CN109852636A - 一种西瓜雌性株的获得方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子育种领域领域，提供了一种西瓜雌性株的获得方法，所述方法包括在Gy基因上选择靶点，然后根据选择的靶点和载体设计引物，将引物和载体连接后用于转化西瓜组织，从而获得西瓜雌性株的操作。本发明还提供了一种利用西瓜雌性株的获得方法获得的西瓜雌性材料在西瓜转育方面的应用。本发明提供的西瓜雌性株的获得方法可以高效快速地获得西瓜雌性株，整个方法省时省工，可以大大提高西瓜优良品种的育种效率，降低育种成本。

Description

一种西瓜雌性株的获得方法及应用
技术领域
本发明属于分子育种领域，特别涉及一种利用CRISPR/Cas9技术在西瓜中敲除目的基因，从而获得西瓜雌性株的方法。
背景技术
西瓜(Citrullus lanatus)为葫芦科中重要经济作物，是世界十大水果性蔬菜。我国是目前世界上西瓜栽培面积最大、产量最高的国家，产销量约占世界总产销量的一半。在西瓜育种工作中如何降低制种成本、提高种子纯度是西瓜育种工作的关键。西瓜花可分为雌花及雄花，还有两性花，而各种花在西瓜茎上的着生方式称为西瓜的性型。西瓜的主要性型是雌雄异花同株，因此在西瓜杂交育种工作中需要对雌花进行先期套帽，人工授粉，再套帽防止混杂本株或其他株的花粉，十分费时费工。在西瓜育种中大规模的雌性系或诱导全雌株的应用可以大大降低杂交育种中的人工成本、提高种子纯度。而西瓜雌性系是一种罕见的性型，且西瓜对外源激素处理不敏感，不能诱导雌雄异花同株材料全开雌花，因此研究西瓜雌性株产生的机理，人为创制新型的雌性系材料对西瓜性别分化的理论研究及西瓜育种工作具有重大的理论和实践意义。
传统的西瓜育种是对自然界现有变异选育优良品种，而且还要根据需要继续品种间的杂交、回交等工作来获得优良性状，而随着现代生物技术的进步，CRISPR/Cas9基因编辑技术的成熟及广泛应用可以针对目的基因进行简便高效的基因精确编辑，为培育新品种带来了更多的可能性。CRISPR/Cas9可以在不引入外源基因的情况下对基因进行准确编辑，其中2016年4月，一种利用CRISPR/Cas9技术编辑的不会褐变的蘑菇，成为了美国第一个被批准上市的基因编辑农产品。然而，目前并没有一种利用CRISPR/Cas9技术实现在各个西瓜品种中创制雌性株的有效方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明基于西瓜雌性系基因的定位结果，利用CRISPR/Cas9技术及西瓜高效率转化技术提供了一种西瓜雌性株的获得方法，以实现在各个西瓜品种中创制雌性株。
一种西瓜雌性株的获得方法，所述方法包括在Gy基因上选择靶点，然后根据选择的靶点和载体设计引物，将引物和载体连接后用于转化西瓜组织，从而获得西瓜雌性株的操作。
作为优选的实施方式，所述靶点的序列组成为5’-GCTGCATGGCCATGTCCAANGG-3’。
作为优选的实施方式，所述载体为PBSE401载体，所述引物包括正向引物和反向引物，所述引物的序列组成如下：
正向引物：5’-ATTGGCTGCATGGCCATGTCCAA-3’；
反向引物：5’-AAACTTGGACATGGCCATGCAGC-3’。
作为优选的实施方式，所述将引物和载体连接的操作包括将所述正向引物和反向引物退火形成两头有Bsa I黏性末端的双链DNA片段，然后将所述双链DNA片段与PBSE401载体连接，获得双链DNA片段和PBSE401的酶切-连接产物。
作为优选的实施方式，所述方法还包括将所述酶切-连接产物进行扩增的操作。
作为优选的实施方式，所述扩增的操作为将所述酶切-连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，从而利用大肠杆菌进行扩增。
作为优选的实施方式，所述将引物和载体连接后用于转化西瓜组织的操作使用农杆菌进行；优选地，将通过大肠杆菌扩增后的酶切-连接产物使用农杆菌转化西瓜组织。
作为优选的实施方式，所述方法还包括对获得的西瓜雌性株的Gy基因序列进行翻译分析鉴定的操作；优选地，所述翻译分析鉴定的操作包括根据测得的西瓜阳性株的Gy基因序列碱基组成，按照翻译密码子推出Gy基因相应的蛋白质氨基酸序列组成，然后与西瓜Gy蛋白序列进行比对，如果存在差异，说明西瓜阳性株的Gy序列确实发生了有意突变，产生了雌性株。
本发明还提供西瓜雌性株的获得方法获得的西瓜雌性材料在西瓜转育方面的应用。
