CN1098237C - 一种用于微生物肥料的浓缩菌种粉及其制造方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型微生物肥料菌种剂制造方法的新工艺，即将产芽孢的固氮菌、磷细菌和钾细菌培养发酵后经板框过滤机脱水，再在低于80℃的热风中干燥制成浓缩芽孢粉。用此法制成的菌种粉含芽孢浓度高(100亿个/克)、工艺简单、成本低、经济有效、耐贮存、运输方便，可集中生产菌种供应各地微生物肥料厂，大大减少乡镇企业菌肥厂对菌种生产的投资，利于微生物肥料的发展和推广应用。

Description

一种用于微生物肥料的浓缩菌种粉及其制造方法和应用

本发明涉及一种新型微生物肥料菌种剂制造方法的新工艺。更具体地说，本发明涉及一种将含有固氮芽孢菌的新型微生物肥料菌种剂制成浓缩干燥的芽孢粉的新工艺和新方法。

在前一项发明专利《固氮芽孢菌肥及其制造方法》(专利申请号95117432·0)申请书中，采用下述一种含有固氮芽孢菌的新型微生物肥料及其制造方法：(a)选用国内新分离出特有的能产生芽孢的固氮芽孢菌种(Bacillus azotofixans)及已知的产芽孢的磷细菌和钾细菌菌种，在发酵罐中大量发酵培养形成芽孢；(b)将三种发酵菌液与经过杀菌处理的生活污泥及禽畜粪等有机物基质按一定比例混合，在机械设备中制造成圆球形颗粒；(c)经60～80℃烘干后，制成含有大量固氮菌、磷细菌及钾细菌芽孢的微生物有机复合生物肥料。此法的优点是能制造出含有芽孢的固氮菌、磷细菌和钾细菌颗粒肥料，可耐高温干燥和贮存。但不足之处是所有菌种发酵液只宜在本厂自产自用，经发酵培养的菌种液体积大，难于包装运输到其它菌肥厂和当地有机肥原料混合加工成颗粒菌肥；而各地乡镇企业要生产此种菌肥，势必都要自行建立菌种厂发酵生产菌种。如此，则需成倍增加各地同类生物肥料厂的设备投资和技术力量，而在乡镇企业资金不足和发酵技术人员缺乏情况下，如无菌种来源势必影响到复合生物肥料的发展和推广应用。

鉴于上述现有技术存在不足之处，本发明更进一步研究改进菌种制造方法，将菌种发酵液浓缩干燥成干菌种粉，其目的在于提供一种最经济有效的能将固氮芽孢菌、磷细菌和钾细菌菌种发酵液加工浓缩制成含有高浓度(每克含芽孢100亿个)芽孢菌种粉的制作方法。浓缩加工制成的芽孢菌种粉可长期贮存备用：(1)供本厂周年自用作为扩制颗粒菌肥的菌种；(2)经包装运输到各地乡镇企业生物肥料厂加工扩制成颗粒菌肥之用，各地同类企业不需另投资建立菌种厂；(3)用作为菌肥拌种剂，每亩只用20克干菌粉，含有效菌2000亿个，比现有各地推广应用的草炭菌肥拌种剂每亩用量0.5～1公斤(含菌500～1000亿个)用量少而有效菌量增加1～4倍。

经过试产比较，本发明采用板框过滤后热风干燥成粉方法浓缩菌种芽孢，比其它浓缩方法(如喷雾干燥或高速离心法)更节省能源和成本而回收率高，因而是一种最经济有效的微生物肥料菌种粉制造新技术。

本发明的目的可以通过以下技术措施实现：

一、菌种发酵培养技术

(一)菌种

1.固氮芽孢杆菌：采用前项发明专利申请书(95117432·0)中的专利菌种CN9506。固氮芽孢杆菌CN9506已于1995年8月4日在中国专利局指定保藏单位一中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，编号为CCTCC M95040。此后将这一菌株称作固氮芽孢杆菌CCTCC M95040，为便于叙述，本文将这一菌株简称为“固氮菌”。

