CN109824793A - 一种米糠多糖铁的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种米糠多糖铁的制备方法及应用，涉及多糖技术领域。所述米糠多糖铁的制备方法包括以下步骤：取米糠多糖溶于醋酸溶液中，得米糠多糖醋酸溶液；将六水合氯化铁晶体溶于所述米糠多糖醋酸溶液中，得铸膜液；将所述铸膜液倒在玻璃板上，让其自然流延成膜后，烘干，得米糠多糖复合膜；将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁。本发明可用做补铁剂，也可以用作基因载体。本发明的技术方案中，制备出了一种米糠多糖铁，并将其有效应用于制备补铁剂和制备基因载体，克服了现有补铁剂生物利用度差、吸收效率低及副作用大的缺陷，及现有的非病毒类基因载体细胞毒性大的缺陷。

Description

一种米糠多糖铁的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及多糖技术领域，特别涉及一种米糠多糖铁的制备方法及应用。

背景技术

铁元素是人体含量最高的微量元素，参与机体的多项生理功能，如组成血红蛋白参与氧的运输和存储、组成肌红蛋白和提高机体的免疫力等。但缺铁性贫血却是世界上最常见的疾病之一，尤其是老年人、儿童和妇女因其生理的特殊性更易患铁缺乏症，铁元素的缺乏严重影响着人的体能和智能。补铁剂是有效治疗、预防缺铁性贫血的药物。目前市场上使用的最为普遍的补铁剂是以硫酸亚铁为代表的无机盐类，这类补铁剂的生物利用度差，易产生胃肠道反应；以离子形式吸收的柠檬酸亚铁、琥珀酸亚铁等虽具有较好的生物利用度，但进入机体后溶液受到其他成分的干扰。

基因治疗是将外源基因导入体内靶细胞从而达到预防或治疗的目的。在基因治疗中，最关键的环节之一是选择合适的基因载体。基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两类，其中后者因具有使用方便、安全性高、可大规模制备及无免疫源性等优点而成为当今基因释放载体研究的热点。但目前报道的非病毒载体多含有大量的氨基，导致载体本身具有较大的细胞毒性。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种米糠多糖铁的制备方法及应用，制备出了一种米糠多糖铁，并提供了该米糠多糖铁在制备补铁剂和制备基因载体中的应用。

为实现上述目的，本发明提出了一种米糠多糖铁的制备方法，所述米糠多糖铁的制备方法包括以下步骤：

取米糠多糖溶于醋酸溶液中，得米糠多糖醋酸溶液；

将六水合氯化铁晶体溶于所述米糠多糖醋酸溶液中，得铸膜液；

将所述铸膜液倒在玻璃板上，让其自然流延成膜后，烘干，得米糠多糖复合膜；

将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁。

优选地，所述取米糠多糖溶于醋酸溶液中，得米糠多糖醋酸溶液的步骤中，所述醋酸溶液的质量浓度为1％～2％。

优选地，所述取米糠多糖溶于醋酸溶液中，得米糠多糖醋酸溶液的步骤中，所述米糠多糖醋酸溶液中米糠多糖的质量浓度为0.5～0.8％。

优选地，所述将六水合氯化铁晶体溶于所述米糠多糖醋酸溶液中，得铸膜液的步骤中，所述六水合氯化铁晶体的加入量为每10ml所述米糠多糖醋酸溶液中加入2～4g六水合氯化铁晶体。

优选地，所述将所述铸膜液倒在玻璃板上，让其自然流延成膜后，烘干，得米糠多糖复合膜的步骤中，所述玻璃板为洁净、干燥的玻璃板；和/或，

所述烘干时，烘制温度为40～50℃。

优选地，所述将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁的步骤中，所述碱液为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.06～0.1mol/L。

优选地，所述将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁的步骤中，所述静置的时间为6～7天。

优选地，所述将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁的步骤中，所述洗涤时，用乙醇、丙酮依次洗涤。

