CN112375709A - 两元微生物复合菌剂及制备方法 - Google Patents

两元微生物复合菌剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种两元微生物复合菌剂，有效活菌数含量≥5×108 cfu/mL的液体复合发酵菌，包括所述液体复合发酵菌包括液体兼氧芽孢杆菌和液体高温固氮菌，且两种菌的适应温度均包括30℃～55℃。所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的体积比为7:3～9:1，且所述液体兼氧芽孢杆菌的浓度为5.5×108 cfu/mL～1.0×109 cfu/m，所述液体高温固氮菌的浓度为0.5×108 cfu/mL～1.0×108 cfu/mL。本发明还提供一种上述两元微生物复合菌剂的制备方法。上述两元微生物复合菌剂用于发酵有机废弃物时可以实现免翻堆，同时还可以实现有效减少氮素挥发损失。

Description

两元微生物复合菌剂及制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法，尤其涉及一种两元微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术
有机肥主要以有机废弃物为原料，并与土壤亲和，容易吸收，效果良好，而且对土壤性质的影响相对较小，所以有机肥的研究和使用是农业发展的一个趋势。目前有机肥主要通过对有机废弃物进行厌氧发酵或好氧发酵的方式制备。现有的厌氧发酵中有机质分解缓慢，有机肥生产效率低，一般需要数月，且厌氧发酵所需设备要求高、投资大。现有的好氧发酵有机物分解效率高，堆肥周期短，但发酵过程需要持续供氧，运行成本高。
为此，绵阳市国本农业科技有限公司于2017年7月3日申请的、申请号为CN2017105335274的中国发明专利申请中公开了一种兼氧发酵菌剂及其用于制造有机肥的方法。其中，所述兼氧发酵菌剂利用兼氧发酵菌群制备而成，所述兼氧发酵菌群包括以下组分：乳酸菌、嗜酸乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、米曲霉、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、粪链球菌、光合菌、酵母菌和淡紫拟青霉菌、固氮菌、放线菌。所述兼氧发酵菌剂在用于制造有机肥的过程中，需要将混匀后的堆肥物料进行堆肥发酵，定期翻抛，待发酵槽内无粪便臭味、含水率降低至30％及以下即完成堆肥物料的兼氧发酵；其中，所述堆肥物料在发酵槽内发酵的总时间为20～30天，且翻抛频率为每隔50～72小时翻抛一次。
上述发明专利申请中公开的兼氧发酵菌剂虽然能够适用于有机肥的兼氧发酵，且能够高效转化有机质并抑制有害菌生长；但是其在用于制造有机肥的过程中，仍需要翻堆多次用于增加物料中氧气含量，促进发酵进程，使得发酵成本增加，同时发酵高温阶段解氨菌大量繁殖，氮素挥发损失较大。
发明内容
有鉴于此，本发明确有必要提供一种两元微生物复合菌剂及其制备方法，以解决上述问题。
本发明提供的技术方案为：一种两元微生物复合菌剂，包括有效活菌数含量≥5×108cfu/mL的液体复合发酵菌，所述液体复合发酵菌包括液体兼氧芽孢杆菌和液体高温固氮菌，且所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的适应温度均包括30℃～55℃。
基于上述，所述液体兼氧芽孢杆菌中的兼氧芽孢杆菌菌株来源于淤泥，其筛选方法包括：(1)将淤泥自然风干并加入无菌水中静置；(2)进行 75℃～90℃水浴处理，并冷却获得淤泥混合物；(3)所述淤泥混合物进行摇床培养处理，形成兼氧芽孢杆菌原菌液；(4)采用梯度稀释法对所述兼氧芽孢杆菌原菌液进行肉汤平板培养，在第一平板上获得兼氧芽孢杆菌一代菌落；5)挑取所述第一平板中所述兼氧芽孢杆菌一代菌落比较大的菌种进行液体三角瓶培养，并从浑浊度较强的三角瓶中选取兼氧芽孢杆菌单菌株；6)对所述兼氧芽孢杆菌单菌株进行温度适宜范围验证试验，从中选取温度适应范围为30℃～55℃的菌株为最终的目标兼氧芽孢杆菌菌株。
