CN109824753B - 具有ido/tdo双选择性抑制活性的丹参酮iia衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类丹参酮IIA衍生物，或其药学可接受的盐、前药、水合物或者溶剂化合物，以其为活性成分的药物组合物，其在制备治疗IDO或TDO高表达或者活性明显增强的胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，乳腺癌等肿瘤以及肥胖等代谢紊乱疾病的药物中的应用，同时提供了化合物1‑9的制备方法。酶活抑制实验证明：本发明的化合物1‑16对吲哚胺2,3‑双加氧酶IDO和色氨酸2,3‑双加氧酶具有显著的抑制作用，可用于制备IDO或者TDO介导的疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)及色氨酸2,3-双加氧酶双选择性的高效抑制剂丹参酮IIA衍生物及其药用盐，以其为药物有效成分的药物组合物，其在制备治疗胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，乳腺癌等肿瘤以及肥胖等代谢紊乱疾病的药物中的应用。
背景技术
色氨酸属于人体必需氨基酸，只能从饮食中获得，其体内浓度水平被严格控制。色氨酸代谢主要有两种途径，95％的是犬尿氨酸途径，5％经代谢转化为5-羟色胺。色氨酸犬尿氨酸途径涉及一系列的酶促反应，代谢的第一步限速酶由2种酶，即色氨酸-2,3双加氧酶(TDO)或者吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)催化生成N-甲酰犬尿氨酸。正常细胞中IDO低量表达，肿瘤细胞中过量表达或活性明显增强。研究表明肿瘤细胞通过IDO表达抑制抗原特异性T细胞的增生，从而逃避机体的免疫攻击。作为保护者使肿瘤细胞免受T细胞的攻击，形成免疫逃逸，由此IDO辅助肿瘤细胞的生存，侵袭和转移，是肿瘤细胞免疫逃逸过程中及其重要的调控因子。最新研究表明TDO/IDO作为炎症调控因子,代谢中促进炎症反应，引起免疫逃逸和组织新血管生成，促进肿瘤转移发展。单选择性IDO抑制剂作为免疫代谢佐剂提高免疫治疗的疗效已进入临床实验，其抑制剂重建免疫监视和钝化新血管生成，在肿瘤微环境中辅助而非抑制免疫反应形态，清除肿瘤细胞，作为免疫治疗、放疗、化疗或者联合免疫疗法的强有力的佐剂，发挥重要作用。
TDO/IDO在多种肿瘤细胞及周围微环境细胞中表达。据统计，在104种不同来源的肿瘤细胞系中，17种肿瘤细胞仅表达IDO,20种肿瘤细胞表达TDO,16种肿瘤细胞同时表达TDO和IDO(如胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，乳腺癌等)。IDO与TDO表达在不同的肿瘤细胞中，同一肿瘤的不同部位，也有部分肿瘤细胞表达两种蛋白质。因此，针对两种酶的双选择性抑制剂，与仅表达IDO或者TDO的肿瘤细胞应答率31％及34％相比，靶向肿瘤细胞效率大大提高为50％。可以互补性的提高肿瘤免疫治疗的有效性，应对机体的防疫系统，帮助T细胞更好的攻击肿瘤。因此，针对两种酶的双抑制剂，可以大大提高对于肿瘤细胞的应答率，同时抑制TDO和IDO的活性对于提高肿瘤免疫疗法的效果互为补充，而非冗余。
Taleb研究组最新研究(2018)表明在心脑血管疾病和肥胖症中IDO活性显著增强，IDO抑制剂可能通过作用于T细胞来逆转肥胖症。IDO可作为肥胖症等代谢紊乱疾病的潜在治疗靶标。在人胶质母细胞瘤中，TDO持续表达，产生的犬尿氨酸代谢产物作为芳香烃受体的内源性配体，促进肿瘤细胞的存活和迁移，降低抗肿瘤免疫反应。
因此IDO/TDO是肿瘤免疫治疗及肥胖等代谢紊乱疾病治疗的重要靶点，其双选择性高效抑制剂具广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于：提供一类新的丹参酮IIA衍生物，其制备方法，及其药物组合物，以及其在制药中的应用，用于单独或者联合其他肿瘤免疫疗法治疗胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，乳腺癌等肿瘤以及肥胖等代谢紊乱疾病。同时提供化合物10-16作为高效IDO/TDO双抑制剂。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
如下结构通式Ia中所示的丹参酮IIA衍生物，或其药学可接受的盐、前药、水合物或者溶剂化合物，
其中，R1为氢、羰基(＝O)、羟基(-OH)、C2-10酰氧基、C2-10磺酰氧基(-OMs)；
R2为甲基，醛基、羟甲基(-CH2OH)、亚甲基卤素(卤素为氟、氯、溴)、C1-10烷氧基亚甲基、C2-10酰氧基亚甲基、C2-10磺酰氧基亚甲基、-COOR，其中R为C1-10烷基、异氰酸酯基、-CH2NH2/-CH2NR2，其中R为H和C1-10烷基或H和C2-10酰基或都为C1-10烷基；
C1，C2形成单键或者双键。
如所述的丹参酮IIA衍生物，其中作为式Ia所示的化合物的一部分的式Ib-Id为:
其中R2为甲基、醛基、羟甲基(-CH2OH)、亚甲基卤素(卤素为氟、氯、溴)、C1-10烷氧基亚甲基、C2-10酰氧基亚甲基、C2-10磺酰氧基亚甲基、-COOR，其中R为C1-10烷基、异氰酸酯基、-CH2NH2/-CH2NR2，其中R为H和C1-10烷基或H和C2-10酰基或都为C1-10烷基；
C1，C2形成单键或者双键。
如所述的丹参酮IIA衍生物，其中所述的丹参酮类化合物的结构式如下1-9所示：
药物组合物，其中含有所述的丹参酮类衍生物和药学上可接受的载体。
所述的丹参酮类衍生物或药物组合物作为双选择性IDO/TDO抑制剂。
所述的丹参酮类衍生物或药物组合物在制备IDO或TDO介导的疾病的药物中的应用，所述的IDO或TDO介导的疾病指的是IDO或者TDO表达上调或者活性明显增强的疾病，包括但不限于胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，乳腺癌和代谢紊乱相关疾病。
