR 주기)는 이미 10 ms 후에 가능하다. 와이어 직경이 작을수록 표면/부피 비율이 높아지고 열 펄스 후 냉각이 더 빨리 발생한다.

도 2d는 열 펄스의 시작 이후의 가열요소의 일시적인 온도 패턴의 유한 요소 시뮬레이션을 도시하는데, 즉 그 가열-업 거동을 나타낸다. 가열요소는 200 ㎛ 직경의 비-전도성 PMMA 실린더에 적용된 200 nm(나노미터) 두께의 금 필름으로 구성된다. 세로축 상에서, 열 펄스의 시작 전의 그 값에 대한 온도 증가가 기록된다. 가로축의 값은 실린더 축으로부터의 거리를 그 양으로 나타낸다. 여기에 금으로 만들어진 200 nm 두께의 원통형 외장이 있다고 가정했는데, 이는 2.2·10¹³ W/m³ (실린더 외장 길이의 미터당 692 V의 전압에 해당됨) 레벨의 체적 전력 밀도로 200 ㎲의 지속시간 동안 가열되는 것으로, 반면에 주변의 수성 반응부피에서와 같은 방식으로 (플라스틱으로 만들어진) 실린더 내부에서는 열이 생성되지 않는다(즉 체적 전력 밀도는 0 W/m³이다). 200 ㎲의 가열 지속시간 후에 (반경 방향으로의) 온도 분포가 여전히 금 박막 주위에 강하게 국한되며, 열은 수성 외곽 영역 또는 실린더의 중간에서 시간의 부족으로 확산될 수 없다. 펄스의 종료 후 (t > 200 ㎲) 금 박막은 냉각되고 열은 수성 외측 영역과 실린더 내부로 퍼진다. 약 6.4 ms 후에 실린더 외장에서 발생된 써말 필드가 실린더의 중앙에서 함께 작동하는 것을 볼 수 있어서, 여기서, 온도는 초기에 더 진행된다. 반면에 외부 영역에서는 이미 25 ms 후 온도 상승이 단지 2 ℃ 미만이라는 것을 알 수 있다. 가열요소로서의 금속 박막의 본 발명에 따른 사용의 두 가지 이점, 즉 큰 표면 (여기서는 직경이 200 ㎛인 실린더)에 적용될 수 있고, 동시에 아주 작은 부피 (따라서 열 질량)을 가짐으로써 매우 짧은 시간(≪ 1초)에 거의 완전히 다시 냉각된다.

실험적 전환

도 3a는 가열수단에 전류를 인가하기 위해 전기 펄스를 발생시키는 제어장치로서 전기 회로(10)의 실시예를 나타낸다. 이 회로는 접지(GND)와 U₊ 사이에서, 가열수단이 가열되어야 하는 전압(이 문서에서 항상 "U"로 표시됨)이 공급되도록(예를 들어, 30 내지 100 V) 구성된다. 포인트 R3 "Load"에서, 가열수단이 배열되어, R3은 가열수단의 저항체이다. 예를 들어 사용된 파워 MOSFET Q (IRFP4468, 국제 정류기)는 전류가 가열수단 R3을 통해 흐르는 방식으로 연결된(connected-through) 접점 T2와 접점 T3 사이의 낮은 옴 연결을 생성한다. MOSFET의 접지와 게이트(접점 T1) 사이에, 예를 들어 펄스 또는 주파수 발생기 또는 디지털-아날로그 변환기에 의해 제공되는 제어 전압이 제어 단자 FET GND (rt/ge)를 통해 공급된다. 특히 5 V의 레벨 및 예를 들어 10 내지 1000 ㎲의 지속시간을 갖는 펄스가 특히 적합하여 MOSFET을 확실하게 연결할 수 있다. 포인트 C1에서, 예를 들어 4 mF의 충분한 커패시턴스와 가능한 최저 ESR 값을 갖는 커패시터가 제공되어 낮은 옴 가열수단 - 모든 가열요소의 저항이 일반적으로 1 Ω(Ohm) 미만 -으로도 열 펄스의 지속시간 동안 유지되는 공급된 전압을 허용한다. 예를 들어, 저항 R1, R2, R7 및 R9는 1, 100, 24 및 24 kΩ (kilohm)의 저항값을 갖는다.