此外，本发明还涉及上述制备方法制备的米糠多糖铁在制备补铁剂中的应用。

同时，本发明还涉及上述制备方法制备的米糠多糖铁在制备基因载体中的应用。

本发明技术方案中，通过以米糠多糖为骨架，复合膜模拟生物矿化法合成米糠多糖铁。得到的米糠多糖铁由于是以天然的生物大分子米糠多糖为骨架，因此在进入机体后更利于机体的吸收和利用，具有高生物利用度；而由于铁离子先被米糠多糖络合，也避免了米糠多糖铁被机体吸收后，机体中其他物质络合铁离子，只有当米糠多糖被机体逐渐分解后，络合的铁离子才会被缓慢地释放进入机体中，从而使铁离子被机体有效吸收，起到补充铁元素的作用。此外，由于作为骨架的天然生物大分子米糠多糖具有较低的细胞毒性，米糠多糖铁的细胞毒性也较低，且由于其络合了的带正电性的铁离子，会更有助于与DNA结合，因此米糠多糖铁用作基因载体具有良好的安全性及转运功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的补铁剂的制备方法的一实施例的流程示意图；

图2为实施例1～5制得的产物及米糠多糖的红外光谱图；

图3为显示实施例1～5制得的米糠多糖铁与DNA凝聚效果的凝胶电泳图；

图4为实施例1～5制得的米糠多糖铁的EB-DNA荧光检测图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

目前市场上使用的最为普遍的补铁剂是以硫酸亚铁为代表的无机盐类，这类补铁剂的生物利用度差，易产生胃肠道反应；以离子形式吸收的柠檬酸亚铁、琥珀酸亚铁等虽具有较好的生物利用度，但进入机体后溶液受到其他成分的干扰。同时，目前报道的非病毒载体由于大多数含有大量的氨基，导致载体本身具有较大的细胞毒性。

为解决上述问题，本发明提出一种米糠多糖铁的制备方法，并提供了该米糠多糖铁在制备补铁剂和制备基因载体中的应用。通过本发明提供的制备方法制备的米糠多糖铁由于是以天然的生物大分子米糠多糖为骨架，因此在进入机体后更利于机体的吸收和利用，具有高生物利用度；而由于铁离子先被米糠多糖络合，也避免了米糠多糖铁被机体吸收后，机体中其他物质络合铁离子，只有当米糠多糖被机体逐渐分解后，络合的铁离子才会被缓慢地释放进入机体中，从而使铁离子被机体有效吸收，起到补充铁元素的作用。此外，由于作为骨架的天然生物大分子米糠多糖具有较低的细胞毒性，米糠多糖铁的细胞毒性也较低，且由于其络合了的带正电性的铁离子，会更有助于与DNA结合，因此米糠多糖铁用作基因载体具有良好的安全性及转运功能。

为了更好地理解本发明提出的米糠多糖铁的制备方法，下面将结合图1所示的米糠多糖铁的制备方法的一实施例的流程示意图来详细说明，所述米糠多糖铁的制备方法包括以下步骤：

步骤S10、取米糠多糖溶于醋酸溶液中，得米糠多糖醋酸溶液。

其中，所述醋酸溶液的质量浓度优选为1％～2％；所述米糠多糖醋酸溶液中米糠多糖的质量浓度优选为0.5～0.8％。

我国米糠产量极为丰富，米糠中含有的米糠多糖是一种易吸收、无毒性的天然多糖分子，具有降血糖、抗癌、提高免疫力等生理功能，开发并利用这一资源，可以提高对米糠的利用度，具有极大的经济效益。米糠多糖醋酸溶液作为模拟生物矿化法的有机基质溶液，不仅可以作为晶体成核生长的模板，控制晶体生长状况，而且，由于模拟生物矿化法制备产物的特殊性质，米糠多糖在指导晶体成核后仍能保留在最终产物中发挥其本身的易于被吸收的作用及具有的降血糖、抗癌、提高免疫力等生理功能。

步骤S20、将六水合氯化铁晶体溶于所述米糠多糖醋酸溶液中，得铸膜液。

其中，所述六水合氯化铁晶体的加入量为每10ml所述米糠多糖醋酸溶液中加入2～4g六水合氯化铁晶体。

要制备米糠多糖铁，除了提供有机基质溶液外，还需要提供铁离子，以使铁离子与米糠多糖络合。由于米糠多糖铁加入过少不利于晶体生长，加入过多又会抑制晶体生长，因此，需要对二者比例加以控制，在本实施例中，六水合氯化铁晶体的加入量优选为每10ml所述米糠多糖醋酸溶液中加入2～4g六水合氯化铁晶体。

步骤S30、将所述铸膜液倒在玻璃板上，让其自然流延成膜后，烘干，得米糠多糖复合膜。

其中，所述玻璃板为洁净、干燥的玻璃板；所述烘干时，烘制温度为40～50℃。

铸膜液在自然流延过程中可以逐步调控晶型，形成结构高度有序的生物矿物体。

步骤S40、将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁。

米糠多糖-三氯化铁复合膜形成后，仍然有部分游离的铁离子附在其表面，因此需要经过碱液清除。在本实施例中，所述碱液优选为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度优选为0.06～0.1mol/L。

