CN109837214A - 基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片及其制备 - Google Patents
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Abstract
一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片及其制备，所述微流控芯片主要由顶层通道芯片、硝酸纤维素膜、底层支撑芯片组成。顶层芯片包含流体通道，培养基通过流体通道为细胞提供营养物质交换和细胞代谢废物运输，中层为硝酸纤维素膜，纤维素膜可经过胶原或蛋白修饰，为细胞生长提供基质，下层为无结构的支撑层，为硝酸纤维素膜提供支撑。本发明首次将硝酸纤维素膜集成到灌流芯片中，更符合体内真实环境，并且制作简便，体积小，能够显著降低细胞和试剂消耗量。
Description
技术领域
本发明主要涉及微流控芯片技术领域，特别提供了一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片及其制备方法。
背景技术
微流控芯片实验室作为本世纪一项重要的科学技术已经在包括化学、生物学、医学等多个领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、传热传质快、通量高可以集成等特点而成为新一代细胞研究的重要平台，随着近二十年的发展，基于微流控芯片系统的细胞研究已经有所突破，而其中一个重大研究方向就是器官芯片，器官芯片是采用微流控技术，把人体不同器官的细胞在芯片上构建人体组织，模拟人体环境。由于能够极高程度地模拟真正的人体，器官芯片可用于药物测试，帮助人们更好地了解和处理疾病，如果药物研发机构直接使用“器官芯片”进行测试就可以省去动物实验步骤，节省大量的时间和金钱，还避免了许多动物保护方面的道德问题。器官芯片已经被证明非常适合细胞的生长和分化。另外芯片内的三维微环境比传统的平面培养更符合人体内的情况，所以在具有很大的应用前景。
硝酸纤维素膜是一种商业化的微孔滤膜，对蛋白质等大分子具有很强的特异性吸附能力，常用于分子杂交、免疫印迹等实验中，但是目前也有一些研究使用其作为细胞培养支持介质，有文献报道硝酸纤维素膜可用于多种细胞如大肠癌LOVO细胞、SW480细胞、SW1116细胞，肝癌Hepg2细胞，胃癌BGC-823细胞，胰腺癌Panc-1细胞等细胞的培养，在这些研究中硝酸纤维素膜显示出具有良好的湿态强度，理化稳定性，和良好的细胞相容性。另外，膜表面为海绵状微观表面，有利于细胞黏附、生长和增殖，所以硝酸纤维素膜在细胞培养领域的应用潜力巨大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片及其制备方法。
一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，该微流控芯片主要由顶层通道层、硝酸纤维素膜夹层、底层无结构层组成；所述硝酸纤维素膜夹层以PDMS胶水封在顶层通道层和底层无结构层之间，所述顶层通道层由入口、通道、细胞培养室、出口组成，所述细胞培养室通过通道与入口和出口连接。
所述硝酸纤维素膜夹层的硝酸纤维素膜孔径为0.4-8um。
所述的微流控芯片设有一个或多个入口和一个或多个出口，在入口可以通入流体培养基，为细胞的生长提供流体环境和良好的物质交换，废弃培养基从出口流出。
一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片的制备方法，按照以下步骤制备：
(1)采用软刻蚀技术制作，先以SU8光刻胶制作通道模板，再使用混合好的PDMS(PDMS：引发剂＝5-15:1)倒模得到顶层通道层，
(2)底层无结构层采用无结构的模板再使用混合好的PDMS(PDMS：引发剂＝5-15:1)倒模；
(3)将中间的硝酸纤维素膜通过PDMS胶水封在在顶层通道层和底层无结构层之间，然后用PDMS胶水将芯片外侧封严。
本发明中使用的微流控芯片采用软刻蚀技术制作，先以SU8光刻胶制作模板，再使用PDMS倒模，硝酸纤维素膜以PDMS胶水封在两层PDMS之间后，将芯片置于80℃烘箱使PDMS胶水固化。其中硝酸纤维素膜作为细胞生长基底，具有良好的湿态强度，理化稳定性，且具有良好的细胞相容性。