도 3b는 가열수단이 전압원(11)에 연결된 연속 와이어(12)의 부분들에 의해 형성되는 본 발명의 실시예의 단면을 개략적으로 단순화한 방식으로 나타낸다. 예시를 단순화하기 위해, 전기 펄스 발생 장치는 생략되었다. 또한, 도면은 규모에 맞지 않는다. 와이어는 2 부분 온도-조절 블록(14) 사이에 위치된 시료 플레이트(13) 내의 시료 액체 챔버(또한 "웰(wells)"이라고도 알려져 있음)의 형태로 서로 분리된 복수 개의 반응용기를 통과한다. 온도-조절 블록(14)은 시료 액체 챔버 내의 반응부피를 하이브리드화/신장 온도로 가져와서 유지시키는 기능을 갖는다. 여기에 도시된 실시예에서, 각각의 시료 액체 챔버 아래의 온도-조절 블록(14)의 하부에 각각의 반응부피에서 염료를 여기시키기 위한 여기 광원(이 경우에는 광학적 로우 패스 필터(optical low pass filter)를 갖는 발광 다이오드(15)의 형태임)가 있으며, 온도-조절 블록(14)의 상부에는 각각의 시료 액체 챔버를 걸쳐서/위에 각각의 반응부피 내의 여기된 염료의 형광을 검출하기 위한 광 센서로서의 포토 다이오드(16)가 있다(형광성 빛이 통과할 수 있는 광학적 하이패스 필터(optical high pass filter)).

도 3c는 본 발명의 또 다른 실시예의 단면을 개략적으로 및 간략하게 도시하며, 가열요소가 전압소스(11)에 연결된 와이어(12)로 구성된 코일로서 설계된다는 것이 도 3b의 예시적인 실시예와 다르다. 예시를 단순화하기 위해, 펄스 발생 장치도 여기서 생략되었다. 코일로 권선된 와이어 형태의 가열요소는 각각의 반응용기 내의 반응부피와 접촉한다. 도면에 도시된 것과는 반대로, 이들은 반응부피에 의해 완전히 둘러싸인 것이 바람직하다. 이 예시적인 실시예에서 반응용기는 반응부피를 하이브리드화/신장 온도를 가져오고 거기서 유지하기 위해 온도-조절 블록(14) 내에 위치한 반응튜브의 형태로 서로 분리된 복수 개의 시료 액체 챔버이다. 여기에 도시된 실시예에서, 각각의 시료 액체 챔버 아래의 온도-조절 블록(14)의 하부에, 반응부피 내의 염료를 여기시키기 위한 여기 광원으로서의 발광 다이오드(15)가 있고, 상기 각각의 시료 액체 챔버는, 반응부피 내의 여기된 염료의 형광을 검출하기위한 광 센서로서 포토다이오드(16)가 있다.

와이어 가열요소를 가진 시료 플레이트 생산

도 3d는 본 발명에 따른 장치의 시료 플레이트가 와이어 가열요소로 생성될 수 있는 구성요소를 개략적으로 도시한다. 여기서 사용되는 가열요소는 직경 25 ㎛의 금-도금 외장 와이어(12)의 부분(약 1 ㎛ 금 피복을 갖는 23 ㎛ 텅스텐 코어, LUMA METALLAB, Kalmar, Sweden)의 일부이다. 이것은 0.5mm의 두께를 가진 아크릴 유리판(17)(중간, 더 가벼운 판) 주위에 권취된다. 플레이트에는 7개의 구멍(6mm x 6mm)이 있으며, 이를 통과하는 시료 액체 챔버(웰)가 형성된다. 권취를 통해, 각각의 시료 액체 챔버 내에 2개의 평행층이 있으며, 각각의 층은 15개의 평행한 가열요소를 갖는다: 가열수단의 2개의 층은 플레이트로 인해 0.5 mm의 거리에 있고, 층 내의 가열요소는 약 0.4 mm의 거리를 갖는다. 시료 액체 챔버에 대한 대응하는 리셉터클(receptables)을 갖는 양면 접착 호일(18)(3M의 어두운 색의 100-250 ㎛ 두께의 VHB 접착 테이프로 나타냄)에 의하여 동일한 구명을 가진 추가 아크릴 유리판(19)(0.5 mm의 하부 판의 두께 및 3 mm의 상부 판의 두께)이 상기 플레이트(17)에 부착되고, 접착 테이프(18)의 제조업자의 지시에 따라 가압된다. 하기로부터 웰은 얇은 호일(20)로 각각 폐쇄되어 있고(도면에서 밝은 색, 접착 PCR 호일 실, 4titute), 이들은 바닥의 아크릴 유리판에 붙어 있다. 이러한 방식으로, 7개의 웰을 갖는 시료 플레이트가 형성되고, 이를 통해 평행한 와이어(12)가 당겨질 수 있다. 와이어(12)는 플레이트의 2개의 바깥쪽 단부(즉, 모든 와이어/가열요소는 병렬로 연결됨) 및 전기 접촉점에서 서로 연결된다. 전류 펄스가 모든 웰을 통해 직렬로 전송되도록 하는 방법으로 가능하다. 시료 플레이트(여기 상부에서)의 구멍은 얇은 호일(21)(밝은 색으로 표시)로 폐쇄될 수 있다. 시료 플레이트의 폭은 20 mm이고 길이는 90 mm이다 (따라서 열 펄스의 전압은 끝 부분의 와이어가 3 mm 초과 된다면 필수적으로 약 96 mm의 길이로 떨어지며, 이는 접촉 목적으로 요구됨).