基于上述，所述液体高温固氮菌中的高温固氮菌菌株来源于花生地的土壤，其筛选方法包括：(1)将花生地的土壤自然风干并加入无菌水中静置，然后进行摇床处理，并二次静置获得上清菌液；(2)对所述上清菌液接入无氮液体培养基中，先在45℃～50℃进行培养，再降温至42℃～38℃进行培养，获得高温固氮菌原菌液；(3)采用梯度稀释法对所述高温固氮菌原菌液进行无氮培养基固体平板培养，在第二平板上获得高温固氮菌一代菌落；(4)挑取所述第二平板中所述高温固氮菌一代菌落比较大的菌种进行无氮斜面培养基培养，得到高温固氮菌单菌株；(5)对所述高温固氮菌单菌株进行温度适宜范围验证试验，从中选取温度适应范围为30℃～55℃的菌株为最终的目标高温固氮菌菌株。
基于上述，所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的体积比为 7:3～9:1，且所述液体兼氧芽孢杆菌的浓度为5.5×108cfu/mL～1.0×109 cfu/mL，所述液体高温固氮菌的浓度为0.5×108cfu/mL～1.0×108cfu/mL。
优选地，所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的体积比为 3:1～9:1，例如，3:1、4:1、5:1、17:3、6:1、7:1、8:1、9:1等。
基于上述，所述两元微生物复合菌剂还包括菌株活性保护剂，该菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为1:19～9:41。
基于上述，所述菌株活性保护剂包括质量百分比浓度为80％～100％的糖蜜和质量百分比浓度为40％～60％的氨基酸，其中，所述糖蜜与氨基酸的质量比为13:7～9:1。具体地，所述糖蜜与氨基酸的质量比可以为13:7、 7:3、3:1、4:1、17:3、8:1或9:1等。
基于上述，所述菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为 1:9～3:17。
本发明还提供一种上述两元微生物复合菌剂的制备方法，包括步骤：
液体兼氧芽孢杆菌的制备采用枯草芽孢杆菌扩培培养用的培养基于45℃～55℃扩培培养兼氧芽孢杆菌，获得液体兼氧芽孢杆菌；
液体高温固氮菌的制备将高温固氮菌菌株接种至无氮培养基中，在 38℃～44℃进行扩培培养，获得液体兼氧芽孢杆菌；
复合发酵菌剂的制备将所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体兼氧芽孢杆菌均匀混合，制备所述两元微生物复合菌剂。
基于上述，所述复合发酵菌剂的制备步骤还包括将菌株活性保护剂、所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体兼氧芽孢杆菌均匀混合的步骤，其中，所述菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为1:19～9:41。
基于上述，所述菌株活性保护剂的制备方法包括将质量百分比浓度为80～100％的糖蜜和质量百分比浓度为40％～60％的氨基酸按照质量比 13:7～9:1均匀混合的步骤。
本发明提供的上述两元微生物复合菌剂为棕黄色酸香味液体，其中的兼氧芽孢杆菌和高温固氮菌都属于兼氧发酵菌，而且适应温度为30℃～55℃的温度，所述兼氧芽孢杆菌和高温固氮菌既能在有机废弃物发酵中温阶段生长，又能在有机废弃物发酵高温阶段生长，适应温度范围比较广，完全可以适应动物粪便、农作物秸秆、农作物下脚料、污泥或厩肥等有机废弃物发酵过程中的温度变化，保障有机废弃物的发酵进程的有效进行，所以，所述两元微生物复合菌剂用于发酵有机废弃物时可以实现免翻堆。
进一步，通过调整所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体兼氧芽孢杆菌的配比，使得两元微生物复合菌剂在用于发酵有机废弃物时免翻堆，可以使得有机废弃物料堆快速起温，并使温度升至所述兼氧芽孢杆菌和高温固氮菌适合生长的范围，有机废弃物在所述兼氧芽孢杆菌和高温固氮菌的作用下分解，形成易于植物吸收的养分，尤其是可以形成符合NY525-2012标准的有机肥；同时2～3天就可以消除所述有机废弃物料堆的臭味，而且没有大批量苍蝇、小飞虫出现。