如下结构式IIa所示的一类丹参酮类衍生物在制备治疗胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，乳腺癌和代谢紊乱相关疾病的药物中的应用，
如下结构式IIb-IIe所示的一类丹参酮类衍生物在制备治疗IDO或TDO高表达或者活性明显增强的胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，乳腺癌以及代谢紊乱疾病的药物中的应用，
其中，R2为甲基、醛基、羟甲基(-CH2OH)、亚甲基卤素(卤素为氟、氯、溴)、C1-10烷氧基亚甲基、C2-10酰氧基亚甲基、C2-10磺酰氧基亚甲基、-COOR，其中R为C1-10烷基、异氰酸酯基、-CH2NH2/-CH2NR2，其中R为H和C1-10烷基或H和C2-10酰基或都为C1-10烷基；
R3，R4相同或者不同，各自独立代表氢、氨基、羰基(＝O)、羟基(-OH)、C2-10酰氧基亚甲基、C2-10磺酰氧基亚甲基；
C1，C2形成单键或者双键。
如下结构式所示的丹参酮类化合物10-16在制备治疗IDO或TDO高表达或者活性明显增强的胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，乳腺癌瘤以及代谢紊乱疾病的药物中的应用，
所述的丹参酮类衍生物或药物组合物或结构式IIa、IIb-IIe所示的丹参酮类衍生物或丹参酮类化合物10-16在制备治疗肥胖疾病的药物中的应用。
所述的丹参酮类化合物1-9的制备方法，包括下述步骤：
化合物1的制备：
在双口瓶中加入1mL二氯甲烷，置换反应瓶内空气，在氮气保护下，冷却至-78℃，加入草酰氯(25μL,0.29mmol)，缓慢滴加溶DMSO(41μL,0.58mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，搅拌10min后，加入3(S)-羟基丹参酮IIA(30mg,0.097mmol)的二氯甲烷(2mL)的溶液，搅拌反应40min。TLC监测反应完毕，加入三乙胺(164μL,1.16mmol)搅拌30min，加入二氯甲烷和水稀释反应液，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×5mL)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，剩余物经过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝5:1:1)得到化合物1；
化合物2的制备
将化合物3(S)-羟基丹参酮IIA(20mg,0.064mmol)溶于2mL干燥二氯甲烷中，加入TEA(27μL,0.19mmol)，MsCl(10μL,0.13mmol)，室温下搅拌反应1h，TLC监测反应完毕，加入H2O和二氯甲烷淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机层，饱和氯化钠洗(3×5mL)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，将得到的剩余物硅胶柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯＝50:1)得到化合物2；
化合物3的制备：
将化合物I3(100mg,0.34mmol)溶于4mL乙酸中，加入SeO2(113mg,1.02mmol)升温至140℃回流反应过夜，次日补加SeO2(113mg,1.02mmol)，继续反应。直到TLC监测反应完毕，将反应体系固体过滤干净，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯和水溶解剩余物，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×10mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到的剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5:1)得到40mg化合物3；
化合物4的制备
将化合物3(15mg,0.05mmol)溶于2mL二氯甲烷中，依次加入TEA(11μL,0.075mmol)，Ac2O(5.6μL,0.06mmol)，DMAP(1mg)，室温搅拌反应3h，TLC监测反应完毕，二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和氯化钠洗(3×5mL)，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)得到化合物4；
化合物5的制备
将化合物3(15mg,0.037mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入Dess-Martin氧化剂(19mg,0.045mmol)，室温搅拌反应2.5h，TLC监测反应完毕，加入饱和硫代硫酸钠溶液淬灭反应，搅拌至澄清，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和氯化钠洗(3×5mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到红色固体，硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)得到化合物5；
化合物6的制备