作为优选的实施方式，所述应用包括以雌性系P1为母本，以雌雄异花同株P2为父本，配制F1代杂交组合；再以父本作为轮回亲本进行回交，获得BC1F1代分离群体；对BC1F1代分离群体，选取基因型为Gygy的单株继续回交，获得回交分离群体BC2F1；对BC2F1代分离群体，选取基因型为Gygy的单株继续回交n代，获得BCnF1代回交分离群体；对BCnF1代回交分离群体，选取基因型为Gygy的单株自交，获得纯合gygy雌性株系；其中，所述n为3-8的整数，优选为4。
本发明相比现有技术具有如下有益效果：
1、本发明提供的西瓜雌性株的获得方法可以高效快速地获得西瓜雌性株，整个方法省时省工，可以大大提高西瓜优良品种的育种效率，降低育种成本。
2、本发明采用的操作步骤、各个参数之间密切配合，协同作用，共同进一步提高了西瓜的育种效率。
本发明的其他特征和优点将在如下的具体实施方式部分详细描述。
附图说明
图1示出了两种西瓜性别表型，其中左侧的“对照”为雌雄异花同株植株，右侧三个为雌性株。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施方式作进一步地详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明的第一个方面提供了一种西瓜雌性株的获得方法，该方法包括在Gy基因(序列表中的序列1)上选择靶点，然后根据选择的靶点和载体设计引物，将引物和载体连接后用于转化西瓜组织，从而获得西瓜雌性株的操作。
根据本发明的第一个方面，所述靶点的序列组成可以为5’-GCTGCATGGCCATGTCCAANGG-3’(序列3)；该序列中，5’-端开始的19个碱基为Gy基因2756-2775bp处的反义链上的序列(即选中的靶点，下划线部分所示)，最后三个碱基“NGG”为识别对位点，其中“N”代表A、T、C、G中的任意一个碱基。
根据本发明的第一个方面，所述载体可以为PBSE401载体，所述引物包括正向引物和反向引物，所述引物的序列组成如下：
正向引物：5’-ATTGGCTGCATGGCCATGTCCAA-3’(序列4)。
反向引物：5’-AAACTTGGACATGGCCATGCAGC-3’(序列5)。
其中，上述正向引物中，5’-端开始的前四个碱基“ATTG”为引物接头序列，其他的下划线部分为选中的靶点序列；反向引物中，5’-端开始的前四个碱基“AAAC”为引物接头序列，其他的下划线部分为选中的靶点序列的反向互补序列。
根据本发明的第一个方面，所述将引物和载体连接的操作包括将所述正向引物和反向引物退火形成两头有Bsa I黏性末端的双链DNA片段，然后将所述双链DNA片段与PBSE401载体连接，获得双链DNA片段和PBSE401的酶切-连接产物。
根据本发明的第一个方面，所述方法还包括将所述酶切-连接产物进行扩增的操作。所述扩增的操作例如可以为将所述酶切-连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，从而利用大肠杆菌进行扩增。
根据本发明的第一个方面，所述将引物和载体连接后用于转化西瓜组织的操作可以使用农杆菌进行。优选地，可以将通过大肠杆菌扩增后的酶切-连接产物(即质粒)使用农杆菌转化西瓜组织。
根据本发明的第一个方面，所述方法还包括对获得的西瓜雌性株进行鉴定的操作。所述对获得的西瓜雌性株进行鉴定的操作可以包括用BASTA抗性试纸条检测，提取经鉴定为阳性株的基因组DNA，利用如下引物扩增出Gy基因：
上游引物：5’-ATGACTGATCCTTACCCCATC-3’(序列6)；
下游引物：5’-TCATGTTTCAATCTCAGAAGCTG-3’(序列7)；
将扩增出来的Gy基因片段测序，并与西瓜Gy基因序列(序列1)进行比对，如果在靶点处出现差异，则该西瓜雌性株为阳性株。
根据本发明的第一个方面，所述方法还包括对获得的西瓜雌性株的Gy基因序列进行翻译分析鉴定的操作。所述翻译分析鉴定的操作可以包括根据测得的西瓜阳性株的Gy基因序列碱基组成，按照翻译密码子推出Gy基因相应的蛋白质氨基酸序列组成，然后与西瓜Gy蛋白序列进行比对，如果存在差异，说明西瓜阳性株的Gy序列确实发生了有意突变，产生了雌性株。
本发明的第二个方面还提供了根据本发明的第一个方面提供的西瓜雌性株的获得方法获得的西瓜雌性材料在西瓜转育方面的应用。
根据本发明的第二个方面，所述应用包括以雌性系P1为母本，以雌雄异花同株P2为父本，配制F1代杂交组合；再以父本作为轮回亲本进行回交，获得BC1F1代分离群体；对BC1F1代分离群体，选取基因型为Gygy的单株继续回交，获得回交分离群体BC2F1；对BC2F1代分离群体，选取基因型为Gygy的单株继续回交n代，获得BCnF1代回交分离群体。对BCnF1代回交分离群体，选取基因型为Gygy的单株自交，获得纯合gygy雌性株系。其中，所述n为3-8的整数，优选为4。