进一步，本发明提供的上述两元微生物复合菌剂在用于有机废弃物发酵过程中免翻堆，其中的高温固氮菌分解形成的氮化物不易挥发至周围环境中，有效减少氮素挥发损失，而且兼氧芽孢杆菌有解磷、解钾、固氮功效。
进一步，由于所述两元微生物复合菌剂在用于有机废弃物发酵过程中免翻堆，使得有机废弃物料堆的高温时间长，可以杀灭病菌、虫卵、杂草种子；甚至因发酵高温分解分解农药或兽药残留，其中的微生物将其转换成其他的无毒成分。
进一步，本发明提供的两元微生物复合菌剂中加入菌株活性保护剂，为兼氧芽孢杆菌和高温固氮菌生长提供养分，糖蜜和氨基酸分别为液体复合发酵菌的生长提供碳源和氮源，能够避免液体复合发酵菌的活性迅速下降，延长所述两元微生物复合菌剂的保质期和货架期，解决了因液体菌剂的特点，菌种活性下降快，保质期短等问题。
本发明提供的两元微生物复合菌剂的制备方法主要包括先分别对兼氧芽孢杆菌菌株和高温固氮菌菌株进行培养获得液体兼氧芽孢杆菌菌株和液体高温固氮菌，再将液体兼氧芽孢杆菌菌株和液体高温固氮菌均匀混合，该制备方法简单，易操作，有利于工业推广。
附图说明
图1是本发明实施例中采用的兼氧芽孢杆菌菌落图。
图2是本发明实施例中采用的兼氧芽孢杆菌菌株的显微镜照片图。
图3是本发明实施例中采用的高温固氮菌菌落图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明提供一种两元微生物复合菌剂，包括有效活菌数含量≥5×108 cfu/mL的液体复合发酵菌，所述液体复合发酵菌包括浓度为5.5×108 cfu/mL～1.0×109cfu/mL的液体兼氧芽孢杆菌和浓度为0.5×108cfu/mL～ 1.0×108cfu/mL的液体高温固氮菌，且所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的体积比为7:3～9:1。
其中，本发明以下各实施例或试验中采用的液体兼氧芽孢杆菌的菌株和液体高温固氮菌的来源、筛选及培养条件分别如下。其中，以下各试验或实施例中用于筛选或培养兼氧芽孢杆菌的培养基为常用的肉汤培养基，用于筛选或培养高温固氮菌的无氮培养基为市售的阿什比无氮培养基(Ashby nitrogen-free medium)。
1、液体兼氧芽孢杆菌
1.1 来源 鹤壁市泰山路护城河挖取的淤泥
1.2 筛选目标兼氧芽孢杆菌菌株
1)将从鹤壁市泰山路护城河挖取的淤泥进行自然风干处理，称取其中 10g到100ml无菌水中，静置30min后，放入80℃水浴锅中处理60min，取出冷却30min获得淤泥混合物；
2)将所述获得淤泥混合物放置于摇床中37℃，200rpm培养24h，形成兼氧芽孢杆菌原菌液；
3)采用梯度稀释法将10-3、10-4、10-5三个梯度的1ml所述兼氧芽孢杆菌原菌液倾注到常用的肉汤平板中，每个梯度3个平板；将接种有所述兼氧芽孢杆菌原菌液的肉汤平板置于37℃培养箱中培养36h，获得兼氧芽孢杆菌一代菌落，该菌落形态如图1所示；
4)挑取所述肉汤平板中兼氧芽孢杆菌一代菌落比较大的菌种，进行液体三角瓶培养，三角瓶采用针头抽出空气，密封，静置培养，从其中浑浊度较强的三角瓶中选取目标单菌株；
5)对所述目标单菌株进行涂片、制片、染色显微镜观察，如图2所示，确定为兼氧芽孢杆菌；
6)验证兼氧芽孢杆菌单菌株的温度适应范围，将兼氧芽孢杆菌单菌株平板分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃培养箱中进行培养，进一步选取温度适应范围为30℃～55℃的菌株作为最终的目标兼氧芽孢杆菌菌株。
1.3兼氧芽孢杆菌菌株培养方法
将所述目标兼氧芽孢杆菌菌株接种至肉汤培养基中在55℃培养48h，获得浓度为8.5×108cfu/mL的液体兼氧芽孢杆菌。
2、高温固氮菌菌株
2.1 来源：鹤壁市石林镇花生地10～20cm土壤
2.2 筛选目标高温固氮菌菌株
1)将从鹤壁市石林镇花生地挖取的10～20cm厚的土壤进行自然风干处理，称取其中10g到100ml无菌水中，静置30min后，放置于摇床中37℃、200rpm、1h，取出静置30min，得到分层的混合物；
2)从所述分层的混合物中取10ml上清菌液，并接入到灭菌的无氮培养基中，45℃培养12h，降温至40℃培养48h，获得高温固氮菌原菌液；
