CN109836473A - 一种牛膝中提取和分离的牛膝多肽单体及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从牛膝中提取和分离多肽类化合物的应用方法，通过对牛膝水提取物的盐析处理，粗提物中的多肽采用Sevage试剂法进行富集，采用C18制备柱初步分离与二醇型HILIC柱最终分离的纯化手段，共制得牛膝多肽及其相应的糖肽。本发明涉及的提取物牛膝多肽经实验证明具有促进神经生长、防止神经元凋亡、促进损伤神经再生作用，其药材来源单一，制备方法先进，工艺合理，制剂成分明确，安全性高，药理作用显著。

Description

一种牛膝中提取和分离的牛膝多肽单体及其制备和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种以中药牛膝为原料制备牛膝多肽单体的提取分离纯化方法，以及该多肽类化合物作为制备神经保护或者用于神经保护制剂的应用，可用于开发神经保护的治疗或辅助治疗药物。

背景技术

现代社会中，由于自然灾害、交通事故和人口老龄化等原因，神经损伤及神经系统退行性疾病的发生率呈上升趋势，因此寻找促进损伤神经修复、预防和治疗神经系统退行性变的有效药物，是现在医药研究中一个引人关注的课题。

中药作为祖国医药学的伟大宝库，具有疗效确切、毒副作用小的优点，受到世界的重视，同时也有着广阔的开发利用前景。牛膝(AchyranthisBidentatae Radix)为苋科植物牛膝(Achyranthesbidentata Bl.)的干燥根。冬季茎叶枯萎时采挖，除去须根和泥沙，捆成小把，晒至干皱后，将顶端切齐，晒干。主治逐瘀通经，补肝肾，强筋骨，利尿通淋，引血下行。用于闭经，痛经，腰膝酸痛，筋骨无力，淋证，水肿，头痛，眩晕，牙痛，口疮，吐血，衄血。牛膝含皂甙、多糖、糖肽、甾醇、甾酮、生物碱、香豆素等。我们先前已经发现牛膝中的甾酮、多糖具有促进神经生长的作用。最近在牛膝的蛋白提取物中发现可有效促进神经生长、防止神经退行性病变的植物多肽。

有关牛膝多肽单体的鉴定以及制备工艺在现有的国内外报道中未见发现，牛膝多肽在神经保护方面的生物学报道较少。因此，有必要发展一种简单、安全、经济高效的牛膝多肽的制备方法。

发明内容

本发明的目的旨在发展牛膝多肽作为一种潜在的神经保护方面的药物，提供一种简单快速、样品损失少、成本低、可控性和重现性好、适用于工业化生产的牛膝多肽单体的制备方法，建立一种通过多种现代分离分析技术手段相结合的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

牛膝多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)牛膝多肽的提取：牛膝水溶液于4℃加硫酸铵至硫酸铵浓度为50wt.％，15000rpm离心半小时，离心后的上清液继续于4℃加硫酸铵至浓度为80wt.％，15000rpm离心半小时，将沉淀移至截留最小分子量为1000的透析袋中，纯水透析，透析后冷冻干燥；

(2)牛膝多肽的富集：将冷冻干燥后的粗提物溶于水，约1.5g粗提物溶于100mL水，搅拌均匀后，按Sevage试剂：样品＝1:3的体积比例加入Sevage试剂(组成为氯仿：正丁醇＝5:1)。振荡离心后，收集中间白色沉淀层。上层水溶液层再次用sevage试剂提取，合并中间固体沉淀层。

(3)牛膝多肽的分离：将牛膝多肽的富集层溶于少量70％甲醇的溶剂中，过0.22μm的滤膜。使用25mm×21mm的C18制备柱，以10mL/min的70％甲醇水溶液(含0.5％甲酸)进行洗脱，以254nm和277nm作为检测波长，收集目标峰。牛膝多肽粗品经旋蒸浓缩后，溶于少量乙腈：0.2M醋酸铵＝80:20的溶液中，使用25mm×10mm的二醇型HILIC柱，以5mL/min的乙腈：0.2M醋酸铵＝80:20作为流动相进行洗脱，以254nm和277nm作为检测波长，收集牛膝多肽单体及其糖肽的色谱峰，干燥后得牛膝多肽单体化合物。