전체 온도 상승의 측정

도 3e는 도 3d에 따른 본 발명의 예시적인 실시예의 반응부피에서 전체 온도 상승의 측정 결과를 나타낸다. 도 3d에서 도시된 바와 같이 제조된 시료 플레이트의 웰은 각각 100 ㎕의 물로 채워진다. 온도 센서인 PT100 센서가 중간 웰 중 하나에 추가로 삽입된다. 3 A의 일정한 전류를 와이어를 통해 보내면 물 시료에서 200초 동안 약 47 ℃의 온도 상승이 관찰된다(해시(hashes)가 있는 커브). 반면에, 본 발명에 따라 제공되는 경우, 80 A의 전류 펄스는 단지 3초마다 (전압 32V가 공급되고, 와이어의 부하 저항이, 0.4Ω), 측정 방법을 사용하여 1 ℃ 미만의 물 시료의 전체 온도 증가를 측정할 수 있다(원형 곡선).

게놈 핵산 및 백그라운드를 이용한 PCR

도 4는 도 3d에 따른 본 발명의 예시적인 실시예의 반응부피 각각에서 게놈 핵산 및 대조 측정치를 갖는 중합효소연쇄반응의 결과를 나타낸다. 도 3d에서 기술된 바와 같이 제조된 시료 플레이트의 웰 내의 가열요소는 정방향 프라이머로 기능화된다. 기능화를 위해, 정방향 프라이머 ID1이 사용된다. 티올은 금 표면에 결합하는 역할을 하며 처음 5개의 티민 염기(thymine base)는 실제 프라이머 서열과 금 표면 사이에 더 많은 공간이나 거리를 확보하기 위해 스페이서 서열로 작용하여 예를 들어 가능한 입체 장애물 방해물 xx를 방지한다. 기능화 전에, 이렇게 형성된 올리고뉴클레오티드의 티올 변형의 보호기는 PBS 완충액(5 mM 인산 완충액, 10 mM NaCl, 0.01% Tween20, 1mM EDTA, pH 7.5)에서 0.5 μm의 농도로 인큐베이션된 올리고뉴클레오티드에 의해, 15분 동안 1 mM 트리스-(2-카복시에틸)포스핀으로 인큐베이션하여 탈보호된다. 이어서, 기능화를 위해 500 mM의 NaCl의 최종 농도에 도달하기 위해 NaCl (5M)을 첨가해야 한다. 탈보호화된 올리고뉴클레오티드의 현탁액으로 와이어를 3시간 동안 배양한 후, 과량의 비-결합 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해 PBS 완충액으로 2회 세척 단계를 수행한다. 이 방법으로 준비된 플레이트는 이제 증폭 반응에 사용할 수 있다.

증폭 반응은 웰 당 총 부피 90 ㎕로 수행하였다. 반응 믹스는 36 μL, H₂0; 9 μL, MgCl₂ 120 mM; 18 μL 5x Aptataq 유전자형 마스터 (Roche); 9 ㎕ 역방향 프라이머 ID2 5 μm; 9 μL TaqMan 프로브, oligo ID3 2 μm로 구성되어 있다. 이에 덧붙여 웰에 따라 9 μL의 시료는 끓인 게놈 핵산 또는 물만 포함하고 있다. 정방향 및 역방향 프라이머 및 TaqMan 프로브는 저항성 유전자 MecA가 증폭되고 검출되도록 선택되어, 예를 들어 메티실린 내성 황색 포도상구균(methicillin resistant staphylococcus aureus, MRSA)의 게놈에서 발생한다.

플레이트는 알루미늄으로 만들어진 2개의 온도-조절 블록 사이에 위치하며, 하부 블록의 온도는 65 ℃이고 상부 블록의 온도는 70 ℃이다. 온도차는 상측 피복 호일 상에 응축물 형성을 피하는 역할을 한다. 가열요소를 포함하는 가열수단은 U + = 32 V의 전압으로 여기에서 작동되는 회로의 위치(R3)에서 도 3a에 대응하여 배열된다. 와이어는 0.4 Ω의 부하 저항을 형성하며, 다음 PCR 동안, 70 ㎲의 길이를 가진 전기 펄스는 매 3초마다 보내진다.