将3(S)-羟基丹参酮IIA(20mg,0.064mmol)溶于2mL二氯甲烷中，依次加入TEA(28μL,0.19mmol)，Ac2O(9μL,0.096mmol)，DMAP(1mg)，室温搅拌反应，TLC监测反应完毕，二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和氯化钠洗(3×5mL)，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得到化合物10，将化合物10(166mg,0.47mmol)溶于4mL 1,4-dioxane中，加入SeO2(130mg,1.2mmol)升温至100℃回流反应过夜，次日补加SeO2(130mg,1.2mmol)继续反应，TLC监测反应完毕，将反应体系固体过滤干净，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯和水溶解剩余物，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×10mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到的剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得到化合物6；
化合物7的制备
将3(S)-羟基丹参酮IIA(166mg,0.53mmol)溶于4mL 1,4-dioxane中，加入SeO2(144mg,1.3mmol)升温至100℃回流反应过夜，次日补加SeO2(144mg,1.3mmol)继续反应，TLC监测反应完毕，将反应体系固体过滤干净，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯和水溶解剩余物，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×10mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到的剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得到化合物15，将化合物15(50mg,0.15mmol)溶于2mL二氯甲烷中，依次加入TEA(64μL,0.46mmol)，Ac2O(21μL,0.2mmol)，室温搅拌反应，TLC监测反应完毕，二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和氯化钠洗(3×5mL)，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得到化合物7；
化合物8的制备
在双口瓶中加入1mL二氯甲烷，置换反应瓶内空气，在氮气保护下，冷却至-78℃，加入草酰氯(25μL,0.29mmol)，缓慢滴加溶有DMSO(41μL,0.58mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，搅拌10min后，加入化合物7(36mg,0.097mmol)的二氯甲烷(2mL)的溶液，搅拌反应40min。TLC监测反应完毕，加入三乙胺(164μL,1.16mmol)搅拌30min，加入二氯甲烷和水稀释反应液，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×5mL)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，剩余物经过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝5:1:1)得到红色固体8；
化合物9的制备：
将化合物8(17mg,0.046mmol)溶解于2mL甲醇/H2O(3:1)中，加入LiOH(2mg,0.092mmol)，在室温下搅拌反应3h，然后加入H2O稀释反应液，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层并用饱和氯化钠洗(3×5mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到剩余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯＝25:1)得到化合物9。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的介绍和说明。
实施例1：
化合物1的制备：
在双口瓶中加入1mL二氯甲烷，置换反应瓶内空气，在氮气保护下，冷却至-78℃，加入草酰氯(25μL,0.29mmol)，缓慢滴加溶DMSO(41μL,0.58mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，搅拌10min后，加入3(S)-羟基丹参酮IIA(30mg,0.097mmol)的二氯甲烷(2mL)的溶液，搅拌反应40min。TLC监测反应完毕，加入三乙胺(164μL,1.16mmol)搅拌30min，加入二氯甲烷和水稀释反应液，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×5mL)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，剩余物经过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝5:1:1)得到化合物1，红色固体26mg，收率为88％。
化合物1:1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.67(d,J＝8.2Hz,1H),7.63(d,J＝8.2Hz,1H),7.27(d,J＝1.0Hz,1H),3.63(t,J＝6.9Hz,2H),2.66(t,J＝7.0Hz,2H),2.28(d,J＝0.7Hz,3H),1.46(s,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:212.70,183.88,175.69,160.98,148.13,142.41,141.77,132.73,128.11,126.51,121.53,121.36,120.42,48.21,36.30,27.11,26.22,8.80.