本发明所用固氮菌特点为固氮酶活性高(1100-3200毫微克分子乙烯/毫克蛋白/小时)，能产生休眠芽孢，可耐受80℃高温干燥；制作芽孢粉后密封保存不易污染杂菌而变质，可长期贮存备用。

2.磷细菌：所述磷细菌是指巨大芽孢杆菌(Bacilllusmegatherium)ACCC 10010，因其能分解土壤难溶性磷，因此俗称为磷细菌。磷细菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(ACCC)保藏，编号为ACCC10010，公众可按保藏号向该保藏中心购买磷细菌。

3.钾细菌：所述钾细菌是指胶冻样芽孢杆菌(Bacilllus mu-cilaginosus)ACCC10013此菌具有分解土壤矿物中钾素能力，因此俗称钾细菌。钾细菌已在农业微生物中心保藏，编号为AC-CC10013，公众可按号索取。

(二)培养发酵条件：包括上述固氮菌、磷细菌和钾细菌菌种的培养发酵条件。

1.固氮菌的培养发酵可使用公知的培养条件和方法。一般培养时间是20～24小时，培养温度是25～30℃，培养pH是7.0～7.4，通气量0.5～1∶1立方米/1000升，搅拌速度200～300转/分。本菌种优选的培养时间是30小时形成芽孢，培养温度32℃，培养pH7.7，通气量0.5-1∶1立方米/1000升，罐压0.5kg/cm²，搅拌速度200转/分。其优选培养基如下：

筛选及保存菌种用无氮培养基：

蔗糖                            1.00％

酵母膏                          0.10％

硫酸镁(MgSO₄)                  0.05％

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)            0.02％

磷酸氢二钾(K₂HPO₄)            0.008％

氯化钠(NaCl)                    0.001％

碳酸钙(CaCO₃)                  0.50％

钼酸钠(Na₂MoO₄)               0.0005％

硫酸亚铁(FeSO₄)                0.00015％

琼脂                            2.0％

pH＝7.7

用于CCTCC M95040固氮菌的摇瓶培养和发酵生产的培养基是在上述无氮培养基的基础上另加如下成份：

玉米粉                          1％

蛋白胨                          0.1％

硫酸铵                          0.1％

2.磷细菌的培养及发酵条件按已出版的《磷细菌》(陈廷伟等编，农业出版社，1959年，北京)一书中的方法进行。

磷细菌大量培养发酵的培养基为：淀粉3％，豆饼粉1％，蛋白胨0.1％，硫酸铵0.2％，磷酸氢二钾0.2％，酵母粉0.1％，碳酸钙0.01％，pH＝7.2-7.4。其余发酵条件与固氮芽孢菌相同。

3.钾细菌培养和发酵条件按已出版的《钾细菌》(陈廷伟编，农业出版社，1959年，北京)一书中的方法进行。

钾细菌大量培养发酵的培养基为：淀粉10％，豆饼粉10％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸铵0.1％，硫酸镁0.05％，三氯化铁0.001％，碳酸钙0.01％，酵粉0.01％，pH＝7.2-7.4。其余发酵条件与固氮芽孢菌  磷细菌相同。

二、芽孢菌种浓缩干燥成粉技术

1.发酵液吸附处理

在固氮菌、磷细菌和钾细菌培养发酵25～30小时，经显微镜检查三种菌体的芽孢形成率，当芽孢率达到80％以上且有20％芽孢从孢囊中脱出之时即可停止发酵。然后将三种菌的发酵液放入贮存池中混合，加入20％左右的轻质碳酸钙作为吸附菌体的载体，搅拌30分钟后菌体充分吸附在载体上。

加入到发酵液中的吸附剂数量根据以下公式计算：

吸附剂加入量(公斤)＝

2.板框压滤浓缩：

将经过吸附处理的发酵液以0.2MPa(2公斤/平方厘米)左右，最高0.6MPa的压力，由贮存罐中压入板框压滤机，通过7号滤布过滤，将吸附有菌体的载体(碳酸钙)留在板框内，即可脱水成为含有浓缩芽孢菌体的滤饼。过滤结束时，再通入0.2MPa压缩空气吹干滤饼15分钟尽量去除滤饼中水分，然后下板框取滤饼。将滤饼分成小块，放在铁丝网框架上送到烘干房。

