JP7140759B2 - ポリメラーゼ連鎖反応を実行するための方法および該方法を実行するための装置 - Google Patents
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Description
有利な実施形態および改良が従属請求項の主題である。それらの有利な実施形態および改良は、個別にまたは互いに組み合わせて使用することができる。
本発明の好ましい一実施形態では、1つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段によって反応体積が加熱され、特に好ましくはこの加熱要素または加熱要素のうちの少なくとも1つの加熱要素が電気的に接触しており、特に好ましくはすべての加熱要素が電気的に接触している。このようにすると、有利には、電流が加熱要素を流れることを達成することができる。本発明のこの実施形態は、電気的に接触する加熱要素を、特に単純には電気的制御装置によって動作させ、調節することができることを利用することができる。
本発明の好ましい一実施形態では、加熱手段の加熱要素のうちの少なくとも1つの加熱要素が、オリゴヌクレオチドに接合されている。すなわち加熱要素にオリゴヌクレオチドがつながれている。加熱手段のすべての加熱要素がオリゴヌクレオチドに接合されていることが特に好ましい。このようにすると、有利には、反応体積全体を加熱する必要なしに、本発明に基づく方法の部分であるオリゴヌクレオチドを加熱手段によって特異的に加熱することを達成することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、加熱要素が、PCR法のプライマー、よりいっそう好ましくはフォワードおよびリバース・プライマーに接合されている。本発明の好ましい一実施形態では、加熱要素もしくは加熱要素の一部分にフォワード・プライマーが取り付けられており、リバース・プライマーは取り付けられておらず、かつ/または加熱要素もしくは加熱要素の一部分にリバース・プライマーが取り付けられており、フォワード・プライマーは取り付けられていない。それぞれの場合に、もう一方のプライマーの分子は、遊離した状態で反応体積中に分散させることができる。加熱手段の熱発生構成要素と反応体積との間に分離層が使用される場合には、オリゴヌクレオチドが液体の反応体積からアクセス可能となるような方式で官能基化が実現されなければならない。すなわち、分離層の表面にオリゴヌクレオチドが取り付けられていることが好ましい。
加熱手段による熱供給はPCR中に変動することが好ましい。加熱手段による熱供給は、PCRの増幅サイクルの少なくとも1回のパッセージ中に変動することが特に好ましく、PCR増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも3回のパッセージ中に変動することが特に好ましく、少なくとも10回のパッセージ中に変動することが特に好ましく、少なくとも20回のパッセージ中に変動することが特に好ましく、周期的に変動することが特に好ましい。
本発明に基づく好ましい装置は、PCR中のいずれの時点においてもその電力消費が50W、特に好ましくは20W、特に好ましくは10W、特に好ましくは3W、特に好ましくは2.5W、特に好ましくは1.5W、特に好ましくは0.5Wを超えないように構成されている。この制限は、装置のスイッチオン工程中に生じうる高い電力消費には適用されない。このような高い電力消費は、技術的理由によりスイッチオン電流によって生じる可能性がある。このような高い電力消費はPCR中の電力消費とはみなされず、したがってここでは考慮されない。本発明のこの実施形態を用いると、有利には、一般的なポータブル電源で装置を動作すること、たとえば自動車バッテリー、自動車のシガレット・ライター、またはPC、タブレット・コンピューターもしくはモバイル・フォンのポート、たとえばUSBまたはApple lightning connectionで装置を動作することを達成することができる。