TaqMan 형식의 실시간 검출을 위해 더 낮은 온도-조절 블록에 478 nm 중심 파장 및 29 nm의 FWHM (ET480/30x, Chroma Inc, USA)을 갖는 상응하는 밴드패스(bandpass) 필터가 있는 여기 발광 다이오드가 있고 상부 온도-조절 블록에는 515 - 700 nm의 통과 영역을 갖는 포토다이오드 및 광학 필터(ET51 Olp, Chroma Inc. USA)도 있다.

상기 기술된 PCR의 결과는 도 4에서 볼 수 있는데, 여기서는 (PCR의 시작에서 형광 염기 신호 l₀에 대한) PCR 공정 동안의 형광 신호 l의 백분율 변화가 도시된다. 첫 번째 웰에서는 MRSA로부터 분리된 10⁶ 카피의 게놈 핵산을 시료로 사용하였다. 이 게놈 핵산이 MecA 유전자를 포함해서 PCR의 타겟서열을 포함하기 때문에, 기본 형광과 구별될 수 있는 신호를 생성하기 위하여, 이 시간에 충분히 큰 양의 앰플리콘이 형성(따라서 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 통해, TaqMan 프로브로부터 충분히 많은 양의 FAM 염료가 방출)됨에 따라 약 190 s의 PCR 지속시간 후에 대응하는 형광 곡선(실선 곡선)이 증가한다. 두 번째 웰에서 동일한 유기체의 타겟핵산 100x 적은 것을 사용했는데, 상응하는 형광 곡선(대략 깨진 곡선)은 220 s PCR 지속시간 이후부터 여기에서 나중에 증가한다. 따라서, 상기 방법은 (qPCR에서 통상적인 바와 같이) 사용된 타겟 농도와 형광 곡선의 증가 시간 사이의 상관관계를 허용한다. 세 번째 웰에서, 반응 믹스 이외에, 물만이 음성 대조군(미세하게 깨진 곡선)으로 첨가되었고, 네 번째 웰에는 대장균으로부터 분리된 게놈 핵산의 10⁶ 카피(MecA 유전자를 함유하지 않는 게놈의 E. coli)를 PCR의 특이성을 입증하기 위한 시료로 사용하였다(점선). 형광 곡선(물: 미세하게 깨진 선, 대장균: 점선)도 크게 증가하지 않았다. 마지막으로, 다섯 번째 웰에서 MRSA로부터 단리된 게놈 핵산 10⁴카피 및 대장균으로부터 분리된 게놈 핵산 10⁴ 카피를 모두 시료로 사용하였다. 대응 형광 곡선(파선-점선 곡선)은 MRSA로부터 분리된 게놈 핵산의 10⁴ 카피만을 함유하는 두 번째 웰로부터의 시료의 형광 곡선과 유사하게 행동한다. 이것은 대장균 핵산의 존재가 MRSA 핵산의 증폭을 억제하지 않는다는 것을 보여준다. 또한, 비교 증폭 실험에서 생산된 앰플리콘 양의 외부 정량은 종래의 써모사이클러(thermocycler, Roche Lightcycler 1.5)를 사용하여 수행되었다. 이를 위해, 상기 기재된 PCR의 경우에서와 같이, 형광 곡선의 인식 가능한 증가 직후에 상기 PCR 공정을 중단하고, 시료를 제거하고, 물로 1:100으로 희석하고 이 희석된 시료 1 ㎕를 동일한 프라이머 서열을 사용하는 qPCR에 삽입하였다(여기에서 정방향 프라이머, 그러나 티올 및 5T 스페이서 서열은 없음). 알려진 타겟 농도의 희석 시리즈 서열과의 비교는 명확한 신호 증가 시점에서 반응에서 약 3 nM (나노몰랄 또는 리터당 나노몰)의 앰플리콘 농도가 존재한다는 결과를 가져왔다. 이것은 또한 다른 써모사이클러의 경우 모두 형광 염기로 분화될 수 있는 신호의 전형적인 영역이며, 이는 수행된 PCR 동안 원하는 앰플리콘이 매우 많은 양으로 생산되었음을 추가로 명확하게 보여준다. 도 3e와의 비교는 주어진 조건(공급 전압 32 V, 와이어의 부하 저항 0.4 Ω)에서 200 s 내에 < 1 ℃의 반응부피의 전체 온도 상승만 검출할 수 있고, 따라서 반응부피의 변성온도(약 95 ℃)에 도달하는 것을 배제할 수 있다는 것을 보여준다. 그러나 티올-변형된 정방향 프라이머로 기능화함으로써, 앰플리콘은 여전히 가열요소에 결합된다. 가열 단계 및 전기 펄스 동안 국부적으로 온도가 앰플리콘의 변성을 달성하기에 충분히 높다는 것이 명백하다(여기에 표시되지 않음: 반응 믹스에 추가되었지만 서열 ID4를 가진 와이어에 결합하지 않은 자유 비변형 정방향 프라이머가 티올 변형 정방향 프라이머 대신에 사용되지만, 그렇지 않은 경우 동일한 조건하에서 증폭이 관찰되지 않을 수 있음. 따라서, 증폭 반응은 국부 가열의 경우 바람직하게는 국부 가열요소 상에 국한되며, 이에 의해 정방향 프라이머는 가열요소 상에 고정된다).

