CN109825518B - 3′-羟基染料木黄酮的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种3′‑羟基染料木黄酮的制备方法及其用途，所述方法利用导入络氨酸酶基因的重组大肠杆菌，将基因重组大肠杆菌活化培养诱发络氨酸酶基因表现后，将染料木黄酮通过生物转化为3′‑羟基染料木黄酮。并且提供了3′‑羟基染料木黄酮的用途，所述3′‑羟基染料木黄酮在食品、药品或化妆品领域作为抗氧化剂使用；提供了一种抗老化化妆品，所述化妆品种包括3′‑羟基染料木黄酮；验证了3′‑羟基染料木黄酮能够抑制诱导型人基质金属蛋白酶‑1，能够抑制细胞脱颗粒，并且提供了在制备药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物的制备方法及用途，具体涉及3′-羟基染料木黄酮的 制备方法及其用途。
背景技术
3′-羟基染料木黄酮(3'-hydroxygenistein)是大豆异黄酮的代谢产物之一。Hsiou-Yu Ding、Chien-Min Chiang等人发表在Process Biochemistry，题目为Identification of 3-hydroxygenistein as a potent melanogenesis inhibitor frombiotransformation of genistein by recombinant Pichia pastoris的文章公开了一种3′- 羟基染料木黄酮的制备方法，所述方法通过重组巴斯德毕赤酵母生物转化染料 木黄酮制备得到3′-羟基染料木黄酮，并且验证了3′-羟基染料木黄酮对于黑色素 生成的抑制作用，以及3′-羟基染料木黄酮抑制络氨酸酶的作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供3′-羟基染料木黄酮 的制备方法及其用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种3′-羟基染料木黄酮的制 备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将络氨酸酶基因导入大肠杆菌中制备基因重组大肠杆菌，将基因重组 大肠杆菌活化培养诱发络氨酸酶基因表现后，冷冻干燥，得到干燥后的菌粉；
(2)配制硼酸盐、抗坏血酸、染料木黄酮(Genistein)的混合溶液A，其 中所述混合溶液A的pH为8.5-9.5；
(3)按照染料木黄酮和菌粉的重量比为10:1-15向混合溶液中A加入所述 干燥后的菌粉，得到混合液B；
(4)在48-52℃下，震荡培养步骤(3)得到的混合液B，进行生物转化反 应；
(5)培养结束后，用有机溶剂萃取反应后的产物，浓缩干燥得到3′-羟基木 黄酮。
优选地，基因重组大肠杆菌的制备方法包括以下步骤：将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中的络氨酸酶(tyrosinase)基因融合进pETDuet-1TM载 体，得到pETDuet-BmTYR环状重组质体，并将重组质体转入大肠杆菌 (BL21(DE3))，得到重组大肠杆菌。
染料木黄酮(Genistein)的化学结构式如式(Ⅰ)所示：
3′-羟基染料木黄酮的的化学结构式如式(Ⅱ)所示：
优选地，在所述步骤(4)中震荡培养的过程中，同时向混合液B中曝气， 所述曝气的速率为1-1.2L/L混合液B/min。
优选地，所述步骤(3)中染料木黄酮和菌粉的重量比为10:2、10:4、10:8、 10:14。
优选地，所述步骤(3)中染料木黄酮和菌粉的重量比为10:8-14。
优选地，所述硼酸盐、抗坏血酸、染料木黄酮的物质的量的比值为： 500:10-35:3-5。
更优选地，所述硼酸盐、抗坏血酸、染料木黄酮的物质的量的比值为： 500:20-32:3-5。
优选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
优选地，步骤(2)中所述混合溶液A的pH为9。
优选地，步骤(4)中震荡培养的温度为50℃。
优选地，所述步骤(1)中得到所述干燥菌粉的方法包括以下步骤：
(1)将所述基因重组大肠杆菌活化后，在含有氨苄青霉素的LB培养基中， 35-38℃发酵培养至细菌密度生长至光密度值为0.6至1时，加入异丙基β-D-1- 硫代吡喃半乳糖苷，在16-20℃继续培养，诱发络氨酸酶基因表现；
(2)将发酵液离心后，去除上清液，然后用磷酸盐缓冲液冲洗，离心，反 复多次，得到沉淀的细胞团块；
(3)冷冻干燥得到菌粉。
本发明还提供一种3′-羟基染料木黄酮的用途，所述3′-羟基染料木黄酮在食 品、药品或化妆品领域作为抗氧化剂使用。