下面以具体的实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中的各个供试材料均为北京市农林科学院蔬菜研究中心种质资源库保存的种质资源材料，公众均可以从该处获取相关材料。
实施例1
本实施例用来说明如何通过CRISPR/Cas9敲除西瓜Gy基因获得西瓜雌性株。
本发明涉及的西瓜雌性基因为Gy基因，隐形纯合体(gygy基因型)表现为雌性株。
一、CRISPR/Cas9载体构建
西瓜品种“ZZJM”由本课题组选育并保存、“PI296341-FR”由本课题组引进并保存。
用于双子叶植物的CRISPR/Cas9双元载体(PBSE401)由中国农业大学生物学院陈其军教授惠赠。
大肠杆菌(Escherichia coli.,E.coli)菌株DH5α购自全式金公司。
根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105购自上海昂羽生物技术有限公司。
靶点设计遵循以下原则：(1)尽量靠近起始密码子；(2)靶点特异性足够高；(3)GC含量在40％以上；(4)PAM(protospacer adjacent motif前间区序列邻近基序)区前三个碱基处最好在酶切位点内，方便检测打靶效果。可以参考利用靶点设计网站(如http:// www.crisprscan.org/)选择打分较高的靶点。
载体构建方法参考中国农大陈其军老师文章(Xing HL,Dong L,Wang ZP,ZhangHY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ(2014)ACRISPR/Cas9toolkit for multiplex genomeediting in plants.BMC Plant Biol 14:327)进行。
具体地，载体构建按照如下方法进行：
(1)选取的靶点为在Gy基因(序列表中的序列1)2756-2775bp处的反义链上的序列：5’-GCTGCATGGCCATGTCCAAAGG-3’；该序列中，5’-端开始的19个碱基为选中的靶点序列(下划线部分所示)，最后三个碱基“AGG”为识别对位点。
(2)根据步骤(1)选取的靶点，结合使用的载体(PBSE401)对引物接头的设计要求，设计引物，引物的序列组成如下：
正向引物：5’-ATTGGCTGCATGGCCATGTCCAA-3’(序列4)。
反向引物：5’-AAACTTGGACATGGCCATGCAGC-3’(序列5)。
其中，上述正向引物中，5’-端开始的前四个碱基“ATTG”为引物接头序列，其他的下划线部分为选中的靶点序列；反向引物中，5’-端开始的前四个碱基“AAAC”为引物接头序列，其他的下划线部分为选中的靶点序列的反向互补序列。
将浓度均为100μmol/L的等体积的上述正向引物与反向引物混合均匀，95℃孵育10分钟，自然冷却至室温，使两条单链引物(正向引物和反向引物)退火成两头有Bsa I黏性末端的双链DNA。
(3)将载体PBSE401用Bsa I酶切并与步骤(2)中由正向引物和反向引物退火形成的两头有Bsa I黏性末端的双链DNA片段连接。酶切-连接体系如表1所示。
表1酶切-连接体系和反应条件
(4)将步骤(3)的酶切-连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。然后用Kan板筛选转化的大肠杆菌感受态细胞，将长出的阳性大肠杆菌克隆用PBSE401载体的引物对U6-26p-F及U6-26p-R，进行PCR扩增。其中，U6-26p-F的序列组成为：5’-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3’；U6-26t-R的序列组成为：5’-CCCCAGAAATTGAACGCCGAAGAAC-3’。
PCR扩增的反应体系(13μL)为：
1.3μL含15mM MgCl2的10×EasyTaq PCR Buffer；0.8μL浓度为2.5mM的dNTPs；0.4U PCR Taq DNA聚合酶；0.5μL 10mM的上游引物(U6-26p-F)，0.5μL 10mM的下游引物(U6-26p-R)；模板DNA；ddH2O补足到13μL。