체적 전력 밀도가 다른 경우의 측정

도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 예시적인 실시예들의 도움으로, 공급된 전압에 대한 PCR 성능의 의존성을 나타내며, 식

에 따라 체적 가열 밀도를 변화시킨다. 여기서, 가열수단에 공급되는 상이한 전압을 갖는 측정 시리즈가 수행되었다. 파라미터 및 반응 믹스 조성물은 도 4의 예시적인 실시예에서의 것과 동일하며, 단지 웰 내의 시료에 의해 물을 음성 대조군(깨진 형광 곡선)으로 사용하고, 또한, 2개의 웰에서 서열 ID5를 가진 합성 타겟핵산을 사용하여, 반응 개시시의 최종 농도가 타겟핵산(실선 형광 곡선을 갖는 양성 대조군)의 각각 100 fM (펨토몰랄 또는 리터당 펨토몰)이 되도록 하였다. 타겟핵산은 선택된 프라이머 쌍에 의해 증폭될 수 있는 MecA 유전자로부터 절단된다. 첫 번째 측정에서(도 5a의 형광 곡선) 공급된 전압은 26 V이며 신호 리프트는 거의 볼 수 없다. 두 번째 측정(도 5b의 형광 곡선)에서 공급된 전압은 28 V이며 여기서 양성 대조군은 약하고 평평하게 증가하는 후반 발생 신호를 나타낸다. 세 번째 측정(도 5c의 형광 곡선)에서 전압은 36 V이며 여기에서 두 개의 양성 대조군은 대략 180s PCR 지속시간의 효과와 함께 명확하고 급격히 증가하므로 음성 대조군에는 신호가 표시되지 않는다. 이 측정 시리즈는 가열수단에 의해 반응부피 내로 도입된 열이 가열요소상의 앰플리콘의 필요한 변성온도에 도달하기 위해 충분히 커야 함을 보여준다.

도 5d 내지 도 5g는 일련의 측정의 결과를 나타내며, 여기서 시료 플레이트는 도 3d의 설명에서 상술된 방식으로 정확하게 생성된다. 그러나, 각 시료 플레이트에서, 상이한 수의 와이어가 사용되었다. 도 5d에서는 3개의 와이어를 사용하고, 도 5e에서는 5개의 와이어를 사용하며, 도 5f에서는 10개의 와이어를 사용하고, 도 5g는 30개의 와이어를 사용하였다(시료 플레이트 길이에 걸쳐 병렬로 연결: 3700, 2100, 2210 및 400 mΩ (milliohms)의 저항). PCR을 수행하기 위해 도 4와 관련된 텍스트 섹션에서와 같이 해당 화학 물질 및 완충액을 사용하였다. 열 펄스를 생성하기 위하여 전압 U+ = 40 V, 40 ㎲의 펄스 지속시간 및 3초의 펄스 반복 속도 (즉, PCR 주기 지속시간) 중 하나를 사용하였다. 저온-조절 블록의 온도는 63 ℃로, 상부 블록의 온도는 68 ℃로 하였다. 타겟핵산으로 반응 개시시 1 fM의 농도로 존재하는 합성 DNA ID5(실선)를 사용하였다. 음성 대조군(파선)에서는 타겟을 사용하지 않았다. 시료 플레이트에서 단지 3개의 와이어를 사용하는 경우(첫 번째 측정, 도 5d의 형광 곡선), 양성 대조군에서도 신호 리프트(즉, TaqMan 신호 없음, 즉 증폭 없음)를 볼 수 없다. 시료 플레이트에 5개의 와이어가 있는 경우(도 5e), 양성 대조군은 약한 신호를 나타낸다. 시료 플레이트에서 10개의 와이어의 경우(도 5f), 신호는 상당히 높지만, 통상적인 수의 와이어(즉, 30개가 사용되는 도 5g) 네 번째보다 여전히 현저하게 약하다.