本发明还提供一种3′-羟基染料木黄酮的用途，3′-羟基染料木黄酮在食品或 者化妆品领域作为抗老化剂使用
本发明还提供一种抗老化化妆品，所述化妆品包括3′-羟基染料木黄酮。
本发明还提供一种3′-羟基染料木黄酮制备药物组合物中的用途，所述药物 能够抑制诱导型人基质金属蛋白酶-1。
本发明还提供一种3′-羟基染料木黄酮制备药物组合物中的用途，所述药物 能够抑制细胞脱颗粒。
本发明还提供一种含有3′-羟基染料木黄酮的药物，所述药物能够抑制诱导 型人基质金属蛋白酶-1(hMMP-1)或者所述药物能够抑制细胞脱颗粒。
本发明还提供一种含有3′-羟基染料木黄酮的药物，所述药物能够预防或者 治疗免疫疾病，所述免疫疾病包括过敏性疾病、皮肤炎症。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法 及其用途，所述方法利用导入络氨酸酶基因的重组大肠杆菌，将因重组大肠杆 菌活化培养诱发络氨酸酶基因表现后，将染料木黄酮通过生物转化为3′-羟基染 料木黄酮。并且提供了3′-羟基染料木黄酮的用途，所述3′-羟基染料木黄酮在食 品、药品或化妆品领域作为抗氧化剂使用；提供了一种抗老化化妆品，述化妆 品种包括3′-羟基染料木黄酮；验证了3′-羟基染料木黄酮能够抑制诱导型人基质 金属蛋白酶-1，能够抑制细胞脱颗粒，并且提供了在制备药物中的用途。
附图说明
图1为本发明实施例制备的3′-羟基染料木黄酮的定性结果图，其中(a) 为3′-羟基染料木黄酮标准品的液相色谱图；(b)为本发明实施例制备得到的产 物的液相色谱图。
图2为3′-羟基染料木黄酮(3’-OHGe)清除DPPH的实验结果图。
图3为3′-羟基染料木黄酮(3’-OHGe)清除H2O2的实验结果图。
图4为3′-羟基染料木黄酮(3’-OHGe)总还原能力的实验结果图。
图5为3′-羟基染料木黄酮(3’-OHGe)抗氧化能力的实验结果图。
图6为3′-羟基染料木黄酮(3’-OHGe)抗老化的实验结果图。
图7为3′-羟基染料木黄酮(3’-OHGe)抗敏化的实验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对 本发明作进一步说明。
实施例1
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，所述方法包括以 下步骤：
(1)制备基因重组大肠杆菌：将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中的 络氨酸酶(tyrosinase)基因融合进pETDuet-1TM载体，得到pETDuet-BmTYR环 状重组质体，并将重组质体转入大肠杆菌(BL21(DE3))，得到基因重组大肠杆 菌；
(2)将基因重组大肠杆菌活化培养诱发络氨酸酶基因表现后，冷冻干燥， 得到干燥后的菌粉；
(3)配制硼酸盐、抗坏血酸、染料木黄酮的混合溶液A，其中所述混合溶 液A的pH为9.0，硼酸盐浓度为500mM，抗坏血酸的浓度为10mM，染料木 黄酮的浓度为1000ppm；
(4)按照菌粉浓度为0.2mg/mL向混合溶液A中加入所述干燥后的菌粉， 得到混合液B的体积为100ml；
(5)在50℃下，220rpm震荡培养步骤(3)得到的混合体系90min，进行 生物转化反应；
(6)加入20ml 1M盐酸溶液终止转化反应后，用120mL乙酸乙酯震荡萃 取发酵液2-3分钟，得到反应后的产物，浓缩干燥得到3′-羟基木黄酮；
其中，所述步骤(2)的具体操作过程为：将所述基因重组大肠杆菌活化后， 取单一菌落分别培养于两瓶100mL的LB培养基(含有100μg/mL氨苄青霉 素)，在37℃和180rpm的条件培养48小时，将两瓶共200mL的种菌加入含 有5L的LB培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)的发酵槽中，在37℃、180 rpm和5L/min通气量的条件进行培养；待细菌密度生长至光密度值(OD600) 达0.6至1时，加入5mL的0.1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，并继续在18℃和180rpm的条件培养24 小时，以诱发酪胺酸酶基因表现，收集发酵液在4500rpm、4℃下离心15分钟， 去除上清液，用少量磷酸盐缓冲液(PBS)清晰沉淀菌体后，在4500rpm、4℃ 下离心15分钟，去除上清液，反复多次得到沉淀的细胞团块，在-80℃进行冷冻 干燥，得到菌粉。
其中，巨大芽孢杆菌购自台湾省-食品工业发展研究所生物资源保存及研究 中心；pETDuet-1TM载体购自Novagen；大肠杆菌购自台湾省-食品工业发展研 究所生物资源保存及研究中心。