3.热风干燥

采用隧道式烘房热风干燥设备。以蒸气散热片或管道为热源，经鼓风机将干热空气吹入隧道式烘房内，使铁丝网框架上载有菌体滤饼碎块在60℃～80℃热风气流中将水分快速蒸发烘干。隧道进口热风温度≤80℃，出口温度≥50℃，经3～4小时即可使滤饼块烘干至含水量低于5％的干块。

4.粉碎包装

将烘干后的含芽孢菌体的干滤饼块在粉碎机中打碎，通过80目筛制成干芽孢菌粉后即可包装贮存备用。

三、芽孢干菌粉含菌数检测

按照常规的稀释平板计数法检测干菌粉中的活芽孢菌数。称取干菌粉1.00克，加入到99毫升元菌水中稀释到适当浓度(每毫约含有菌数20～200个)，然后移取1毫升稀释菌液加入到无菌的培养甲皿中，分别加入适量溶化后的固氮菌或磷细菌或钾细菌培养基，充分混合冷凝后形成平板，在30℃保温箱中培养二天，计算培养皿平板上的菌落数。每种菌的计数平板重复3次，取计数平板上生长出的平均菌落数，乘以样品稀释倍数即为每克干菌粉中有的活菌数(即活芽孢数)，其计数公式如下：

     干菌粉活芽孢数

                  ＝平均每个平板菌落数(个)×

        (亿个/克)

                    样品稀释倍数(个/克)

干菌粉成品质量要求：

3种菌活芽孢数总含量：≥100×10⁸(亿个/)(克其中固氮菌、磷细菌、钾细菌各约占1/3)

干菌粉含水量：＜5％

干菌粉细度：95％以上过80目筛孔

下面结合实施例说明本发明：

实施例1(固氮菌芽孢粉)

1.固氮菌种培养发酵

将固氮芽孢杆菌CCTCC M95040接种到盛有1000ml的如前所述的用于本发明固氮菌培养基的三角瓶中摇瓶培养16小时，然后按1％接种量接种到200升种子发酵罐中，通气(1∶0.5)，搅拌30℃保温培养16小时，再按10％接种量接种到2000升大发酵罐中，同样条件培养20小时后升温到35℃并加大通气量(1∶1)再培养10小时待菌体芽孢形成率达80％并有20％芽孢从孢囊中脱出后即可出罐成为产芽孢固氮菌种发酵液。

2.芽孢菌种浓缩干粉的制备

将形成芽孢的固氮菌发酵液放入贮存罐中，加入20％轻质碳酸钙，搅拌30分钟后菌体芽孢充分吸附在碳酸钙上，然后以0.2MPa压力由贮罐中压入板框压滤机，经1小时左右即可滤去水分而将吸附芽孢菌体的碳酸钙留在板框滤布内成为含菌滤饼块。然后将滤饼块碎成小块，送到烘干房经60～80℃热风干燥至含水量低于5％的干块，再经粉碎过筛即可包装贮存备用。按此法制备成的菌种干粉应含芽孢数100亿个/克，干燥贮存二年活性保持80％以上。

按本发明制成的菌种粉可供本厂或外厂和有机肥基质混合加工成颗粒菌肥或以菌种粉作为农作物的拌种剂应用。

3.和有机肥基质混合加工造粒成颗粒菌肥

将城市生活污泥60kg和鸡粪30kg粉碎过80目筛，经200℃热风滚筒烘干杀灭病菌和虫卵，然后加入10kg硫酸铵混合成为肥料基质。在上述肥料基质中加入0.5～1％如前述步骤制成的固氮菌芽孢粉充分混合，在成球盘中喷加20％水分滚动制成直径3～5mm球形颗粒，再经80℃热风滚筒干燥即制成颗粒状固氮菌肥。本产品含有固氮芽孢菌0.5～1亿/克，干燥贮存二年活性保持80％以上。