3)采用梯度稀释法将10-3、10-4、10-5三个梯度的0.1ml的所述高温固氮菌原菌液涂布到无氮培养基固体平板中，每个梯度3个平板；并于42℃培养箱中培养36h在平板上获得高温固氮菌一代菌落，该菌落形态如图3 所示；
4)挑取上述平板中所述高温固氮菌一代菌落比较大的菌种，转接到无氮斜面培养基培养，得到高温固氮菌单菌株；
5)验证所述高温固氮菌单菌株的温度适应范围，将所述高温固氮菌单菌株平板分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃培养箱中进行培养，进一步选取温度适应范围30℃～55℃的菌株作为最终的目标高温固氮菌菌株。
2.3高温固氮菌菌株培养方法
将所述目标高温固氮菌菌株接种至无氮培养基中，在42℃培养56h，获得浓度为1.0×108cfu/mL的液体高温固氮菌。
一、液体复合发酵菌的配比对发酵效果的影响试验
本发明提供的两元微生物复合菌剂能够用于发酵有机废弃物。下面以具体试验进一步说明本发明所保护的技术方案中的液体复合发酵菌中的两种菌液体兼氧芽孢杆菌与液体高温固氮菌的配比对有机废弃物的发酵效果的影响。
试验对象：样品1～6提供的两元微生物复合菌剂主要通过以下方法制得：按照表1所示的配比将“1.3兼氧芽孢杆菌菌株培养方法”制得的所述液体兼氧芽孢杆菌和“2.3高温固氮菌菌株培养方法”制得的所述液体兼氧芽孢杆菌均匀混合，得到有效活菌数含量≥5×108cfu/mL的液体复合发酵菌。其中表1中“配比”是指所述液体兼氧芽孢杆菌与所述液体高温固氮菌的体积比。
表1本发明提供的两元微生物复合菌剂中的两种菌的配比表
样品序号 1 2 3 4 5 6
配比 1:1 3:2 4:3 4:1 7:3 9:1
试验条件：用牛粪和鸡粪按照质量比1:1比例配合后，添加干蘑菇渣进行水分调节，按照质量百分比65％水分进行调节配比获得有机废弃物混合料，按照样品复合发酵菌剂和所述有机废弃物混合料的质量比1:10000的比例向所述有机废弃物混合料中加入分别加入样品1～6，每个样品做3个重复平行试验，按照24h即天为时间节点进行数据记录，发酵15天，发酵期间不进行翻堆操作，发酵后按照标准NY525-2012进行有机肥氮、磷、钾、有机质及 pH值的测定。利用样品1～6制备有机肥时的发酵过程平均温度详见表2，利用样品1～6制备出的有机肥检测平均数据详见表3。
表2利用样品1～6制备有机肥时的发酵过程平均温度表
Figure BDA0002783311710000091
表3利用样品1～6制备出的有机肥后检测平均数据表
样品 有机质％ 全氮％ 全磷％ 全钾％ 总养分％ pH值
1 53.86 1.65 2.27 2.23 6.15 7.63
2 53.53 1.58 2.25 2.21 6.04 7.58
3 52.62 1.31 2.27 2.22 5.80 8.26
4 52.78 1.36 2.22 2.21 5.79 8.09
5 53.06 1.60 2.22 2.23 6.05 7.50
6 53.79 1.61 2.21 1.89 5.71 7.43
从表2和表3中数据可以看出：利用样品1和样品2发酵有机废弃物混合料不能完成无害化处理，不能杀灭其中有害菌、粪大肠杆菌和蛔虫卵等，达不到有机肥发酵腐熟的要求，主要是因为未能升温至55℃以上，而且养分损耗小，pH未出现明显升高；利用样品3可以发酵有机废弃物混合料，但发酵过程的高温阶段时间短，存在无害化不彻底的情况，同时氮素损耗较样品4～6较大，同时pH也出现明显升高，达到8.26；利用样品4～6可以完成有机废弃物混合料的发酵腐熟，制备有机肥；利用样品5和样品6发酵腐熟有机废弃物混合料制备有机肥的前期升温较快，24h达到50℃以上，快速进入高温，实现无害化，有效缩短发酵时间3～5天；同时利用样品5和6制备有机肥时在氮素损失和稳定pH值方面，表现明显优于样品4。
二、菌株活性保护剂的设计试验
试验对象：保护剂1～4和空白组，其中保护剂1～4主要由质量百分比浓度为80％的糖蜜和质量百分比浓度为40％的氨基酸均匀混合组成，而且两者配比见表4；所述空白组是指不添加保护剂，其中表4中的“配比”是指糖蜜与氨基酸的质量比。
试验条件：先将5个试验对象(保护剂1～4和空白组)分别与上述样品 6按照质量比1:9的比例均匀混合，再进行有效活菌计数分析，并在第7天、 21天、42天、84天进行有效活菌检测分析，分析结果见表4。