制备产物的检测：
3′-羟基染料木黄酮标准品来自台南大学张德生教授研究室。
利用HPLC在相同的洗脱条件下进行检测，所述制备产物在高效液相色谱 上的保留时间与3′-羟基染料木黄酮标准品一致，结果如图1(a)(b)所示， 证明所述转化后的产物为3′-羟基染料木黄酮。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品0.26 g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为21.21％。
实施例2
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，本实施例与实施 例1的区别有：
1、步骤(3)中抗坏血酸的浓度为20mM；
2、步骤(4)中加入的菌粉浓度为0.4mg/mL，得到混合体系的体积为200 ml；
3、步骤(6)中，用250mL乙酸乙酯萃取反应后的产物。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品0.34 g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为35.11％。
实施例3
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，本实施例与实施 例1的区别有：
1、步骤(3)中抗坏血酸的浓度为20mM；
2、步骤(4)中加入的菌粉浓度为0.4mg/mL，得到混合体系的体积为600 ml；
3、步骤(6)中，用250mL乙酸乙酯萃取反应后的产物。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品1.7g， 其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为23.22％。
实施例4
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，本实施例与实施 例1的区别有：
1、步骤(3)中抗坏血酸的浓度为20mM；
2、步骤(4)中加入的菌粉浓度为0.4mg/mL，得到混合体系的体积为1200 ml；
3、步骤(6)中，用250mL乙酸乙酯萃取反应后的产物。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品3.1g， 其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为23.22％。
实施例5
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，本实施例与实施 例1的区别有：
1、步骤(3)中抗坏血酸的浓度为20mM；
2、步骤(4)中加入的菌粉浓度为0.4mg/mL，得到混合体系的体积为1000 ml；
3、步骤(6)中，用250mL乙酸乙酯萃取反应后的产物。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品2.53 g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为34.70％。
实施例6
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，本实施例与实施 例1的区别有：
1、步骤(3)中抗坏血酸的浓度为20mM；
2、步骤(4)中加入的菌粉浓度为0.4mg/mL，得到混合体系的体积为1000 ml；
3、步骤(6)中，用250mL乙酸乙酯萃取反应后的产物。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品2.29 g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为34.70％。
实施例7
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，所述方法包括以 下步骤：
(1)制备基因重组大肠杆菌：将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中的 络氨酸酶(tyrosinase)基因融合进pETDuet-1TM载体，得到pETDuet-BmTYR环 状重组质体，并将重组质体转入大肠杆菌(BL21(DE3))，得到重组大肠杆菌；
(2)将基因重组大肠杆菌活化培养诱发络氨酸酶基因表现后，冷冻干燥， 得到干燥后的菌粉；