核酸を増幅するための好ましい装置は、反応体積を収容するための反応容器を有する。本発明に基づく方法の適当な反応容器は、PCR管もしくはPCR管の複合体(たとえばいわゆる8連管)または多穴プレートなどの従来のPCR反応容器であることがあり、さらにたとえばフラット・プレートまたは充填することができる他の形状/形態であることがある。加熱手段、たとえば多穴プレートまたはPCR管の壁を貫いて延びる線を、すでに製造工程(たとえば射出成形)中に反応容器に収容することができ、または(たとえば多穴プレートの個々のウェル内に吊り下げることができるコイルの形態の線の場合にように)製造工程後に追加することができる。
本発明に基づく好ましい装置は、反応体積を加熱するために加熱手段に電流を流す制御装置を備える。この制御装置は、PCR増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも1回、好ましくは少なくとも3回、特に好ましくは少なくとも10回、特に好ましくは少なくとも20回のパッセージで、反応体積を加熱するために変性ステップで使用される電気エネルギーと反応容器の容積との比が40J/ml(ジュール/ミリリットル)未満、特に好ましくは20J/ml未満、特に好ましくは10J/ml未満、特に好ましくは3J/ml未満となるように構成されていることが好ましい。
本発明に基づく方法では、アンプリコンが検出されること、または試料中のターゲット原核酸の存在が検出されることが好ましい。これはたとえば、PCR後のゲル電気泳動によって、アンプリコンとそのアンプリコンまたはそのアンプリコンの部分に相補的な固定されたオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって、たとえば蛍光染料による検出によって、または電子的方法による検出によって実現することができる。別の好ましい実施形態では、光学的方法の助けを借りてポリメラーゼ連鎖反応の進捗を観察するために、すでに反応体積中でのPCR中にリアルタイム検出が実施される。そのためには、光学的方法、特に蛍光法、たとえばTaqManフォーマットの蛍光法が特に好ましい。米国特許第5210015号明細書およびHolland他、Proc Natl Acad Sci USA、88(16)、1991、7276~7280ページの関連する開示は、この参照によって本開示の一部とみなされる。この方法では、PCR中に特定の蛍光信号が生成され、この信号は、増幅反応のリアルタイム観測および最初に使用されたターゲット核酸の数の数量化を可能にする。他のリアルタイム検出法、たとえばSybrGreenなどのインターカレーション染料の使用および分子ビーコン・プローブの使用も可能である。しかしながら、本発明はさらに、たとえば後続のプロセスでアンプリコンがさらに使用されるという意味で、核酸の増幅が純粋に予備的なものである実施形態を含む。
一例として、本発明に基づく方法では、PCRの増幅サイクルの最初のパッセージを以下のように実行することができる。反応体積への核酸分子(以後、「ターゲット核酸」として説明する)の追加(および場合によっては大域加熱によるターゲット核酸の変性)ならびにターゲット核酸と1つまたは複数の加熱要素に結合されたフォワード・プライマーとのハイブリッド形成の後、ポリメラーゼがフォワード・プライマーを伸長させ、それによってターゲット核酸の相補鎖を生成する。変性、すなわち伸長させたフォワード・プライマーからのターゲット核酸分子の分離は、反応体積全体の大域加熱によって実現されるのではなく、加熱手段の加熱要素を流れる電流パルスによって生み出される熱パルスによって実現される。
好ましい例示的な実施形態では、たとえば従来の外部ヒータ、たとえば温度調節ブロックによって、または加熱要素を流れる一定の(もしくは調節された)オフセット電流による加熱要素の一定の(もしくは調節された)励起によって、PCRの全過程の間、(大域)伸長/ハイブリッド形成温度が一定に保たれる。
変性ステップにおいて加熱要素に電流が流れ始めるとすぐに、加熱要素は発熱し始める。最も良く電流を伝導する材料(特に金属)は熱も非常によく伝えるため、熱パルスの継続時間の間、加熱要素はほぼ均質に発熱する。この熱は、好ましい例示的な実施形態では水性反応体積によって取り囲まれている加熱要素の表面で反応体積に伝達され、そこで広がる。反応体積中でのこの熱場の広がりは熱拡散によって実現され、この熱拡散には平方根形の規則が適用される。
VAHZ≒π・l・((r+d)2-r2) 式2