表4不同配比菌株活性保护剂对液体复合发酵菌的活性影响
Figure BDA0002783311710000101
从添加不同糖蜜和氨基酸配比的菌株活性保护剂来看：糖蜜含量比较低的，在第42天时液体复合发酵菌中的有效活菌数出现明显的衰减；随着糖蜜含量的升高，液体复合发酵菌中的有效活菌数降低的数量越小，对其中的菌株的保护效果越好。由此可见，本发明提供的两元微生物复合菌剂中添加菌株活性保护剂可以降低菌种活性的下降速度，增加液体复合发酵菌的保质期，延长货架期。
三、菌株活性保护剂的添加比例试验
试验对象：样品7～9由样品6提供的液体复合菌剂和保护剂4组成，且两者的比例见表5。其中，表5中的“添加比例”是指保护剂4与样品6的质量比。
试验条件：对样品7～9进行有效活菌计数分析，并在第7天、21天、42 天、84天进行有效活菌检测分析，分析结果见表5。
表5不同配比菌株活性保护剂对液体复合发酵菌的活性影响
Figure BDA0002783311710000111
从表5可以看出：菌株活性保护剂的添加比例越高对液体复合发酵菌的保护效果越好，但是随着菌株活性保护剂的添加比例的增加，单位体积内有效活菌数会下降，菌株活性保护剂起到了稀释作用，所以，为保证两元微生物复合菌剂的有效活菌含量≥5×108cfu/mL，选择样品7或样品8作中的菌株活性保护剂的添加比例为最终产品的添加比例。
四、实施例
本发明实施例提供一种两元微生物复合菌剂，总活菌数为6.85×108 cfu/mL。以质量百分数计，所述两元微生物复合菌剂由浓度为9.0×108 cfu/mL的液体兼氧芽孢杆菌75％、浓度为1.0×108cfu/mL的液体高温固氮菌10％和菌株活性保护剂15％组成。其中，以质量百分数计，所述菌株活性保护剂由质量百分比浓度为80％的糖蜜90％和质量百分比浓度为40％的氨基酸10％组成。
上述两元微生物复合菌剂的制备方法包括以下步骤：
液体兼氧芽孢杆菌的制备将按照“1.2筛选目标兼氧芽孢杆菌”筛选出的菌株接种至肉汤培养基中，按照现有的枯草芽孢杆菌的常用的扩培培养方法，在48℃扩培培养48h，获得浓度为7.0×108cfu/mL的液体兼氧芽孢杆菌；
液体高温固氮菌的制备将“2.2筛选目标高温固氮菌菌株”高温固氮菌菌株接种至无氮培养基在42℃培养56h，获得1.0×108cfu/mL的液体兼氧芽孢杆菌；
复合发酵菌剂的制备按照上述配比，将所述液体兼氧芽孢杆菌、所述液体兼氧芽孢杆菌和所述菌株活性保护剂均匀混合，即得到有效活菌数含量5.4×108cfu/mL的两元微生物复合菌剂。
发酵试验条件
用牛粪和鸡粪按照质量比1:1比例配合后，添加干蘑菇渣进行水分调节，按照质量百分比65％水分进行调节配比获得有机废弃物混合料，按照试样和所述有机废弃物混合料的质量比1:10000的比例向所述有机废弃物混合料中分别加入试样：人元促腐剂和本实施例提供的两元微生物复合菌剂，每个试样做3个重复平行试验，共6个组合用翻抛设备充分混匀后，进行发酵试验观察。其中，本文中的“人元促腐剂”是指鹤壁市人元生物技术发展有限公司市场销售的促腐剂。
人元促腐剂在发酵试验按照正常发酵工艺翻堆发酵，本发明实施例提供的发酵期间不翻堆，经过15天发酵后，按照有机肥NY525-2012标准进行测定。测定结果见表6。
表6发酵试验制备的有机肥养分表
Figure BDA0002783311710000131
从表6可以看出：与利用人元促腐剂翻堆工艺制得的有机肥相比，利用不翻堆工艺的本实施例提供的两元微生物复合菌剂制得的有机肥的氮素含量高0.76个百分点、pH值低1.43，所以本发明实施例提供的两元微生物复合菌剂实现了固氮和降低有机肥pH的作用。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (10)

1.一种两元微生物复合菌剂，其特征在于，包括有效活菌数含量≥5×108 cfu/mL的液体复合发酵菌，所述液体复合发酵菌包括液体兼氧芽孢杆菌和液体高温固氮菌，且所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的适应温度均包括30℃～55℃。