(3)配制硼酸盐、抗坏血酸、染料木黄酮的混合溶液A，其中所述混合溶 液A的pH为9.0，硼酸盐浓度为500mM，抗坏血酸的浓度为20mM，染料木 黄酮的浓度为1000ppm；
(4)按照菌粉浓度为0.8mg/mL向步骤(3)得到的混合溶液A中加入所 述干燥后的菌粉，得到混合液B的体积为2500ml；
(5)在50℃下，280rpm震荡培养步骤(3)得到的混合体系60min，培养 过程中按照2.5L/min的速率曝气，进行生物转化反应；
(6)加入500ml 1M盐酸溶液终止转化反应后，用3000mL乙酸乙酯手动 震荡萃取发酵液2-3分钟，得到反应后的产物，浓缩干燥得到3′-羟基木黄酮；
其中，所述步骤(2)中菌粉的制备同实施例1。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品6.64 g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为71.55％。
实施例8
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，本实施例与实施 例7的区别有：
1、步骤(4)中得到混合体系的体积为4000ml；
2、步骤(5)中震荡培养步骤(3)得到的混合体系90min，培养过程中按 照4L/min的速率曝气；
3、步骤(6)中，乙酸乙酯震荡仪震荡萃取发酵液10-15分钟。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品8.98 g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为97.72％。
实施例9
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，本实施例与实施 例7的区别有：
1、步骤(3)中抗坏血酸的浓度为32mM；
2、步骤(4)中加入的菌粉浓度为1.4mg/mL；
3、步骤(5)中震荡培养步骤(3)得到的混合体系90min，培养过程中按 照3L/min的速率曝气；
4、步骤(6)中，乙酸乙酯震荡仪震荡萃取发酵液15-20分钟。
根据HPLC进行定量检测，本实施例制备得到3′-羟基染料木黄酮产品9.92 g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为99.30％。
实施例10
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的制备方法，本实施例同实施 例9。
按照实施例9的方法制备3′-羟基染料木黄酮，在不同的发酵槽中，分别得 到
3′-羟基染料木黄酮产品10.67g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为98.04％；
3′-羟基染料木黄酮产品11.33g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为97.58％；
3′-羟基染料木黄酮产品12.24g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为98.49％；
3′-羟基染料木黄酮产品14.06g，其中3′-羟基染料木黄酮的纯度为97.95％。
说明本发明方法制备得到的3′-羟基染料木黄酮的产量和纯度稳定。
实施例11
作为本发明实施例的一种3′-羟基染料木黄酮的用途，所述3′-羟基染料木黄 酮(3’-OHGe)在食品、药品或化妆品领域作为抗氧化剂使用。
实验材料及仪器：
2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)、乙醇(Ethanol)、 抗坏血酸(L-Ascorbic acid)、Amplex Red过氧化氢/过氧化物酶分析试剂盒 (
Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit)、96孔微孔板(96-well microplates)、移液枪头(Pipette tips)、多通道移液枪(Multichannel pipette)、 多功能酶标仪(SPECTROstar Nano(96-well plate photometer))。
测试样品：本发明制备的纯化后的3′-羟基染料木黄酮。
1、DPPH自由基清除率的测定。
实验方法：
清除DPPH测试：取75μL之不同浓度样品到每个96孔盘中，用新配制的 L-Ascorbicacid水溶液做为正对照组，乙醇则作为溶剂和控制组。在冰浴中避光 下新鲜配制0.1mMDPPH的乙醇溶液，并取75μL配好的DPPH溶液加到每孔 的测试样品中，3混合均匀后于室温且避光下静置0分钟，最后用免疫分析仪(ELISA Reader)检测519nm下之吸光值，吸光值越低表示清除DPPH自由基的 能力越强。