85℃から98℃の間である2本鎖核酸の典型的な変性温度に関して、一実施形態では、結合ハイブリッド形成/伸長温度から概ね20℃から40℃の間の局所温度上昇を、加熱要素の表面および変性させる2本鎖核酸の長さにわたって達成しなければならない。
Q=U2・theat/R 式3
上式では、熱パルスの継続時間の間、電圧および抵抗は時間的に一定であると仮定した。これが当てはまらない場合には下式が適用される。
mMH=pMH・A・l
上式で、Aは、加熱要素(または加熱要素の考慮する部分)の断面積、lは、加熱要素(または加熱要素の考慮する部分)の長さである。次いで、式3および式4を用いて熱量Qを計算することができる。
mAZ=VAHZ・pAHZ=π・l・((r+d)2-r2)・pAHZ
反応体積中の加熱ゾーンの密度は水の密度に等しい(pAHZ≒pH2O≒1g・cm-3)。したがって、(ほぼ)円筒形に形成されており、少なくとも部分的に均質であり、一定の断面を有する加熱要素に対しては、式2、式3、式4、式5を使用して以下の推定を与えることができる。
本発明の好ましい一実施形態では、PCR増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも1回、好ましくは少なくとも3回、特に好ましくは少なくとも10回、特に好ましくは少なくとも20回のパッセージで、加熱手段の平均体積電力密度が109W/m3よりも大きく、好ましくは1010W/m3よりも大きく、特に好ましくは1011W/m3よりも大きい。本発明のこの実施形態の達成可能な利点は、たとえ熱パルスの継続時間が短くても、加熱要素が十分に急速に加熱されることである。
本発明の好ましい一実施形態では、加熱手段および加熱手段の表面のすぐ近傍の反応体積だけが相当に加熱され、したがって局所的な加熱だけが起こるように、加熱手段を流れる電流パルスが選択される。変性ステップ全体の間に運ばれる熱量Qは加熱手段内で局所的に生成される。後に説明するように拡散による放熱は徐々にしか起こらないため、熱量Qは当初、加熱手段自体および加熱手段のすぐ近傍に分布する。このことは、運ばれる熱量Qが、最初は非常に小さな体積にわたって分布し、次いで周囲の反応体積中へ広がる(「流れる」)エネルギー量であることを意味する。この熱量(しばしば単に「熱」とも記述される)がそのまま加熱要素内および加熱要素のすぐ近傍に空間的に集中するとすれば、この熱量はそこで相当な温度上昇を引き起こす。しかしながら、この熱量がますます大きな体積にわたって分布するとすぐに、この熱量はそこでも温度上昇を引き起こすが、最初に運ばれた熱量は当然ながら変わらないため、これに対応してその温度上昇は小さい(反応体積の液体体積だけを考慮した場合、温度は、その熱量が分布する体積に反比例して低下する)。
図1Aは、加熱手段を形成する加熱要素の略図である。加熱要素は電圧源2に接続することができ、電気パルスを発生させる装置3が時間的電流パターン4を変化させる。この図では、電気パルスを発生させる装置3がスイッチであり、示された状態ではスイッチが開いており、そのため時間的/時間ベース関連電流パターン4にパルスは見出せない。加熱要素1はプライマー5によって官能基化されており、プライマー5に対して遊離のターゲット核酸6はハイブリッドを形成することができる。図の右側には、加熱要素内および加熱要素の周囲の温度分布の空間的推移が示されている。スイッチが開いているこの時点では、周囲の液体に対して加熱要素が加熱されておらず、したがって温度プロファイルは平坦である。
図2Aは、異なる時点、すなわち熱パルスの開始から50、100、200、400、800および1600μs後の時点における、加熱線(これはたとえば加熱要素を代表している)内および加熱線の近傍の空間的温度パターンの有限要素法シミュレーションを示す。縦軸には、熱パルス開始前の値に対する温度上昇が記録されている。横軸には、加熱線の円筒軸からの距離が記録されている。このシミュレーションでは、加熱線が、金でできた直径25μmの線であり、それを、水性近傍中において、体積電力密度2・1012W/m3(式