2.根据权利要求1所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述液体兼氧芽孢杆菌中的兼氧芽孢杆菌菌株来源于淤泥，其筛选方法包括：（1）将淤泥自然风干并加入无菌水中静置；（2）进行75℃～90℃水浴处理，并冷却获得淤泥混合物；（3）所述淤泥混合物进行摇床培养处理，形成兼氧芽孢杆菌原菌液；（4）采用梯度稀释法对所述兼氧芽孢杆菌原菌液进行肉汤平板培养，在第一平板上获得兼氧芽孢杆菌一代菌落；5）挑取所述第一平板中所述兼氧芽孢杆菌一代菌落比较大的菌种进行液体三角瓶培养，并从浑浊度较强的三角瓶中选取兼氧芽孢杆菌单菌株；6）对所述兼氧芽孢杆菌单菌株进行温度适宜范围验证试验，从中选取温度适应范围为30℃～55℃的菌株为最终的目标兼氧芽孢杆菌菌株。
3.根据权利要求1所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述液体高温固氮菌中的高温固氮菌菌株来源于花生地的土壤，其筛选方法包括：（1）将花生地的土壤自然风干并加入无菌水中静置，然后进行摇床处理，并二次静置获得上清菌液；（2）对所述上清菌液接入无氮液体培养基中，先在45℃～50℃进行培养，再降温至42℃～38℃进行培养，获得高温固氮菌原菌液；（3）采用梯度稀释法对所述高温固氮菌原菌液进行无氮培养基固体平板培养，在第二平板上获得高温固氮菌一代菌落；（4）挑取所述第二平板中所述高温固氮菌一代菌落比较大的菌种进行无氮斜面培养基培养，得到高温固氮菌单菌株；（5）对所述高温固氮菌单菌株进行温度适宜范围验证试验，从中选取温度适应范围为30℃～55℃的菌株为最终的目标高温固氮菌菌株。
4.根据权利要求1～3任一项所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体高温固氮菌的体积比为7:3～ 9:1，且所述液体兼氧芽孢杆菌的浓度为5.5×108 cfu/mL～1.0×109 cfu/mL，所述液体高温固氮菌的浓度为0.5×108 cfu/mL～1.0×108 cfu/mL。
5.根据权利要求4所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述两元微生物复合菌剂还包括菌株活性保护剂，该菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为1:19 ～ 9:41。
6.根据权利要求5所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述菌株活性保护剂包括质量百分比浓度为80%～100%的糖蜜和质量百分比浓度为40%～60%的氨基酸，其中，所述糖蜜与氨基酸的质量比为13:7 ～ 9:1。
7.根据权利要求6所述的两元微生物复合菌剂，其特征在于，所述菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为1:9 ～ 3:17。
8.一种根据权利要求1～7任一项所述的两元微生物复合菌剂的制备方法，包括步骤：
液体兼氧芽孢杆菌的制备 采用枯草芽孢杆菌扩培培养用的培养基于45℃～55℃扩培培养兼氧芽孢杆菌，获得液体兼氧芽孢杆菌；
液体高温固氮菌的制备 将高温固氮菌菌株接种至无氮培养基中，在38℃～44℃进行扩培培养，获得液体兼氧芽孢杆菌；
复合发酵菌剂的制备 将所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体兼氧芽孢杆菌均匀混合，制备所述两元微生物复合菌剂。
9.根据权利要求8所述的两元微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述复合发酵菌剂的制备步骤还包括将菌株活性保护剂、所述液体兼氧芽孢杆菌和所述液体兼氧芽孢杆菌均匀混合的步骤，其中，所述菌株活性保护剂与所述液体复合发酵菌的质量比为1:19 ～9:41。
10.根据权利要求8或9所述的两元微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述菌株活性保护剂的制备方法包括将质量百分比浓度为80%～100%的糖蜜和质量百分比浓度为40%～60%的氨基酸按照质量比13:7 ～ 9:1均匀混合的步骤。
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