实施例2：
化合物2的制备
将化合物3(S)-羟基丹参酮IIA(20mg,0.064mmol)溶于2mL干燥二氯甲烷中，加入TEA(27μL,0.19mmol)，MsCl(10μL,0.13mmol)，室温下搅拌反应1h，TLC监测反应完毕，加入H2O和二氯甲烷淬灭反应，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机层，饱和氯化钠洗(3×5mL)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，将得到的剩余物硅胶柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯＝50:1)得到化合物2，红色固体23mg，收率为92％。
化合物2：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.63(d,J＝8.3Hz,1H),7.61(d,J＝8.3Hz,1H),7.25(d,J＝1.0Hz,1H),4.85(dd,J＝7.1,2.4Hz,1H),3.42-3.37(m,2H),3.06(s,3H),2.32-2.18(m,5H,overlap),1.43(s,3H),1.39(s,3H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:183.29,175.24,161.11,146.63,141.69,141.65,133.35,128.27,125.92,121.31,121.02,120.29,84.64,39.03,38.99,30.14,26.32,25.16,24.28,8.78.
实施例3：
化合物3的制备：
将化合物I3(100mg,0.34mmol)溶于4mL乙酸中，加入SeO2(113mg,1.02mmol)升温至140℃回流反应过夜，次日补加SeO2(113mg,1.02mmol)，继续反应。直到TLC监测反应完毕，将反应体系固体过滤干净，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯和水溶解剩余物，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×10mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到的剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝5:1)得到40mg化合物3，产率为37％。
化合物3：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.99(d,J＝10.5Hz,1H),7.83(d,J＝8.2Hz,1H),7.75(d,J＝8.2Hz,1H),7.47(s,1H),6.44(d,J＝10.5Hz,1H),4.71(d,J＝6.6Hz,2H),3.38(t,J＝7.0Hz,1H),1.56(s,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:201.66,183.30,175.46,161.89,151.56,141.38,138.85,132.75,132.49,128.96,128.00,126.12,125.12,123.85,120.05,55.17,48.04,27.54.
实施例4：
化合物4的制备
将化合物3(15mg,0.05mmol)溶于2mL二氯甲烷中，依次加入TEA(11μL,0.075mmol)，Ac2O(5.6μL,0.06mmol)，DMAP(1mg)，室温搅拌反应3h，TLC监测反应完毕，二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和氯化钠洗(3×5mL)，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)得到化合物4，红色固体14mg，收率为86％。
化合物4：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.98(d,J＝10.5Hz,1H),7.82(d,J＝8.2Hz,1H),7.74(d,J＝8.2Hz,1H),7.55(s,1H),6.42(d,J＝10.5Hz,1H),5.24(s,2H),2.11(s,3H),1.51(s,6H).
13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:201.76,183.39,174.38,170.67,160.91,151.30,143.82,138.99,132.61,132.36,128.81,128.06,125.22,123.70,121.16,119.02,56.12,47.99,27.54,20.83.
实施例5：
化合物5的制备
将化合物3(15mg,0.037mmol)溶于2mL二氯甲烷中，加入Dess-Martin氧化剂(19mg,0.045mmol)，室温搅拌反应2.5h，TLC监测反应完毕，加入饱和硫代硫酸钠溶液淬灭反应，搅拌至澄清，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和氯化钠洗(3×5mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到红色固体，硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)得到化合物5(11mg，收率为75％)。
化合物5：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:10.33(s,1H),9.00(d,J＝10.5Hz,1H),8.16(s,1H),7.88(d,J＝8.1Hz,1H),7.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.46(d,J＝10.5Hz,1H),1.52(s,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:200.41,183.46,181.57,173.10,160.61,151.16,147.36,137.58,132.06,131.54,128.18,126.30,124.87,124.19,123.01,116.73,47.09,26.51.