허니컴 구조의 가열수단

도 6a 내지 도 6c는 허니컴 구조의 가열수단의 실시예를 나타낸다. 이의 제조를 위해, 스테인레스 스틸 호일로부터 광화학 미세 에칭 방법을 통해 허니컴 구조체를 제조한 다음, 허니컴 구조체를 금으로 코팅한다. 예시적인 실시예에서, 육각형 격자이지만, 당연히 다른 격자도 또한 고려될 수 있다. 전류는 그 길이 xx를 따라 구조물을 통해 흐르고, 도 6a에 도시된 바와 같이, 시료 챔버의 영역에서만, 따라서 호일이 가열요소를 형성하는 곳은 에칭된 허니컴 구조체이다. 가열요소의 길이(f)는 예를 들어 8.2 mm이고, 가열요소들 사이의 거리(g)는 예를 들어 3.8 mm이다. 시료 챔버는 바람직하게는 가열요소의 중앙 상부에 배치되고 가능한 한 고르게 강화되는 가열요소의 영역만을 사용하기 위해 보다 작은 치수(예를 들어, 6mm x 6mm)를 갖는다. 호일의 전체 길이(h)는 예를 들면 100 mm이고, 즉 전기 접촉은 짧은 면에서 발생하여, 전압은 약 100 mm의 길이에 걸쳐 떨어진다. 허니컴 구조체의 웹은 이들을 통과하는 전류로 인해 가열되어 이들에 결합된 이중가닥 핵산을 변성시킬 수 있다.

도 6b는 인접하는 에지를 갖는 도 6a의 가열요소의 허니컴 구조체의 확대도이다. 예시적인 허니컴 구조체에서, 웹 폭은 허니컴 구조체 전체에 가능한 한 균일 한 전류밀도 및 체적 가열 밀도가 달성되도록 구성된다. 예시적인 실시예에서, 이것은 종방향 웹의 폭(d)이 횡방향 웹의 폭(b)의 정확히 2배가 되도록 달성된다. 치수의 예는 허니컴 직경(a)에 대해 0.87 mm, 횡방향 웹의 폭(b)에 대해 0.065 mm, 웹 길이(c)에 대해 0.5 mm, 종방향 웹(d)의 폭에 대해 0.13 mm, 긴 에지(a)에 대해 0.57 mm이다. 긴 에지(3)는 무엇보다도 기계적 안정성을 제공하고 허니컴 구조와는 다른 전류 밀도를 경험한다.

도 6c는 도 4에서와 같이 (PCR의 시작에서의 형광 염기 신호 l₀에 대한) PCR 공정 동안의 형광 신호 l의 변화 백분율을 나타내고 여기서, 도 4의 실시예와는 대조적으로 사용된 가열요소는 약 0.5 ㎛의 금(호일 두께 20 ㎛)으로 코팅된 스테인레스 스틸 호일도 도 6a 및 도 6b에 도시된 구조로 사용되었다. 이 금-도금 격자는 도 3d의 예시적인 실시예(하부 판 두께 0.5 mm 및 상부 판 두께 3 mm)에도 사용된 바와 같이 7개의 웰 구멍이 있는 2개의 아크릴 유리판 사이에 붙어있다. 따라서 도 3d의 예시적인 실시예에서 이미 가열수단에 의해 횡단되는 시료 플레이트가 존재한다. 허니컴 구조체는 플레이트의 2개의 외측 단부에서 전기적으로 접촉된다. 따라서 전류 펄스가 모든 웰을 통해 직렬로 전송되도록 제조된다. 시료 플레이트의 구멍은 이어서 얇은 호일로 폐쇄될 수 있다. 허니컴 구조의 기능화는 도 3d 및 도 4의 텅스텐-금 피복된 와이어의 기능화와 유사하게 실현된다. 반응부피는 이제 웰당 60 μl이고, 반응 믹스의 조성과 농도는 도 4의 것과 일치한다. 공급 전압은 41 V이고 부하 저항은 0.35 Ω이다. 여기서, 150 ㎲의 지속시간을 갖는 전기 펄스는 매 10초마다 PCR 동안 가열요소를 통해 보내졌다. 스테인리스 스틸은 피복된 와이어의 코어가 이전 실시예에서 제조된 텅스텐보다 현저하게 낮은 전류 전도체이기 때문에, 이 실시예에서 스테인리스 스틸의 가열요소를 사용할 때보다 더 높은 전압 및 더 긴 가열 지속시간이 모두 사용된다. 도 6c에서 3개의 웰로부터의 형광 곡선을 볼 수 있다. 시료로서 물을 사용한 음성 대조군은 신호 증가(점선 형광 곡선)를 나타내지 않으며, 서열 ID5를 갖는 합성 핵산 타겟의 높은 초기 농도(100 fM)를 갖는 시료는 400 s의 PCR 지속시간으로부터의 효과를 가진 형광 신호의 증가를 나타내고(고체 형광 곡선) 서열 ID5를 갖는 합성 핵산 타겟의 낮은 출발 농도(1 fM)를 갖는 시료는 형광 신호의 후속 증가(깨진 형광 곡선의 증가)를 나타낸다.