在步骤S40实施时，可以将所述米糠多糖复合膜置于氢氧化钠溶液静置6～7天，然后将复合膜取出，用乙醇、丙酮依次洗涤，再经干燥即得米糠多糖铁。

区别于其他化学合成法，本发明提供的制备方法反应条件温和，危险性小，且制备产物是纳米多糖铁晶体，性质稳定且更易于吸收。

此外，本发明还涉及上述制备方法制备的米糠多糖铁在制备补铁剂中的应用。

实验表明，米糠多糖铁中富含铁元素，铁含量达到18.5％～25.5％，具有稳定的高水溶性，能以分子形式吸收，易于被机体同化，且络合的铁由于并非以游离态存在而避免了被其他物质干扰影响吸收，在进入机体后方才被体内还原物质还原成二价铁，在体内停留时间长、吸收利用率高且无毒副作用，是一种优质的补铁制剂。此外，米糠多糖本身具有的降血糖、抗癌、提高免疫力等生理功能，在米糠多糖铁在体内还原、亚铁离子被释放后，米糠多糖的这些生理功能也对机体起到了积极作用，提高了其作为补铁剂的品质。

在实际应用时，可作为治疗贫血疾病的补铁药剂或者有补铁效果的食品添加剂的主药。

在具体实施时，可以直接将上述制备方法制备的米糠多糖铁干品或者所述米糠多糖铁制成的水溶液作为补铁剂；也可以以所述米糠多糖铁作为主药，加入诸如矫味剂、防腐剂、助流剂或者促铁质吸收剂等辅料，制成补铁剂，所述补铁剂的剂型可以为口服液、胶囊剂、片剂、颗粒剂或粉剂等。

同时，本发明还涉及上述制备方法制备的米糠多糖铁在制备基因载体中的应用。

米糠多糖铁络合了带正电的铁离子，具备化合物促进DNA凝聚的所需必要条件-正电性，可以与负电荷的DNA形成稳定的复合物，并通过细胞膜的内吞作用进入细胞内，同时在细胞内通过质子海绵效应释放DNA，从而达到高效传递治疗基因的目的；同时由于其骨架为易吸收、无毒性的天然多糖分子，确保了米糠多糖铁作为基因载体的安全性，是一种优质的非病毒类基因载体。

在实际应用时，可作为基因载体将核酸输送至体外和体内靶细胞中。

在具体实施时，可以通过将所述米糠多糖铁与核酸先分别溶于缓冲液中制成溶液，然后旋涡混合制成载体-核酸复合物，通过静脉注射、腹腔注射或皮下注射等方式将上述复合物导入机体内，让其自行到达靶组织，被靶细胞摄取；也可以将上述载体-核酸复合物直接送入体外培养的细胞所在的培养箱中，让其被靶细胞摄取。

为了更好地理解本发明的实质，以下结合具体实施例和附图、及对各实施例产品的验证实验及结果对本发明提出的制备方法及米糠多糖铁的用途作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

取10mL的1％醋酸溶液，配置成米糠多糖醋酸溶液，溶液中米糠多糖的质量浓度为0.6％。再加入3g FeCl₃·6H₂O晶体，超声处理10-15min使之溶解完全，得到铸膜液。

将铸膜液倒在洁净、干燥的玻璃板上，让其自然流延成膜后，置于50℃烘箱中烘干，得到米糠多糖-FeCl₃复合膜。

将烘干的米糠多糖-FeCl₃复合膜浸泡在0.06mol/L的NaOH溶液中静置7天后，取出，用乙醇、丙酮洗涤，烘干后得到米糠多糖铁。

实施例2

取10mL的2％醋酸溶液，配置成米糠多糖醋酸溶液，溶液中米糠多糖的质量浓度为0.8％。再加入4g FeCl₃·6H₂O晶体，超声处理10-15min使之溶解完全，得到铸膜液。

将铸膜液倒在洁净、干燥的玻璃板上，让其自然流延成膜后，置于45℃烘箱中烘干，得到米糠多糖-FeCl₃复合膜。

将烘干的米糠多糖-FeCl₃复合膜浸泡在0.1mol/L的NaOH溶液中静置7天后，取出，用乙醇、丙酮洗涤，烘干后得到米糠多糖铁。

实施例3

取10mL的1％醋酸溶液，配置成米糠多糖醋酸溶液，溶液中米糠多糖的质量浓度为0.5％。再加入2g FeCl₃·6H₂O晶体，超声处理10-15min使之溶解完全，得到铸膜液。