实施例6：
化合物6的制备
将3(S)-羟基丹参酮IIA(20mg,0.064mmol)溶于2mL二氯甲烷中，依次加入TEA(28μL,0.19mmol)，Ac2O(9μL,0.096mmol)，DMAP(1mg)，室温搅拌反应，TLC监测反应完毕，二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和氯化钠洗(3×5mL)，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得到化合物10。
将化合物10(166mg,0.47mmol)溶于4mL 1,4-dioxane中，加入SeO2(130mg,1.2mmol)升温至100℃回流反应过夜，次日补加SeO2(130mg,1.2mmol)继续反应，TLC监测反应完毕，将反应体系固体过滤干净，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯和水溶解剩余物，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×10mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到的剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得到化合物6，红色固体88mg，收率为51％。
化合物6：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.66(d,J＝8.2Hz,1H),7.63(d,J＝8.2Hz,1H),7.41(s,1H),5.04-4.95(m,1H),4.67(s,2H),3.31(t,J＝6.6Hz,2H),2.08-2.01(m,5H,overlap),1.34(s,3H),1.33(s,3H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:182.60,175.64,170.71,162.87,148.82,143.27,140.82,133.61,127.39,125.92,125.90,121.15,119.68,75.68,55.21,38.52,30.10,25.98,25.50,22.96,21.18.
实施例7：
化合物7的制备
将3(S)-羟基丹参酮IIA(166mg,0.53mmol)溶于4mL 1,4-dioxane中，加入SeO2(144mg,1.3mmol)升温至100℃回流反应过夜，次日补加SeO2(144mg,1.3mmol)继续反应，TLC监测反应完毕，将反应体系固体过滤干净，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯和水溶解剩余物，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×10mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到的剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得到化合物15，红色固体90mg，收率为52％。
将化合物15(50mg,0.15mmol)溶于2mL二氯甲烷中，依次加入TEA(64μL,0.46mmol)，Ac2O(21μL,0.2mmol)，室温搅拌反应，TLC监测反应完毕，二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机相，饱和氯化钠洗(3×5mL)，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到剩余物经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)得到化合物7，红色固体41mg，收率为73％。
化合物7：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.65(d,J＝8.1Hz,1H),7.58(d,J＝8.1Hz,1H),7.46(s,1H),5.20(s,2H),3.76(d,J＝6.3Hz,1H),3.45–3.32(m,1H),3.31–3.15(m,1H),2.08(s,3H),2.06–1.98(m,1H),1.95–1.86(m,1H),1.33(s,3H),1.32(s,3H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:182.64,174.52,170.67,161.92,149.42,143.23,143.20,133.83,127.27,125.94,120.88,120.83,118.45,73.86,56.28,39.83,29.29,26.22,26.15,25.17,20.82.
实施例8：
化合物8的制备
在双口瓶中加入1mL二氯甲烷，置换反应瓶内空气，在氮气保护下，冷却至-78℃，加入草酰氯(25μL,0.29mmol)，缓慢滴加溶有DMSO(41μL,0.58mmol)的二氯甲烷(1mL)溶液，搅拌10min后，加入化合物7(36mg,0.097mmol)的二氯甲烷(2mL)的溶液，搅拌反应40min。TLC监测反应完毕，加入三乙胺(164μL,1.16mmol)搅拌30min，加入二氯甲烷和水稀释反应液，用二氯甲烷萃取(3×10mL)，合并有机层，饱和食盐水洗(3×5mL)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，剩余物经过硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝5:1:1)得到红色固体8，30mg，收率为83％。
化合物8：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.67(d,J＝8.0Hz,1H),7.63(d,J＝8.0Hz,1H),7.50(s,1H),5.20(s,2H),3.60(t,J＝6.8Hz,2H),2.63(t,J＝6.8Hz,2H),2.08(s,3H),1.44(s,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:212.37,183.03,174.68,170.58,161.35,148.74,143.51,142.70,132.79,127.57,126.47,121.67,121.02,118.83,56.18,48.21,36.17,27.05,26.20,26.20,20.79.