实施例2(磷细菌芽孢粉)

按前述磷细菌培养基和实施例1所述方法培养磷细菌发酵液，再经同法板框过滤和烘干制成浓缩加工的磷细菌芽孢粉。制成的磷细菌菌种粉含磷细菌芽孢100亿个/克，可供本厂或外地菌肥厂作菌种，如实施例1所述，按0.5～1％比例加入到有机肥基质即可制成颗粒状磷细菌肥，每克颗粒菌肥含磷细菌0.5～1亿个。

实施例3(钾细菌芽孢粉)

按前述钾细菌培养基和实施例1中所述方法培养钾细菌发酵液，再经同法板框过滤和烘干制成浓缩干燥的钾细菌菌种粉。浓缩后的钾细菌干粉含钾细菌芽孢100亿个/克，可供本厂或外地工厂作为制作菌肥的菌种。如实施例1-3中所述方法，按0.5～1％比例加入到有机肥基质中混合造粒，即可制成颗粒钾细菌肥料，每克成品含钾细菌0.5～1亿个。

实施例4(复合菌芽孢粉)

按实施例1、例2及例3中所述方法分别发酵培养固氮芽孢杆菌CCTCC M95040及磷细菌和钾细菌菌种，形成芽孢后放入贮存罐中再加入20％碳酸钙，搅拌30分钟后碳酸钙充分吸附芽孢菌体。然后将混合菌液及吸附剂压入板框过滤机，脱水浓缩成滤饼，再经烘十、粉碎过筛制成含有固氮菌、磷细菌和钾细菌三菌混合的芽孢菌粉。三种菌复合的芽孢粉含有芽孢100亿个/克。

如实施例1～例3所述，在有机肥基质中加入0.5～1％复合菌芽孢粉即可制成含有固氮菌、磷细菌和钾细菌的有机一微生物复合菌肥颗粒肥料。此种产品含三种复合菌0.5～1亿个/克，符合目前我国农业部颁发的微物肥料行业标准(NY227-94)中颗粒状复合微生物肥料含有效菌要求。

本发明制得的复合微生物肥料经农业部全国农业技术推广总站于1994年在21省(市、区)的23个县(市)点试验，有增产效果的85.7％(参见全国农业技术推广总站〔1995〕(农技术3)字第05号文)。全国农业技术推广服务中心于1995年在18个省(市、区)的21个县对二十多种作物试验，增产效果比较明显的占97.4％，大多数增产10～30％(参见〔1996〕农技(粮油)函字第30号文)。

Claims (4)

1、一种固氮菌芽孢菌种粉，其特征在于它含有干燥浓缩的固氮菌芽孢粉，所述的固氮菌为固氮芽孢杆菌(Bacillus azotofixans)CCTCC M95040菌种，它含芽孢数100亿个/克，可耐80℃高温干燥、耐贮存二年以上、便于运输。

2、一种微生物肥料复合芽孢菌种粉，其特征在于它含有干燥浓缩的菌种芽孢粉，所述菌种为：(1)固氮芽孢杆菌(Bacillus azotofixans)CCTCC M95040(2)巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)ACCC 10010(3)胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)ACCC10013以上三种菌种制成的芽孢粉的芽孢含量各占1/3，含芽孢总数100亿个/克。

3、一种制备权利要求1或2所述菌种粉的方法，其特征在于将菌种培养发酵，当芽孢率达到80％以上且有20％芽孢从孢囊中脱出后即可停止发酵，然后向发酵液中加入20％的轻质碳酸钙吸附，经板框过滤机脱水浓缩，再在60-80℃热风中干燥成含水量＜5％的芽孢粉。

4、一种权利要求1或2所述菌种粉的应用，其特征在于可在微生物肥料生产用作菌种母剂，并可按0.5-1％比例添加到有机肥中混合，用于制备颗粒状微生物肥料。