브릿지 PCR(Bridge PCR)

도 7의 예시적인 실시예에서, 두 프라이머(정방향 프라이머 및 역방향 프라이머)는 가열수단의 표면 상에 존재한다. 이 예시적인 실시예에 대한 과정은 도 4의 예시적인 실시예에 대한 것과 본질적으로 대응한다. 그러나, 가열수단의 기능화를 위해, 정방향 프라이머 ID6의 한 부분과 역방향 프라이머 ID7의 세 부분의 혼합물이 사용되었다(탈보호화 동안의 두 프라이머의 총 농도 0.5 μm). 두 프라이머 모두 가열수단의 표면에 고정화 역할을 하는 티올 개질을 수행한다. 정방향 프라이머는 스페이서 서열에 부가하여, 스페이서 서열과 프라이머 서열 사이의 2개의 기본 변형 스페이서9을 운반하여 스페이서 서열의 중합효소에 의한 겹쳐 쓰기를 방지한다. 역방향 프라이머는 이미 가열요소에 존재하기 때문에 더 이상 반응부피에 존재할 필요가 없다: 그에 상응하여 누락된 부피는 물로 대체된다. 물을 갖는 음성 시료(파선) 및 서열 ID5를 가진 100 fM의 합성 핵산 타겟의 개시 농도를 갖는 양성 시료(실선)에 대한 신호 패턴 진행의 도 7의 형광 곡선. 실제로 여기 형광 신호는 이전의 예시적 실시예에서보다 현저히 작지만, 450 s PCR 지속시간 이후부터의 효과로, 양성 시료의 신호가 음성 시료와 비교하여 증가한다는 것을 여기서 분명히 알 수 있다. 이 예시적인 실시예는 프라이머가 모두 표면 상에 고정된 PCR 공정("Bridge PCR", see Kawashima et al., WO 1998/044151 A1 및 Adams et al., US 5641658 A)은 본 발명에 따른 방법으로 기능한다.

전술한 설명, 청구범위 및 도면에 개시된 특징은 개별적으로 또한 상이한 실시예에서 본 발명을 구현하기 위한 임의의 바람직한 조합으로 모두 중요할 수 있다.

1 가열수단의 와이어 형태의 가열요소 2 전압 소스
3 전기 펄스 발생장치 4 시간-기반 전류 진행
5 프라이머 6 프리 타겟 핵산
7 프라이머에 결합된 타겟 핵산 8 핵산 이중가닥
9 신장된 프라이머 10 전기회로
GND 전기회로의 접지 연결 U+ 전기회로의 전압 공급 연결
Q1 전기회로의 MOSFET T1 MOSFET Q1의 게이트 단자
T2 MOSFET Q1의 드레인 단자 T3 MOSFET Q1의 소스 단자
C1 전기회로의 커패시터 FET GND 전기회로의 제어 단자
R1 전기회로의 저항기 R2 전기 회로의 저항기
R3 가열수단 R7 전기회로의 저항기
R9 전기 회로의 저항기 11 전압 소스
12 와이어 13 시료 플레이트
14 온도-조절 블록 15 발광 다이오드
16 포토 다이오드 17 아크릴 유리판
18 양면 접착 필름 19 아크릴 유리판
20 박막(하부) 21 박막(상부)