上述步骤(1)中的牛膝为苋科植物牛膝Achyranthesbidentata Bl.的干燥根。

上述步骤(1)中的盐析方法，分别在4℃下采用50％与80％的硫酸铵进行盐析，收集沉淀部分，并采用透析方法制备牛膝多肽的粗提物。

上述步骤(2)中富集牛膝多肽采用Sevage试剂方法，样品与Sevage试剂的体积比为3:1。

上述步骤(3)中初级分离牛膝多肽，色谱条件为：色谱柱：直径为21.2mm的C18柱，柱温：室温，流动相：70％甲醇和0.5％甲酸，检测波长254nm和277nm。

上述步骤(3)中制备牛膝多肽单体的分离方法，色谱条件：色谱柱：直径为10mm的二醇型HILIC柱，柱温：室温，流动相：80:20的乙腈：200mM醋酸铵，检测波长254nm和277nm。

与现有技术相比，本发明的优益性和显著优点在于：

(1)采用盐析法，减少了牛膝中糖类、苷类等物质的溶出，促进了多肽类成分的溶出，提取率高，且毒性低。

(2)用制备型HPLC分离前，先用Sevage方法对牛膝多肽进行富集，可除掉大部分杂质，避免干扰，使上样量得到很大提高，并减少对色谱柱的污染。

(3)采用多种制备型色谱相结合，实现了牛膝多肽的快速识别和高通量快速制备，大大简化了物质分离纯化步骤，快速、高效，适合工业化生产。本发明涉及的提取物牛膝多肽(蛋白)经实验证明具有促进神经生长、防止神经元凋亡、促进损伤神经再生作用，其药材来源单一，制备方法先进，工艺合理，制剂成分明确，安全性高，药理作用显著，可用于制备抗衰老、防治神经退行性变疾病及治疗周围神经损伤和脑血管意外(出血性中风)、缺血性脑损伤(缺血性中风)、脑创伤、视神经损伤、脊髓损伤等中枢神经损伤性疾病的药物和保健品。

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

具体实施方式：

一种中药牛膝多肽单体的制备，采用下列方法获得：将单味药材怀牛膝饮片500g，用水溶液提取3次，合并提取液得牛膝水溶液。再采用下列方法从牛膝水溶液获得牛膝多肽提取物：

(1)多肽的提取：牛膝水溶液于4℃加硫酸铵至硫酸铵浓度为50wt.％，15000rpm离心半小时，离心后的上清液继续于4℃加硫酸铵硫酸铵浓度为80wt.％，15000rpm离心半小时，将沉淀移至截留最小分子量为1000的透析袋中，纯水透析，透析后冷冻干燥。

(2)牛膝多肽的富集：将冷冻干燥后的粗提物溶于水，约1.5g粗提物溶于100mL水，搅拌均匀后，按Sevage试剂：牛膝多肽粗提取物水溶液＝1:3的体积比例加入Sevage试剂(组成为氯仿：正丁醇＝5:1)。振荡离心后，收集中间白色沉淀层。上层水溶液层再次用sevage试剂提取，合并中间固体沉淀层。

(3)牛膝多肽的分离：将牛膝多肽的富集层溶于少量70％甲醇的溶剂中，过0.22μm的滤膜。使用25mm×21mm的C18制备柱，以10mL/min的70％甲醇水溶液(含0.5％甲酸)进行洗脱，以254nm和277nm作为检测波长，收集目标峰。

牛膝多肽粗品经旋蒸浓缩后，溶于少量乙腈：0.2M醋酸铵＝80:20(v:v)的溶液中，使用25mm×10mm的二醇型HILIC柱，以5mL/min的乙腈：0.2M醋酸铵＝80:20(v:v)作为流动相进行洗脱，以254nm和277nm作为检测波长，收集牛膝多肽单体及其糖肽的色谱峰，干燥后得牛膝多肽单体化合物20mg。