将铸膜液倒在洁净、干燥的玻璃板上，让其自然流延成膜后，置于40℃烘箱中烘干，得到米糠多糖-FeCl₃复合膜。

将烘干的米糠多糖-FeCl₃复合膜浸泡在0.08mol/L的NaOH溶液中静置6天后，取出，用乙醇、丙酮洗涤，烘干后得到米糠多糖铁。

实施例4

取10mL的1.2％醋酸溶液，配置成米糠多糖醋酸溶液，溶液中米糠多糖的质量浓度为0.7％。再加入3g FeCl₃·6H₂O晶体，超声处理10-15min使之溶解完全，得到铸膜液。

将铸膜液倒在洁净、干燥的玻璃板上，让其自然流延成膜后，置于50℃烘箱中烘干，得到米糠多糖-FeCl₃复合膜。

将烘干的米糠多糖-FeCl₃复合膜浸泡在0.09mol/L的NaOH溶液中静置6天后，取出，用乙醇、丙酮洗涤，烘干后得到米糠多糖铁。

实施例5

取10mL的1.1％醋酸溶液，配置成米糠多糖醋酸溶液，溶液中米糠多糖的质量浓度为0.7％。再加入2.6g FeCl₃·6H₂O晶体，超声处理10-15min使之溶解完全，得到铸膜液。

将铸膜液倒在洁净、干燥的玻璃板上，让其自然流延成膜后，置于50℃烘箱中烘干，得到米糠多糖-FeCl₃复合膜。

将烘干的米糠多糖-FeCl₃复合膜浸泡在0.07mol/L的NaOH溶液中静置7天后，取出，用乙醇、丙酮洗涤，烘干后得到米糠多糖铁。

对实施例1～5制得的产物进行验证实验。

(一)表征

对米糠多糖及实施例1～5制得的产物分别进行红外检测，记录红外图谱如图2所示。

由图2可知，米糠多糖位于3216.75cm^-1处的宽峰是-OH的伸缩振动吸收峰，位于1588.87cm^-1处的峰为-COO^-的反对称伸缩振动峰。而实施例1～5制得的产物的红外图谱中，实施例1～5制得的产物的-OH伸缩振动吸收峰移至3271cm^-1处，说明-OH参与了与铁离子的配位；实施例1～5制得的产物的-COO^-伸缩振动吸收峰移至1582.56cm^-1，说明-COO^-参与了与铁离子的配位。

即是说实施例1～5制得的产物为米糠多糖铁。

(二)金属含量测试

采用原子吸收光谱仪对实施例1～5制得的米糠多糖铁分别进行检测，测得结果如下表一：

表一各实施例制得的米糠多糖铁中铁含量

	铁含量(mg/kg)
		实施例1	2.01x 10<sup>5</sup>
实施例2	2.29x 10<sup>5</sup>
		实施例3	1.98x 10<sup>5</sup>
实施例4	2.11x 10<sup>5</sup>
		实施例5	2.27x 10<sup>5</sup>

由上表可知，本发明提出的制备方法制备的米糠多糖铁中的铁离子含量普遍达到18.5％以上，说明米糠多糖铁在载铁量上有显著优势，可以作为补铁剂使用，且由于米糠多糖的易吸收性，说明米糠多糖铁作为补铁剂具有高生物利用度。

(三)DNA凝聚检测

分别取实施例1～5制得的米糠多糖铁溶于pH 7.4的PBS缓冲液制成米糠多糖铁溶液后，将所述米糠多糖铁溶液与GFP质粒按质量比20:1在所述PBS缓冲液中混合，反应30min形成复合物溶液。取10μL复合物溶液加入琼脂糖凝胶的加样孔中，调节电泳仪电压为90V，电流为80mA，40min后取出凝胶。用溴化乙锭染色后，用凝胶成像仪拍照，当观察到加样孔中有明亮的条带，说明米糠多糖铁成功凝聚了GFP质粒，结果如图3所示。

图3中，左起第一条对应为未加米糠多糖铁的槽孔，标记为1～5的凝胶条带分别对应实施例1～5对应的槽孔所形成的条带。由图3可以看出，实施例1～5制得的米糠多糖铁的凝胶电泳条带均被阻滞在槽孔中，而未加米糠多糖铁的槽孔中未出现条带，说明米糠多糖铁成功凝聚了GFP质粒，具有运载核酸的作用，可以作为基因载体应用。