实施例9：
化合物9的制备：
将化合物8(17mg,0.046mmol)溶解于2mL甲醇/H2O(3:1)中，加入LiOH(2mg,0.092mmol)，在室温下搅拌反应3h，然后加入H2O稀释反应液，用乙酸乙酯萃取(3×15mL)，合并有机层并用饱和氯化钠洗(3×5mL)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到剩余物经硅胶柱层析(二氯甲烷/乙酸乙酯＝25:1)得到化合物9，收率为67％。
化合物9：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.66(d,J＝8.1Hz,1H),7.44(s,1H),4.69(s,2H),3.64(t,J＝6.9Hz,2H),2.67(t,J＝6.9Hz,2H),1.47(s,6H).
13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:212.31,183.00,175.86,162.42,149.07,142.92,141.06,132.94,127.53,126.44,125.99,121.88,119.95,55.16,48.27,36.18,29.67,27.08,26.24.
实施例10：
分别测试评价化合物1-16对于IDO/TDO的抑制活性，
(1)实验方法如下：
1.1IDO/TDO的基因克隆、表达与纯化
经过密码子优化的人源IDO DNA片段通过体外PCR扩增，构建到载体pET28a中。通过基因测序来确定插入片段及构建载体的正确性。测序结果正确之后，将质粒转化到BL21Star(DE3)来进行蛋白质的表达与纯化。
在蛋白质的表达纯化过程中，比较重要的实验参数如下：过夜培养物在LB培养液中OD600至0.6-0.8之间，加入5-氨基酮戊酸(ALA)至终浓度0.5mM,将转速调至120rpm,半小时之后加入IPTG至终浓度为0.5mM,30℃诱导6h即可收集菌体。将菌体重悬后，在冰浴条件下超声破碎菌体直至细胞悬浮液接近澄清，4℃高速离心将蛋白质溶液与沉淀分离，经SDS-PAGE电泳检测上清中蛋白质表达量。
蛋白质的纯化及浓度测定
载体pET28a的N端有His-tag融合标签，因此蛋白质通过His-tag亲和柱纯化，纯化后的蛋白质进行浓缩，检测蛋白质的纯度。如果蛋白质纯度不够高，使用分子筛SuperdexG75进一步进行纯化，最终蛋白质纯度达到90％以上。
通过BCA Protein Assay Kit来检测蛋白质的浓度。每次检测过程中，使用不同的稀释浓度同时进行检测，确保浓度检测过程中的误差。
TDO的基因克隆、蛋白质表达纯化参考上述IDO实验方法稍作调整。
1.2活性实验
反应体系为200uL，其中20uL的0.5M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40uL的0.2M抗坏血酸，8uL的0.5mM的亚甲基蓝，8uL的5mg/ml的过氧化氢酶，15uL的L-色氨酸，120uL的ddH2O。各组分的终浓度分别为：50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5),40mM抗坏血酸，200ug/ml过氧化氢酶，20uM亚甲基蓝，300uM底物L-色氨酸和待测样品混合。
将上述混合液37℃预热5min，加入不同浓度的IDO1或者TDO蛋白质，终浓度为0-0.3uM。将上述反应体系在37℃孵育30分钟，酶促反应后加入母液浓度为30％(w/v)的三氯乙酸至终浓度为9％，终止反应。混合物在65℃加热15分钟，使之完成从N-甲酰犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化。反应液冷却之后，将混合液离心10min(转速12000rpm)。取上清液转移至96孔板中，与同体积的2％(w/v)的对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶标仪读取490nm吸光值。
1.3抑制实验
根据上述活性实验，获得抑制实验需使用的蛋白质IDO或者TDO的最佳工作浓度，一般为0.1uM左右。使用此蛋白质浓度继续进行后续的酶学抑制实验。
反应体系为200uL，其中20uL的0.5M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40uL的0.2M抗坏血酸，8uL的0.5mM的亚甲基蓝，8uL的5mg/ml的过氧化氢酶，15uL的L-色氨酸，120uL的ddH2O以及不同浓度的待测化合物(化合物1-16)。各反应组分的终浓度与上述活性实验一致，DMSO的最终浓度控制为2％以内。
空白对照I：以15uL ddH2O代替15uL L-色氨酸
空白对照II：以同体积的ddH2O代替IDO或者TDO重组蛋白质
阴性对照III：以同体积的ddH2O代替待测化合物，即待测化合物浓度为0
阳性对照IV：在每次抑制实验过程中，以1-甲基-L-色氨酸小分子作为阳性对照。1-甲基-L-色氨酸的浓度分别为0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.6,0.8和1mM