上述得到的牛膝多肽单体在制备抗衰老、防治神经退行性疾病及治疗周围神经损伤和脑血管意外(出血性中风)、缺血性脑损伤(缺血性中风)、脑创伤、视神经损伤、脊髓损伤等中枢神经损伤性疾病的药物和保健品中的应用。

对于局灶性脑溢血再灌注损伤的大鼠，尾静脉给予牛膝多肽(0.2mg/kg)治疗，可以降低神经功能缺陷评分，降低脑梗死百分比(p<0.01)。

MTT实验中，NMDA能降低培养的海马神经元的活力。牛膝多肽能抑制NMDA引起的海马神经元活力下降，并与其剂量相关。

PI流式细胞仪检测表明，牛膝多肽(1μg/ml)能拮抗NMDA诱导的海马神经元凋亡。

多功能酶标仪实时测定结果显示牛膝多肽能NMDA引起的荧光强度增强，并随着其浓度的增加，抑制程度逐渐增强；并表明牛膝多肽能拮抗线粒体跨膜电位下降。

Claims (7)

1.一种从牛膝中提取和分离多肽类化合物的应用方法，其特征是：采用如下方法制得：

(1)多肽的提取：向的牛膝水溶液中加入质量分数为50％～80％(终浓度)的硫酸铵，通过盐析而析出沉淀，高速离心后得到牛膝多肽提取物；采用透析方法和冷冻干燥的方法，除去小分子物质，得到牛膝多肽粗提物；

(2)多肽的富集：适量牛膝多肽粗提物溶于纯水中，采用Sevage试剂法进行液液萃取富集；Sevage试剂的组成为氯仿与正丁醇按一定体积比进行混合，再将牛膝多肽粗提取物水溶液与Sevage试剂按适当体积比进行混合；振荡离心后，收集中间固体层；

(3)多肽的分离：Sevage试剂分离的多肽层，用70％甲醇-水溶液溶解后过滤，应用制备型C18柱进行初步分离，流动相为甲醇甲酸水溶液，甲醇体积浓度为60％～80％，甲酸体积浓度为0.1％～1.0％，优选70％甲醇与0.5％甲酸，流速为7～15mL/min，优选流速为10mL/min，检测波长为240～300nm，优选254nm与277nm双波长检测，收集多肽部分(保留时间为12～18min，优选15min)；

干燥后用0.1～3.0g/ml80:20的乙腈水溶液：200mM醋酸铵溶解，应用HILIC半制备柱进行最终分离，流动相流速为5mL/min，，检测波长为240～300nm，优选254nm与277nm双波长检测，收集多肽部分分离后得到牛膝多肽单体及其相应的糖肽，干燥后得到牛膝多肽单体。

2.按照权利要求1所述的牛膝多肽单体的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中的牛膝为苋科植物牛膝Achyranthesbidentata Bl.的干燥根。

3.按照权利要求1所述的牛膝多肽单体的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)中的盐析方法，分别采用50％到80％的硫酸铵进行盐析，收集沉淀部分，并采用截留最小分子量为1000的透析袋中，纯水透析方法制备牛膝多肽的粗提物。

4.按照权利要求1所述的牛膝多肽单体的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中富集牛膝多肽采用Sevage试剂方法，其中Sevage试剂为氯仿与正丁醇按适当体积比例进行混合，混合比例范围为3:1至5:1；牛膝多肽粗提取物水溶液与Sevage试剂的混合比例范围为2:1至6:1。

5.按照权利要求1所述的牛膝多肽单体的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中初级分离牛膝多肽，色谱条件为制备型C18色谱柱，流动相为70％甲醇和0.5％甲酸。

6.按照权利要求1所述的牛膝多肽单体的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中制备牛膝多肽单体的分离方法，色谱条件为HILIC色谱柱，流动相为乙腈与醋酸铵按照流动相为80:20的乙腈：200mM醋酸铵水溶液混合。

7.按照上述任一权利要求制得的牛膝多肽单体在制备治疗周围神经损伤和脑血管意外、缺血性脑损伤、脑创伤、视神经损伤、脊髓损伤、中枢神经损伤及抗衰老、防治神经退行性疾病的药物或保健品中的应用。