図3Aは、加熱手段に電流を流すために電気パルスを発生させる制御装置としての電気回路の例10を示す。この回路は、アース(GND)とU+の間に(たとえば30から100Vの間の)電圧(本明細書で常に「U」として示される)が供給されるように構築されている。この電圧によって加熱手段は加熱される。R3「負荷」の位置に加熱手段が配置されており、そのためR3が加熱手段の抵抗器である。一例として使用されているパワーMOSFET Q(IRFP4468、International Rectifier)が、接点T2と接点T3の間に、加熱手段R3に電流が流れるような方式の低オーム接続を、スルー接続(connected-through)で形成する。アースとMOSFETのゲート(接点T1)との間に、制御端子FET GND rt/geを介して制御電圧が供給される。この制御電圧は、たとえばパルスもしくは周波数発生器またはデジタル-アナログ変換器によって提供される。MOSFETのクリーン・コネクション(clean conneciton)を可能にする、5V程度の電圧とたとえば10から1000μsの間の継続時間とを有するパルスが特に適している。位置C1には、十分な静電容量、たとえば4mFの静電容量と可能な最も小さいESR値とを有するコンデンサーが提供されている。このコンデンサーは、すべての加熱要素の抵抗の合計が典型的には1Ω(オーム)未満である低オーム加熱手段であっても、熱パルスの継続時間の間、供給電圧が維持されることを可能にする。抵抗器R1、R2、R7およびR9の抵抗値はたとえば1、100、24および24kΩ(キロオーム)である。
図3Dは、線状加熱要素を含む本発明に基づく装置の試料プレートを構成する構成要素を概略的に示す。この図で使用されている加熱要素は、金めっきされた直径25μmの被覆線12(約1μmの金被覆を有する23μmのタングステン心線、LUMA METALL AB(スウェーデン、Kalmar))の部分である。被覆線12は、厚さ0.5mmのアクリル・ガラス・プレート17(中央の明色のプレート)に巻き付けられている。このプレートには7つの開口(6mm×6mm)があり、その中に試料液チャンバ(ウェル)が画定されている。この巻線によって、それぞれの試料液チャンバ内に平行な2つの層ができており、それぞれの層は平行な15本の加熱要素を有する。このプレートがあるため、加熱手段のこれらの2つの層の距離は0.5mmであり、1つの層内の加熱要素の距離は約0.4mmである。両側から、試料液チャンバの受け入れ場所を有する両面接着箔18(黒色で示されている。3Mの厚さ100~250μmのVHB接着テープ)を用いて、等しい複数の開口を有する別のアクリル・ガラス・プレート19(下プレートの厚さは0.5mm、上プレートの厚さは3mmである)を、接着テープ18の製造業者の指示に従ってプレート17に貼り付け、押圧する。下方から、薄箔20(この図では明色の接着PCR箔シール、4titute)でそれぞれのウェルを閉じる。箔20は、底部アクリル・ガラス・プレートに貼り付ける。このようにして、7つのウェルを有する試料プレートを形成する。これを通して平行な線12を引っ張ることができる。線12は、プレートの外側にある2つの端部で互いに接続されており(すなわちすべての線/加熱要素は並列に接続されてり)、電気的に接触している。このようにすると、すべてのウェルに電流パルスを直列で送ることが可能になる。次いで、試料プレートの(ここでは頂部の)開口を薄箔21(明色で示されている)で閉じることができる。試料プレートの幅は20mm、長さは90mmである(そのため、接触目的に必要な端部における線の3mmの張出しを考慮した場合、熱パルスの電圧は実質的に約96mmの長さにわたって降下する)。
図3Eは、図3Dに基づく本発明の例示的な実施形態の反応体積中における大域温度上昇の測定結果を示す。図3Dで説明したとおりに製作した試料プレートのそれぞれのウェルに水100μlを入れる。さらに、温度センサーとしてPT100センサーを中央の1つのウェルに挿入する。3Aの定電流を線に流した場合、水試料中において200sで約47℃の温度上昇が観察された(ハッシュ記号で描かれた曲線)。他方、本発明に従って、継続時間70μsの80Aの電流パルスを3sおきに線に流した場合(供給電圧32V、線の負荷抵抗0.4Ω)、この測定法によって測定された水試料の大域温度上昇は1℃未満でしかなかった(丸で描かれた曲線)。