清除能力(Scavenging effect,％)＝〔1－(测试样品或正对照组于519nm下之 吸收值/控制组于519nm下之吸收值)〕×100％。
结果如图2所示：3′-羟基染料木黄酮对DPPH自由基的清除能力随3′-羟基 染料木黄酮的浓度的增大而增大，3′-羟基染料木黄酮的浓度达到20μg/ml时， DPPH自由基的清除能力达到了80％以上。
2、H2O2清除率的测定。
清除H2O2测定：取待测样品到每个96孔盘中，用新配制的L-Ascorbic acid 水溶液做为正对照组，去离子水则作为控制组，接着将50μL的50μM H2O2溶 液加到每孔待测样品中，混合均匀后于室温下静置30分钟。依据
Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit(Invitrogen,Cat no.A22188)的H2O2assay 步骤进行分析，最后用ELISA Reader检测(Fluorescence excitation detection at 560 nm/emission at590nm)，值越低表示清除H2O2的能力越强。清除能力 (Scavenging effect,％)＝〔1－(测试样品或正对照组之侦测值/控制组之侦测值)〕 ×100％。(n＝3)。
结果如图3所示：3′-羟基染料木黄酮对H2O2的清除能力随3′-羟基染料木黄 酮的浓度的增大而增大，3′-羟基染料木黄酮的浓度达到100μg/ml时，H2O2的 清除能力达到了80％以上。
3、总还原能力测试。
实验材料及仪器：
没食子酸(Gallic acid)、丁基羟基茴香醚(BHA)、K3Fe(CN)6、FeCl3、 三氯乙酸(TCA)、磷酸盐缓冲液(PBS)、一次性使用无菌移液管(Sterile disposable pipettes)、96孔微孔板(96-well microplates)(Corning)、移液枪头(Pipette tips (Rainin))、Eppendorf(Gunster)、Microplate reader(SPECTROstar Nano)
实验方法：
取250μL之不同浓度样品到eppendorf中，并加入250μL K3Fe(CN)6及250 μL TCA，于50℃反应20分钟。取500μL反应液加入500μL H2O及100μL FeCl3于室温避光反应10分钟，最后取200μL反应液至96well Microplate中，以 Microplate reader检测OD500吸光值。
还原力(Reduction power,％)＝〔1－(测试样品或正对照组于500nm下之吸 收值/控制组于500nm下之吸收值)〕×100％。(n＝3)
结果如图4所示。
4、总酚含量测试。
实验材料及仪器：
没食子酸(Gallic acid)、Na2CO3、Folin指示剂、Sterile disposable pipettes、96-well microplates(Corning)、Pipette tips(Rainin)、Eppendorf(Gunster)、Microplate reader(SPECTROstar Nano)。
实验方法：
取500μL之不同浓度样品到eppendorf中，并加入250μL Na2CO3及250μL Folin指示剂，于室温避光反应90分钟。取200μL反应液至96well Microplate 中，最后以Microplatereader侦测OD750吸光值。
总酚含量(Total phenolics,％)＝〔1－(测试样品或正对照组于750nm下之吸 收值/控制组于750nm下之吸收值)〕×100％。(n＝3)
结果如图5所示。
实施例12
本发明还提供一种3′-羟基染料木黄酮制备药物组合物中的用途，所述药物 能够抑制诱导型人基质金属蛋白酶-1。
抗老化分析
实验材料及仪器
Hs68细胞(BCRC Number:60038)、DMEM培养基、胎牛血清FBS、杜氏 磷酸盐缓冲液Dulbecco’s PBS(GIBCO)、Human Total MMP-1DuoSet(R&D Systems)、
(Thermo)、Sterile disposable pipettes、96-well microplates (Corning)、Pipettetips(Rainin)、