本发明中使用的微流控芯片有一进液口和一出液口，在进液口可以通入流体培养基，为细胞的生长提供流体环境和良好的物质交换使用之前使用紫外光照射消毒、臭氧消毒。并用一型胶原溶液或其他蛋白对通道进行修饰。之后接种细胞时，可将细胞从培养器皿消化下来，密度调整至1～5×106cells/ml，接种入芯片，并移入恒温培养箱中放置4～5h，细胞贴附后，从通道入口灌入培养基，流速控制在100-1000μl/h，可观察到细胞在芯片中生长良好。
本发明采用硝酸纤维素膜为细胞提供三维环境，可有效促进细胞的贴附和生长，并且培养过程中通入流体，可以提供良好的物质交换和流体剪切力刺激，所以本芯片能够为细胞生长提供一个良好的生存环境，并用于建立体外生理疾病模型。
本发明与现有技术相比的优点是提供一种成本低廉、制作简单的微流控芯片，本芯片采用硝酸纤维素膜为细胞提供三维环境，可有效促进细胞的贴附和生长，并且培养过程中通入流体，可以提供良好的物质交换和流体剪切力刺激，所以本模型能够在大大降低细胞和培养基消耗的情况下提供与在体组织类似的微环境，使细胞的生长更接近体内三维生长模式。
附图说明
图1是基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片的三个组成部分；
图2是细胞在是基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片中生长示意图；
图3是硝酸纤维素膜的扫描电镜图；
图4芯片上层设计单种细胞培养的芯片结构图；
图5是芯片上层设计两种细胞培养的芯片结构图。
图6是芯片上层设计多种细胞芯片结构图。
其中：1.顶层通道层 2.硝酸纤维素膜夹层 3.底层无结构层 4.细胞培养室 5.细胞 6.入口 7.通道 8.出口。
具体实施方式
实施例1
一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，如图1、图2、图4所示，该微流控芯片主要由顶层通道层1、硝酸纤维素膜夹层2、底层无结构层3组成；所述硝酸纤维素膜夹层2以PDMS胶水封在顶层通道层1和底层无结构层3之间，所述顶层通道层由入口6、通道7、细胞培养室4、出口8组成，所述细胞培养室通过通道与入口和出口连接。
所述硝酸纤维素膜夹层的硝酸纤维素膜孔径为0.4-8um。
所述的微流控芯片设有一个或多个入口和一个或多个出口，在入口可以通入流体培养基，为细胞的生长提供流体环境和良好的物质交换，废弃培养基从出口流出。
一种述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片的制备方法，按照以下步骤制备：在电脑上用AutoCAD软件进行绘制掩膜，然后利用软刻蚀技术制作模板。使用PDMS(PDMS：引发剂＝10)倒模，得到图1所示的上层和下层芯片，将硝酸纤维素膜用PDMS胶水固定在通道层和无结构的底层中间，置于80℃烘箱一小时使PDMS胶水固化。
该芯片可用于单种细胞一腔室培养，亦可用于单种细胞多腔室平行培养，如图4。制作好的芯片置于紫外光和臭氧环境下消毒5-6h，用80ug/ml的一型胶原修饰后接种细胞，细胞密度为1x106个/毫升。在细胞培养箱静置3-4h至细胞充分贴壁后，使用注射泵和导管连接芯片，连续通入流体培养基，为细胞提供营养和流体剪切力。图2为细胞在是基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片中生长示意图。图3为硝酸纤维素膜在扫描电镜下的微结构图。
实施例2
一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，如图1、图2、图5所示，该微流控芯片主要由顶层通道层1、硝酸纤维素膜夹层2、底层无结构层3组成；所述硝酸纤维素膜夹层2以PDMS胶水封在顶层通道层1和底层无结构层3之间，所述顶层通道层由入口6、通道7、细胞培养室4、出口8组成，所述细胞培养室通过通道与入口和出口连接。
所述硝酸纤维素膜夹层的硝酸纤维素膜孔径为0.4-8um。
所述的微流控芯片设有一个或多个入口和一个或多个出口，在入口可以通入流体培养基，为细胞的生长提供流体环境和良好的物质交换，废弃培养基从出口流出。