図4は、ポリメラーゼ連鎖反応の結果を、図3Dに基づく本発明の例示的な実施形態の反応体積中でのゲノム核酸および対照の測定によって示す。図3Dで説明したとおりに製作した試料プレートのウェル内の加熱要素をフォワード・プライマーで官能基化する。官能基化にはフォワード・プライマーID1を使用する。チオールは金表面への結合に役立ち、最初の5つのチミン塩基は、実際のプライマー配列と金表面との間の空間または距離をより大きくし、それによってたとえば可能な立体障害を防ぐためのスペーサ配列の役目を果たす。官能基化の前に、このようにして形成したオリゴヌクレオチドのチオール修飾基の保護基を脱保護する。この脱保護は、このオリゴヌクレオチドを、PBS緩衝液(5mMリン酸緩衝液、10mM NaCl、0.01%Tween20、1mM EDTA、pH7.5)中の濃度0.5μmで15分間、1mM トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィンとともにインキュベートすることによって実施する。続いて、官能基化のためのNaClの最終濃度500mMに到達するためにNaCl(5M)を加える。脱保護されたオリゴヌクレオチドの懸濁液を用いて線を3時間インキュベートした後、結合していない過剰のオリゴヌクレオチドを除去するため、PBS緩衝液を用いた洗浄ステップを2回実施する。このようにして調製されたプレートは増幅反応に使用可能である。
図5Aから5Cは、供給電圧に対するPCR成績の依存性を、本発明の例示的な実施形態の助けを借りて示す。供給電圧は、式
図6Aから6Cは、ハニカム構造の加熱手段の一実施形態を示す。この加熱手段の製作では、光化学的微細エッチング法によってステンレス鋼箔からハニカム構造を製作し、続いてそのハニカム構造を金でコーティングする。この例示的な実施形態のハニカム構造は六角格子だが、当然ながら他の格子も考えられる。電流は、この構造をその全長xxに沿って流れる。図6Aに示されているように、試料チェンバのエリアにだけ、したがって箔が加熱要素を形成しているところにだけ、ハニカム構造をエッチングした。加熱要素の長さfはたとえば8.2mmであり、加熱要素間の距離gはたとえば3.8mmである。加熱要素のできるだけ均一に焼き戻されたエリアだけを使用するために、試料チェンバは、加熱要素の上方の加熱要素の中心に配置されることが好ましく、加熱要素よりも小さな寸法(たとえば6mm×6mm)を有することが好ましい。箔の全長hはたとえば100mmである。すなわち電気的接触は短辺において実施される。そのため、電圧は、約100mmの長さにわたって降下する。ハニカム構造のウェブは、ウェブを流れる電流によって加熱され、ウェブに結合した2本鎖核酸を変性することができる。
図7の例示的な実施形態では、加熱手段の表面に両方のプライマー(フォワード・プライマーおよびリバース・プライマー)がある。この例示的な実施形態の手順は実質的に図4の例示的な実施形態の手順に対応する。しかしながら、加熱手段の官能基化には、フォワード・プライマーID6 1部とリバース・プライマーID7 3部の混合物を使用した(脱保護中のこれらの2つのプライマーの合計濃度は0.5μmである)。これらのプライマーはともにチオール修飾基を担持している。チオール修飾基は、加熱手段の表面での固定化に役立つ。フォワード・プライマーは、スペーサ配列に加えて、スペーサ配列とプライマー配列の間に2つのアベーシック修飾基spacer9を担持している。これは、ポリメラーゼによるスペーサ配列の上書きを防ぐ。リバース・プライマーはすでに加熱要素上に存在しているため、もはや反応体積中に存在する必要はない。これに対応して不足する反応体積の体積は水で置き換えられている。図7の蛍光曲線は、水を含む負の試料(破線)および配列ID5を含む合成核酸ターゲットを出発濃度100fMで含む正の試料(実線)の信号パターンの推移を示す。実際に、この図の蛍光信号は、これまでの例示的な実施形態における信号よりもかなり小さいが、450sのPCR継続時間以降は、この場合も、正の試料の信号が負の試料に比べて増大していることが明らかに分かる。この例示的な実施形態は、両方のプライマーが表面に固定されたPCRプロセス(「ブリッジPCR」。Kawashima他の国際公開第1998/044151A1号パンフレットおよびAdams他の米国特許第5641658号明細書を参照されたい)が本発明に基づく方法で機能することを示している。
2 電圧源
3 電気パルスを発生させる装置
4 時間ベースの電流推移の図解
5 プライマー
6 遊離のターゲット核酸
7 プライマーに結合したターゲット核酸
8 核酸2本鎖
9 伸長したプライマー
10 電気回路
GND 電気回路のアース接続