Claims

반응부피에서 중합효소연쇄반응에 의한 핵산의 증폭방법으로서, 상기 반응부피는 전기에너지의 사용을 통해 가열되고, 상기 중합효소연쇄반응의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서 상기 반응부피의 크기에 대한 반응부피를 가열하기 위한 변성단계에서 사용된 전기에너지의 비는 20 Joule/밀리리터 미만인 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
반응부피에서 중합효소연쇄반응에 의한 핵산의 증폭방법으로서, 상기 반응부피와 접촉하는 하나 또는 복수 개의 전기적으로 접촉된 가열요소(1)로 구성된 가열수단이 상기 반응부피를 가열하고, 상기 중합효소연쇄반응의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서, 상기 가열수단은 C_R ^*　5 ℃보다 변성단계에서 발생된 열만큼 적은 열을 상기 반응부피에 공급하며, 상기 C_R은 가열수단에 의한 가열시 상기 반응부피의 열용량인 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
반응부피에서 중합효소연쇄반응에 의한 핵산의 증폭방법으로서, 상기 반응부피와 접촉하는 하나 또는 복수 개의 전기적으로 접촉된 가열요소(1)로 구성된 가열수단이 상기 반응부피를 가열하고, 상기 중합효소연쇄반응의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서 상기 가열수단은 변성단계를 통해 일어나는 상기 반응부피의 평균온도의 최대 증가치가 10 ℃ 미만인 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
반응부피에서 중합효소연쇄반응에 의한 핵산의 증폭방법으로서, 반응부피와 접촉하는 하나 또는 복수 개의 전기적으로 접촉된 가열요소(1)로 구성된 가열수단이 반응부피를 가열하고, 상기 중합효소연쇄반응의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서 상기 가열수단은 C_R ^*　5 ℃보다 변성단계에서 발생된 열만큼 적은 열을 상기 반응부피에 공급하며, 상기 C_R은 가열수단에 의한 가열시 상기 반응부피의 열용량이고, 상기 가열수단이 시료를 가열하는 동안, 일시적으로 안정한 온도는 상기 반응부피를 가진 가열수단의 접촉면적의 10% 이상으로 설정되지 않는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가열요소(1) 또는 가열요소 중 적어도 하나는 발열 저항체인 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응부피와 접촉하는 상기 가열요소(들)(1)의 표면과 상기 반응부피 사이의 비율은 미터당 0.1보다 큰 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가열수단을 통한 열 공급은 상기 중합효소연쇄반응 동안 변하는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서 주기 지속기간 t_c가 60초보다 짧은 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응의 지속기간 t_PCR이 45분보다 짧은 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭방법.
반응부피를 수용하기 위한 반응용기 및 상기 반응부피를 가열하기 위하여 반응부피와 접촉해 있는 하나 또는 복수 개의 가열요소(1)로 구성된 가열수단을 포함하고, 하나 이상의 상기 가열요소(1)는 상기 반응부피 내에서 핵산의 증폭을 위해 올리고뉴클레오티드(5)에 접합된 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭장치의 용도.
반응부피를 가열하기 위해 상기 반응부피와 접촉하는 하나 또는 복수 개의 가열요소(1)로 구성된 가열수단을 포함하는 반응부피 내의 핵산의 증폭장치.
제11항에 있어서, 상기 가열요소 중 적어도 하나는 올리고뉴클레오티드(5)에 접합되는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭장치.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 장치는 광원(15) 및 광센서(16)를 포함하는 핵산의 증폭장치.
전기에너지를 사용하여 반응부피를 가열하기 위한 하나 또는 복수 개의 가열요소(1)로 구성된 가열수단 및 상기 전기에너지를 장치로 전달하는 수단을 포함하고, 상기 장치는 PCR 동안의 전력소비가 임의의 시점에서 50 Watt를 초과하지 않도록 구성되는 것을 특징으로 하는 반응부피에서 핵산의 증폭장치.
제11항, 제12항 또는 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 전기저장부를 포함하고, 상기 전기저장부 내에서 0.1 J/mL 초과의 전기에너지가 계속 이용가능하도록 디자인된 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭장치.
반응부피를 수용하기 위한 반응용기, 전기에너지를 사용하여 반응부피를 가열하기 위한 하나 또는 복수 개의 가열요소(1)로 구성된 가열수단 및 상기 전기에너지를 장치로 전달하는 수단을 포함하고, 상기 장치는 PCR 동안의 전력소비와 상기 반응용기의 용량 사이의 비율이 임의의 시점에서 1 Watt/밀리리터를 초과하지 않도록 구성되는 것을 특징으로 하는 반응부피 내의 핵산의 증폭장치.
중합효소연쇄반응에 의한 반응부피에서의 핵산의 증폭장치로서, 상기 반응부피를 수용하기 위한 반응용기, 하나 또는 복수 개의 가열요소(1)로 구성되는 가열수단 및 상기 반응부피를 가열하기 위하여 상기 가열수단에 전류를 인가하는 제어수단을 포함하고, 상기 제어장치가 상기 중합효소연쇄반응의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서, 변성단계에서 제어수단에 의해 상기 가열요소에 적용된 전기에너지와 반응용기의 용량과의 비율이 40 Joule/밀리리터 미만이 되도록 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭장치.
중합효소연쇄반응에 의한 반응부피에서의 핵산의 증폭장치로서, 상기 반응부피를 위한 반응용기, 상기 반응부피를 가열하기 위한 적어도 하나의 가열요소(1)로 구성되는 가열수단, 상기 반응부피로 상기 가열수단의 열방출을 조절하기 위한 제어수단을 포함하고, 상기 제어수단은 상기 중합효소연쇄반응의 증폭주기의 적어도 하나의 경로에서, 변성단계에서 상기 가열수단에 의해 상기 반응부피로 방출되는 열량과 반응부피를 수용하기 위한 상기 반응용기의 용량이 20 Joule/밀리리터 미만이고, 상기 가열수단의 적어도 하나의 가열요소가 적어도 하나의 방향으로 1.5 마이크로미터보다 큰 확장부를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭장치.
제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 전기저장부를 포함하고, 상기 전기저장부 내에서 계속 이용가능한 전기에너지가 100 J/mL 미만인 것으로 디자인된 것을 특징으로 하는 핵산의 증폭장치.