将上述混合液37℃预热5min，加入IDO1或者TDO重组蛋白质，终浓度为0.1uM。将上述反应体系在37℃孵育30分钟，酶促反应后加入三氯乙酸至终浓度为9％(w/v)终止反应。混合物在65度加热15分钟，之后冷却，离心10min(转速12000rpm)。取上清液转移至96孔微量滴定板中，与同体积的2％(w/v)的对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，用酶标仪读取490nm犬吸光值。
通过490nm吸光值原始数据，计算化合物不同浓度点对IDO/TDO酶活性的抑制，采用GraphPad Prism软件对抑制率数据进行非线性拟合分析得到化合物的半数抑制浓度IC50值。
(2)实验结果：
本发明实施例化合物1-16的活性通过以上测试方法进行测定，酶学IDO和TDO的抑制活性IC50值结果见下表：
表1化合物1-16的活性结果
实验结果表明化合物1-16为IDO/TDO双选择性抑制剂，具有较强的2，3-双加氧酶抑制活性。
实施例11：
化合物1-16，与赋形剂重量比1:1的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例12：
化合物1-16，按常规胶囊制剂方法制成胶囊。
实施例13：
按下述配方制成片剂
片剂：化合物1-16 100mg
淀粉适量
玉米浆适量
硬脂酸镁适量
实施例14：
胶囊剂：化合物1-16 100mg
淀粉适量
硬脂酸镁适量
制备方法：将化合物1-16，与助剂混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊。
实施例15：
安瓿剂：化合物1-162mg，氯化钠10mg；
制备方法：将化合物1-16和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。
Claims (6)
1.如下结构通式所示的丹参酮IIA衍生物，或其药学可接受的盐：
其中，R为氢或乙酰基。
2.药物组合物，其中含有权利要求1所述的丹参酮IIA衍生物和药学上可接受的载体。
3.如下式所示的丹参酮IIA衍生物在制备双选择性IDO/TDO抑制剂中的应用；
其中，R为氢或乙酰基。
4.如下式所示的丹参酮IIA衍生物在制备IDO和TDO同时介导的疾病的药物中的应用，所述的IDO和TDO同时介导的疾病指的是IDO和TOD表达上调或者活性明显增强的疾病；
其中，R为氢或乙酰基。
5.如下结构式所示的一类丹参酮IIA衍生物作为双选择性IDO/TDO抑制剂在制备治疗胶质母细胞瘤，间皮瘤，头颈癌，非小细胞肺癌，膀胱癌，和乳腺癌的药物中的应用，
其中，R为氢或乙酰基。
6.权利要求1所述的丹参酮IIA衍生物的制备方法，包括下述步骤：
化合物3的制备：
将300mg,1.02mmol的丹参酮IIA溶于10mL分析纯四氯化碳中，依次加入黄色的190mg,1.07mmol的NBS和17mg,0.1mmol的AIBN，升温回流反应6h，TLC监测反应完毕，直接蒸干溶剂，加入二氯甲烷和水溶解剩余物，用3×20mL的二氯甲烷萃取，合并有机层，3×15mL的饱和硫代硫酸钠洗，3×15mL的饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到的剩余物经硅胶柱层析得到化合物I3，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯/二氯甲烷＝30:1:1～5:1:1；将100mg,0.34mmol化合物I3溶于4mL乙酸中，加入113mg,1.02mmol的SeO2升温至140℃回流反应过夜，次日补加113mg,1.02mmol的SeO2，继续反应；直到TLC监测反应完毕，将反应体系固体过滤干净，蒸干溶剂，加入乙酸乙酯和水溶解剩余物，用3×15mL的乙酸乙酯萃取，合并有机层，3×10mL的饱和食盐水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到的剩余物经硅胶柱层析得到40mg化合物3，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯＝5:1；
化合物4的制备
将15mg,0.05mmol的化合物3溶于2mL二氯甲烷中，依次加入11μL,0.075mmol的TEA，5.6μL,0.06mmol的Ac2O，1mg的DMAP，室温搅拌反应3h，TLC监测反应完毕，3×10mL的氯甲烷萃取，合并有机相，3×5mL的和氯化钠洗，得到的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到剩余物经硅胶柱层析得到化合物4，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯＝3:1。
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