其中，模板DNA为1.0μL的OD值为0.8(OD值至少为0.8，一般为0.8-1.0)的阳性大肠杆菌菌液；Taq DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。
PCR扩增的反应程序为：
阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃15s，55℃20s，72℃20s，共34个循环；阶段3：72℃延伸4min；阶段4：4℃保存。
其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler。
将PCR产物送北京诺赛基因公司测序，若测序结果发现上述19个碱基的靶点序列已经构建到载体PBSE401上，即可进行后续操作。
(5)将步骤(4)获得的测序正确的(即，含有上述19个碱基的靶点序列的载体PBSE401)阳性大肠杆菌提质粒，将质粒转化农杆菌EHA105。然后用Kan板筛选并按照步骤4的方法进行PCR鉴定(本步骤中的模板DNA为1.0μL的OD值为0.8(OD值至少为0.8，一般为0.8-1.0)的阳性农杆菌EHA105菌液)，经鉴定能扩增出目的片段(目的片段为具有上述19个碱基的靶点序列的载体PBSE401)的克隆即为阳性农杆菌EHA105克隆，将阳性农杆菌EHA105克隆用于后续的西瓜转化。
二、农杆菌介导的西瓜子叶转化
(1)将西瓜种子小心剥去种皮(尽量避免伤及种仁)，用质量百分比浓度为3％的次氯酸钠溶液消毒15min，清洗3次后接入MS培养基，28℃暗培养3天，使得西瓜种子萌动。
(2)切取健康萌动的西瓜种子种仁，自子叶近轴端，切成1.5mm×1.5mm的外植体(要求刀片锋利，切口完整)，将外植体及时接入盛有10mL的MS液体培养基的9cm培养皿中，然后加入OD600在0.8-1.0的经鉴定为阳性的农杆菌EHA105克隆的菌液50μL，混匀，浸泡10min后，滤干菌液，将外植体转入共培养基中，28℃共培养4天，获得共培养后的外植体。
其中，共培养培养基为由MS固体培养基和6-BA组成的无菌培养基，pH为5.8，6-BA在共培养培养基中的浓度为1.5mg/L。
(3)将共培养后的外植体于筛选培养基上培养，每个平板上放25个左右的外植体。每周更换一次培养基，约4周后，可观察到阳性幼芽从子叶块边缘长出，即得到含有绿色幼芽的植物组织。
其中，筛选培养基为由MS固体培养基与6-BA、特美汀(Timentin，购自北京酷来搏科技有限公司)和草铵膦(BASTA，购自西格玛奥德里奇中国公司)组成的无菌培养基，pH为5.8，6-BA、特美汀和草铵膦在筛选培养基中的浓度分别为1.5mg/L、100mg/L和2mg/L。
(4)将步骤(3)中生长良好的绿色幼芽转入芽伸长培养基，培养4-6周，使得幼芽生长成为幼苗(即，具有完整地上部分的植株，包含茎、叶及顶端生长点)。
其中，芽伸长培养基为由MS固体培养基与6-BA、NAA、特美汀和草铵膦组成的无菌培养基，pH为5.8，6-BA、NAA、特美汀和草铵膦在芽伸长培养基中的浓度分别为0.1mg/L、0.01mg/L、100mg/L和2mg/L。
(5)将步骤(4)得到的幼苗置于生根培养基中进行培养，每瓶2个幼苗，至幼苗生根长成完整的生根植株(即，西瓜植株)。
其中，生根培养基为由MS固体培养基与IBA和特美汀组成的无菌培养基，pH为5.8，IBA和特美汀在生根培养基中的浓度分别为1mg/L和100mg/L。
(6)将步骤(5)得到的生根植株移栽至苗钵，放入培养箱驯化培养。驯化培养条件为：温度26℃、16小时光照，温度24℃、8小时黑暗。
在驯化培养过程中进行阳性株的鉴定，一周后将鉴定为阳性的植株(T0代植株)定植到田间。
阳性株的鉴定方法如下：
将T0代植株进行编号，然后用BASTA(草铵膦)抗性试纸条测试(根据制造商的说明来进行，检测BASTA表达的试纸条为购自北京奥创金标生物技术有限公司生产的转基因BAR快速检测试条)，以产生目标阳性线为标准选择阳性株。
从经BASTA试纸条检测为阳性株的叶片中提取基因组DNA，利用如下引物对进行PCR扩增，以扩增出Gy基因：
上游引物：5’-ATGACTGATCCTTACCCCATC-3’(序列6)
下游引物：5’-TCATGTTTCAATCTCAGAAGCTG-3’(序列7)。
将扩增出来的Gy基因片段送样测序，以确认基因的变化情况。
上述上游引物和下游引物由上海生工公司北京合成部合成。
PCR扩增的反应体系(13μL)为：