一种述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片的制备方法，按照以下步骤制备：在电脑上用AutoCAD软件进行绘制掩膜，然后利用软刻蚀技术制作模板。使用PDMS(PDMS：引发剂＝15:1)倒模，得到图1所示的上层和下层芯片，将硝酸纤维素膜用PDMS胶水固定在通道层和无结构的底层中间，置于80℃烘箱一小时使PDMS胶水固化。
该芯片亦可用于两种细胞共培养以观测细胞之间的相互作用。
实施例3
一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，如图1、图2、图6所示，该微流控芯片主要由顶层通道层1、硝酸纤维素膜夹层2、底层无结构层3组成；所述硝酸纤维素膜夹层2以PDMS胶水封在顶层通道层1和底层无结构层3之间，所述顶层通道层由入口6、通道7、细胞培养室4、出口8组成，所述细胞培养室通过通道与入口和出口连接。
所述硝酸纤维素膜夹层的硝酸纤维素膜孔径为0.4-8um。
所述的微流控芯片设有一个或多个入口和一个或多个出口，在入口可以通入流体培养基，为细胞的生长提供流体环境和良好的物质交换，废弃培养基从出口流出。
一种述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片的制备方法，按照以下步骤制备：在电脑上用AutoCAD软件进行绘制掩膜，然后利用软刻蚀技术制作模板。使用PDMS(PDMS：引发剂＝5:1)倒模，得到图1所示的上层和下层芯片，将硝酸纤维素膜用PDMS胶水固定在通道层和无结构的底层中间，置于80℃烘箱一小时使PDMS胶水固化。
该芯片还可用于多种细胞共培养以观测药物的代谢动力学或建立多器官模型，如图6。
Claims (7)
1.一种基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，其特征在于：该微流控芯片主要由顶层通道层、硝酸纤维素膜夹层、底层无结构层组成；所述硝酸纤维素膜夹层以PDMS胶水封在顶层通道层和底层无结构层之间。
2.按照权利要求1所述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，其特征在于：所述顶层通道层由入口、通道、细胞培养室、出口组成，所述细胞培养室通过通道与入口和出口连接。
3.按照权利要求1所述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，其特征在于：所述硝酸纤维素膜夹层的硝酸纤维素膜孔径为0.4-8um。
4.按照权利要求1所述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，其特征在于：所述的微流控芯片设有一个或多个入口和一个或多个出口，在入口可以通入流体培养基，为细胞的生长提供流体环境和良好的物质交换，废弃培养基从出口流出。
5.按照权利要求1所述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片在使用前需要经过无菌处理，无菌处理技术包括紫外光照射消毒、臭氧消毒，消毒处理时长不小于3小时。
6.按照权利要求4所述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片，其特征在于：所述的微流控芯片的表面可用一型胶原或其他蛋白修饰，方法为芯片使用前将适当浓度的一型胶原或其他蛋白溶液通入通道中，37℃孵育一小时，然后通入培养基替换胶原溶液。
7.按照权利要求1所述基于硝酸纤维素基底膜的三层夹膜微流控芯片的制备方法，其特征在于所述的微流控芯片按照以下步骤制备：
(1)采用软刻蚀技术制作，先以SU8光刻胶制作通道模板，再使用混合好的PDMS倒模得到顶层通道层；PDMS：引发剂体积比5-15:1；
(2)底层无结构层采用无结构的模板再使用混合好的PDMS倒模，PDMS：引发剂体积比为5-15:1；
(3)将中间的硝酸纤维素膜通过PDMS胶水封在在顶层通道层和底层无结构层之间，然后用PDMS胶水将芯片外侧封严，置于60-80℃烘箱使PDMS胶水固化。
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