(四)EB-DNA荧光检测

通过溴化乙锭(EB)与DNA结合后会使EB的荧光强度增强的原理来测定的样品与DNA的凝聚能力。分别取浓度为30mg/ml的米糠多糖铁溶液80μL于EP管中，加入30ng/μL DNA50μL，反应30min后，分别向各EP管中加入浓度为0.1μg/μL的EB溶液，反应5min后形成混合溶液，分别取100μL混合溶液于96孔板中，设定激发波长510nm，测定发射波长的范围为550-700nm。结果如图4所示。

由图4可以看出，分别代表加有实施例1～5制得的米糠多糖铁的各混合溶液的五条荧光曲线，发射波长在610nm处有最大荧光吸收，在加入米糠多糖铁后在610nm处的荧光强度明显低于仅加入DNA和EB组，说明混合溶液中与EB结合的DNA量呈现逐渐降低趋近，说明米糠多糖铁成功凝聚了DNA，且凝聚率极高，说明米糠多糖铁对DNA的运载效果强，是一种优质的基因载体。

(五)细胞毒性检测

取Hela细胞(在96孔板中的铺板密度为1x10⁴/孔)置于37℃，5％CO₂条件下培养24h，待细胞达到70-80％汇合度时，加入浓度为1.0mg/ml的样品溶液100μL，相同条件下刺激细胞24h后，加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，相同条件下继续放置4h后，吸去细胞培养液，各孔中加入100μL DMSO溶解细胞生成的formazan晶体，用酶标仪测定570nm出的吸光度值A₁，样品溶液为实施例1～5制备的米糠多糖铁溶于水得到的米糠多糖铁溶液。以未加样品孔的细胞存活率为100％，吸光度值为A₀。细胞存活率按公式1计算，结果如下表二所示。

公式1：细胞存活率(％)＝A₁/A₀×100。

表二各实施例制得的米糠多糖铁的细胞毒性

	Hela细胞存活率(％)
		实施例1	92
实施例2	95
		实施例3	91
实施例4	93
		实施例5	91

由上表可知，各实施例制得的米糠多糖铁制成的溶液浓度为1.0mg/ml时，加入上述米糠多糖铁溶液的样品组内细胞存活率均在90％以上，说明根据正常的药品用量来说，本发明制备的米糠多糖铁使用后对机体不会造成损伤。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取米糠多糖溶于醋酸溶液中，得米糠多糖醋酸溶液；

将六水合氯化铁晶体溶于所述米糠多糖醋酸溶液中，得铸膜液；

将所述铸膜液倒在玻璃板上，让其自然流延成膜后，烘干，得米糠多糖复合膜；

将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁。

2.如权利要求1所述的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述取米糠多糖溶于醋酸溶液中，得米糠多糖醋酸溶液的步骤中，

所述醋酸溶液的质量浓度为1％～2％。

3.如权利要求1所述的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述取米糠多糖溶于醋酸溶液中，得米糠多糖醋酸溶液的步骤中，

所述米糠多糖醋酸溶液中米糠多糖的质量浓度为0.5～0.8％。

4.如权利要求1所述的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将六水合氯化铁晶体溶于所述米糠多糖醋酸溶液中，得铸膜液的步骤中，

所述六水合氯化铁晶体的加入量为每10ml所述米糠多糖醋酸溶液中加入2～4g六水合氯化铁晶体。

5.如权利要求2所述的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将所述铸膜液倒在玻璃板上，让其自然流延成膜后，烘干，得米糠多糖复合膜的步骤中，所述玻璃板为洁净、干燥的玻璃板；和/或，

所述烘干时，烘制温度为40～50℃。

6.如权利要求1所述的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁的步骤中，所述碱液为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.06～0.1mol/L。

7.如权利要求1所述的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁的步骤中，

所述静置的时间为6～7天。

8.如权利要求7所述的米糠多糖铁的制备方法，其特征在于，所述将所述米糠多糖复合膜置于碱液中静置后，经洗涤、干燥，即得米糠多糖铁的步骤中，所述洗涤时，用乙醇、丙酮依次洗涤。

9.权利要求1～8任一项所述米糠多糖铁的制备方法制备的米糠多糖铁在制备补铁剂中的应用。

10.权利要求1～8任一项所述米糠多糖铁的制备方法制备的米糠多糖铁在制备基因载体中的应用。