1.3μL含15mM MgCl2的10×EasyTaq PCR Buffer；0.8μL浓度为2.5mM的dNTPs；0.4U PCR Taq DNA聚合酶；0.5μL 10mM的上游引物，0.5μL 10mM的下游引物；20ng模板DNA；ddH2O补足到13μL。
其中，Taq DNA聚合酶、反应缓冲液及dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司。
PCR扩增的反应程序为：
阶段1：94℃预变性5min；阶段2：94℃15s，55℃20s，72℃2min，共34个循环；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保存。
其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well Thermal Cycler。
将PCR产物送北京诺赛基因公司测序，分析PCR产物的碱基序列与Gy目的基因序列的差异，若在上述19个碱基的靶点序列处出现差异，则认为该植株为成功编辑的西瓜雌性株阳性株(即，西瓜Gy基因被敲除的雌性系植株)。
按照如下方法从西瓜阳性株叶片中提取基因组DNA：
参照Murray等(1980)的方法并稍加改进，具体步骤如下：
(1)取0.3-0.5g幼嫩叶片于1.5mL离心管中，每管加300μL CTAB，放入2粒钢珠，用Retch仪进行打碎。
(2)每管再加入300μL的CTAB，混匀后65℃水浴60min，每隔10min颠倒混匀一次。
(3)水浴后置于室温冷却10min，加入300μL氯仿：异戊醇(氯仿和异戊醇的体积比为24:1)，充分混匀，4500rpm离心15min。
(4)取400μL上清液，加入预先加好的400μL预冷的异丙醇中(于96孔深孔板)，轻轻混匀，-20℃放置30min。
(5)于4500rpm离心30min，弃上清，用70％(体积百分比)的乙醇洗沉淀2-3次，室温下风干至无乙醇味，加适量ddH2O溶解DNA，得到西瓜阳性株基因组DNA。
(6)用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD260值测定步骤(5)获得的西瓜阳性株基因组DNA的浓度，再用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测西瓜阳性株基因组DNA的提取质量。
三、西瓜雌性株中突变的Gy基因性质鉴定
为了验证突变后的Gy序列发生了哪种突变，例如是导致蛋白翻译提前终止，还是引起了个别位点的错义突变，从而进一步确定是否产生了雌性株，对测得的西瓜阳性株的Gy基因序列进行翻译分析鉴定。具体地，按照DNAstar软件的要求，将DNA序列从启动子ATG开始输入Edit sequence中，点击translate DNA，得到相应的蛋白序列。然后将翻译分析获得的氨基酸序列与西瓜Gy蛋白氨基酸序列(如序列2所示)进行比对，如果存在差异，说明西瓜阳性株的Gy基因确实发生了有意突变，产生了雌性株。
四、西瓜雌性株的表型观察
将获得的成功编辑的西瓜雌性株阳性株种植于温室中，观察花型变化。结果发现，从西瓜开花的第1节位开始直至第20节全为雌花，说明这些植株的性型均为雌性株。
实施例2
本实施例用来说明通过测定Gy基因序列来检测西瓜性型的验证
一、供试材料选取
供试材料包括：F2代分离群体，雌性系母本TGS409，父本乙选，二者杂交获取的F1代，自交获得的F2代。
以上F2代分离群体于2016年春在北京培育、采种，于2016年8月在大棚中催芽直播，定植于北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青试验基地，其中父本、母本、F1代各定植20株，F2代定植134株。
二、供试材料性型调查
从开花的第1节位开始调查植株性型，直至第20节。若全为雌花，记录该株的性型为雌性株(更高节位的雌花中可能会出现畸形的雄蕊，部分花粉可育，可用于授粉)；出现正常雄花的记录为雌雄异花同株。如图1所示，其中左侧的“对照”为雌雄异花同株植株，右侧三个为雌性株。
三、供试材料Gy基因序列分析
利用实施例1的方法提取F2代分离群体中每株的DNA，利用引物对(序列6和序列7组成的引物对)检测Gy基因型，具体操作方法参见实施例1。另一方面，与供试材料的性型观察鉴定结果进行比较，统计Gy基因型结果与性型观察鉴定的表型结果的吻合度。
结果显示，供试F2代分离群体的134个单株中，GyGy及Gygy基因型均表现为正常的雌雄异花同株，而gygy基因型表现为雌性株，分型结果与田间性型鉴定结果一致，吻合率达到100％。