U+ 電気回路の電圧供給接続
Q1 電気回路のMOSFET
T1 MOSFET Q1のゲート端子
T2 MOSFET Q1のドレイン端子
T3 MOSFET Q1のソース端子
C1 電気回路のコンデンサー
FET GND 電気回路の制御端子
R1 電気回路の抵抗器
R2 電気回路の抵抗器
R3 加熱手段
R7 電気回路の抵抗器
R9 電気回路の抵抗器
11 電圧源
12 線
13 試料プレート
14 温度調節ブロック
15 発光ダイオード
16 フォトダイオード
17 アクリル・ガラス・プレート
18 両面接着フィルム
19 アクリル・ガラス・プレート
20 薄膜(底部)
21 薄膜(頂部)
Claims (12)
- 反応体積中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための装置であって、
反応体積を収容するための反応容器と、
1つまたは複数の加熱要素(1)からなり、前記1つまたは複数の加熱要素(1)が前記1つまたは複数の加熱要素(1)に印加されることになる電気エネルギーを使用して前記反応体積を加熱するために前記反応体積と接触している加熱手段と、
前記電気エネルギーを前記装置に伝達するための手段とを備え、
前記装置の電力消費が前記ポリメラーゼ連鎖反応中のいずれの時点においても20ワットを超えず、前記装置が、PC、タブレット・コンピューターまたはモバイル・フォンのユニバーサル・シリアル・バス接続ポート上で動作可能に構成されている装置。 - 前記加熱要素のうちの少なくとも1つの加熱要素がオリゴヌクレオチド(5)に接合されていることを特徴とする、請求項1に記載の装置。
- 光源(15)および光センサー(16)を備えることを特徴とする、請求項1または2に記載の装置。
- 電気蓄積装置を備えること、および前記電気蓄積装置中の使用可能な状態にある電気エネルギーが前記反応容器の容積に対して0.1J/ml超となるように前記電気蓄積装置が設計されていることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載の装置。
- 電気蓄積装置を備えること、および前記電気蓄積装置中の使用可能な状態にある電気エネルギーが前記反応容器の容積に対して100ジュール/ミリリットル未満になるように前記装置が設計されていることを特徴とする、請求項1~4のいずれか1項に記載の装置。
- 前記1つまたは複数の加熱要素がオーム抵抗によって電流を熱に変換するものであることを特徴とする、請求項1~5のいずれか1項に記載の装置。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも1回のパッセージで、前記ポリメラーゼ連鎖反応において前記加熱手段が前記反応体積を加熱する変性ステップの継続時間が10ミリ秒以下にされていることを特徴とする、請求項1~6のいずれか1項に記載の装置。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも1回のパッセージで、CRを前記加熱手段による前記加熱中の前記反応体積の熱容量として、変性ステップで生成されたCR×5℃よりも少ない熱を前記加熱手段が前記反応体積に供給するように構成されていることを特徴とする、請求項1~7のいずれか1項に記載の装置。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも1回のパッセージで、変性ステップ中に起こる前記反応体積の平均温度の最大上昇が10℃未満であることを特徴とする、請求項1~8のいずれか1項に記載の装置。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも1回のパッセージで、前記反応体積と接触している前記加熱手段のエリアの温度が、70℃以上250℃以下であることを特徴とする、請求項1~9のいずれか1項に記載の装置。
- 前記装置の電力消費が前記ポリメラーゼ連鎖反応中のいずれの時点においても2.5ワットを超えないように構成されていることを特徴とする、請求項1~10のいずれか1項に記載の装置。
- USBスティックであることを特徴とする、請求項1~11のいずれか1項に記載の装置。
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