37℃培养箱，5％CO2,95％RH(37℃incubator 5％CO2,95％RH)、层流 净化罩(Laminar flow hood)、Multichannel pipette、FlexStation 3(96-well platephotometer)。
测试样品：本发明制备的纯化后的3′-羟基染料木黄酮。
将Hs68细胞种于96孔细胞分析盘中，每孔的细胞数为1x×104。于37℃/ 5％CO2细胞培养箱培养24小后，去掉原细胞培养液，并将以培养液稀释好的 样品加入96孔细胞分析盘中，每个样品3重复试验，处理6小时后加入10ng/mL TNF-α刺激细胞MMP-1产生。经培养18小时后，将上清液转移至预先以MMP-1 抗体披覆的分析盘中进行酵素免疫分析(ELISA)，细胞则以
试剂分 析活性。利用FlexStation 3读取数值与分析。(n＝3)
试验结果如图6所示，-TNFa表示图中每个横坐标对应的左边的条形， +TNFa表示图中每个横坐标对应的右边的条形，
3’-OHGe对诱导型hMMP-1有抑制效果，IC50＝18.53±0.90μg/mL(77.44 ±3.76μM)，分析浓度至200μg/mL，Cell viability≥80％。
作为本发明实施例的一种含有3′-羟基染料木黄酮的化妆品，所述化妆品具 有抗老化的效果，所述化妆品包含3′-羟基染料木黄酮的丙二醇溶液，所述3′- 羟基染料木黄酮的丙二醇溶液中3′-羟基染料木黄酮的质量分数为10％。
作为本发明实施例的一种含有3′-羟基染料木黄酮的药物，所述药物能够抑 制诱导型人基质金属蛋白酶-1，所述药物包括0.02mg/g的3′-羟基染料木黄酮和 相应的药物辅料。
实施例13
本发明还提供一种3′-羟基染料木黄酮制备药物组合物中的用途，所述药物 能够抑制细胞脱颗粒。
抑敏性分析
实验材料及仪器：
RBL-2H3(BCRC Number:60310)、低限量培养基(MEM)、丙酮酸钠(Sodiumpyruvate)、非必需氨基酸(NEAA)、FBS、Dulbecco’s PBS(GIBCO)、Na2CO3、 NaHCO3、柠檬酸盐缓冲液(Citrate buffer)、水洗缓冲剂(Wash buffer)、 p-nitrophenyl-N-acetyl-b-D-glucosaminide、A23187、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2， 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT(Sigma))、无菌一次性移液器(Sterile disposable pipettes)、96-well microplates(Corning)、Pipette tips(Rainin)、37℃incubator 5％ CO2,95％RH、Laminar flow hood、Multichannel pipette、FlexStation 3(96-well plate photometer).
实验方法：
将RBL-2H3细胞种于96孔细胞分析盘中，每孔之细胞数为5×104，于37℃ /5％CO2细胞培养箱培养24小后，去掉原细胞培养液，并将稀释好的样品加 入分析盘中，每个样品3重复试验，半小时后加入1μg/mL钙离子载体(A23187) 刺激2小时。反应结束后吸取上清液进行β-Hexosaminidase Release分析，细胞 则以MTT试剂分析活性。利用FlexStation 3读取数值，以Grafit 7软件计算IC50。
试验结果如图7所示：
3’-OHGe浓度达12.5μg/mL(43.67μM)即有抑制细胞脱颗粒之效果，3′- 羟基染料木黄酮的IC50＝18.52±0.11μg/mL(64.7±0.38μM)，分析浓度至100 μg/mL，Cellviability≥80％。
作为本发明实施例的一种含有3′-羟基染料木黄酮的药物，所述药物能够抑 制细胞脱颗粒，所述药物包括0.02mg/g的3′-羟基染料木黄酮和相应的药物辅 料。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本 发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而 不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (1)
1.一种3′-羟基染料木黄酮制备药物组合物中的用途，所述药物能够抑制TNF-α刺激Hs68细胞产生的人基质金属蛋白酶-1，3′-羟基染料木黄酮的化学结构式如式(Ⅱ)所示：
Priority Applications (1)
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