实施例3
本实施例用来说明西瓜雌性材料在西瓜转育方面的应用
以雌性系TG409为母本(P1)，以雌雄异花同株JX2为父本(P2)，配制F1代杂交组合。再以父本JX2(P2)作为轮回亲本进行回交，获得BC1F1代群体。对BC1F1代分离群体，利用实施例2的方法进行分子标记基因型检测，选取基因型为Gygy的单株继续回交，获得回交分离群体BC2F1。对BC2F1代分离群体，继续利用实施例2的方法进行分子标记基因型检测，选取基因型为Gygy的单株继续回交，获得回交分离群体BC3F1。对BC3F1代分离群体，继续利用实施例2的方法进行分子标记基因型检测，选取基因型为Gygy的单株继续回交，获得回交分离群体BC4F1。对于BC4F1代分离群体，继续利用实施例2的方法进行分子标记基因型检测，选取基因型为Gygy的单株自交，获得纯合gygy雌性株系。
在转育过程中，随着回交代数的增加果实品质和外观性状逐渐趋近于转育的轮回亲本。转育至BC4代果实品质和外观性状非常接近转育的轮回亲本，进一步将BC4进行了自交，通过分子标记对Gy基因的筛选，培育出符合目标性状、性型表现为雌性株的稳定自交系，显著提高了育种效率。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (10)

1.一种西瓜雌性株的获得方法，所述方法包括在Gy基因上选择靶点，然后根据选择的靶点和载体设计引物，将引物和载体连接后用于转化西瓜组织，从而获得西瓜雌性株的操作。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述靶点的序列组成为5’-GCTGCATGGCCATGTCCAANGG-3’。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述载体为PBSE401载体，所述引物包括正向引物和反向引物，所述引物的序列组成如下：
正向引物：5’-ATTGGCTGCATGGCCATGTCCAA-3’；
反向引物：5’-AAACTTGGACATGGCCATGCAGC-3’。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述将引物和载体连接的操作包括将所述正向引物和反向引物退火形成两头有Bsa I黏性末端的双链DNA片段，然后将所述双链DNA片段与PBSE401载体连接，获得双链DNA片段和PBSE401的酶切-连接产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括将所述酶切-连接产物进行扩增的操作。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述扩增的操作为将所述酶切-连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，从而利用大肠杆菌进行扩增。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述将引物和载体连接后用于转化西瓜组织的操作使用农杆菌进行；
优选地，将通过大肠杆菌扩增后的酶切-连接产物使用农杆菌转化西瓜组织。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述方法还包括对获得的西瓜雌性株的Gy基因序列进行翻译分析鉴定的操作；
优选地，所述翻译分析鉴定的操作包括根据测得的西瓜阳性株的Gy基因序列碱基组成，按照翻译密码子推出Gy基因相应的蛋白质氨基酸序列组成，然后与西瓜Gy蛋白序列进行比对，如果存在差异，说明西瓜阳性株的Gy序列确实发生了有意突变，产生了雌性株。
9.权利要求1-8中任一项所述的西瓜雌性株的获得方法获得的西瓜雌性材料在西瓜转育方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述应用包括以雌性系P1为母本，以雌雄异花同株P2为父本，配制F1代杂交组合；再以父本作为轮回亲本进行回交，获得BC1F1代分离群体；对BC1F1代分离群体，选取基因型为Gygy的单株继续回交，获得回交分离群体BC2F1；对BC2F1代分离群体，选取基因型为Gygy的单株继续回交n代，获得BCnF1代回交分离群体；对BCnF1代回交分离群体，选取基因型为Gygy的单株自交，获得纯合gygy雌性株系；
其中，所述n为3-8的整数，优选为4。
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