CN109810058A

CN109810058A - 紫金龙素类衍生物及其药物组合物、制备方法和用途

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Publication number: CN109810058A
Application number: CN201711167185.5A
Authority: CN
Inventors: 罗晓东; 刘亚平; 王蓓; 赖仞; 罗雷; 赵云丽; 尚建华
Original assignee: Kunming Beiao Tech Co ltd; Kunming Institute of Botany of CAS; Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Beiao Tech Co ltd; Kunming Institute of Botany of CAS; Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2017-11-21
Filing date: 2017-11-21
Publication date: 2019-05-28
Anticipated expiration: 2037-11-21
Also published as: CN109810058B

Abstract

本发明提供具有镇痛活性的紫金龙素衍生物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，含有它们的提取物以及药物组合物，其制备方法及它们在制备治疗疼痛药物中的应用。

Description

紫金龙素类衍生物及其药物组合物、制备方法和用途

技术领域：

本发明属于药物技术领域，具体涉及新颖骨架异喹啉生物碱紫金龙素类衍生物及其立体异构体、药学上可接受的盐，以及其药物组合物，其制备方法以及它们在制备治疗疼痛药物中的应用。

背景技术：

疼痛是世界性难题。目前临床用于治疗疼痛的药物主要是阿片类药物和非甾体类药物。耐药性和依赖性使得阿片类药物的临床使用受到限制，而长期使用易引起胃肠道反应、凝血障碍、过敏反应等的非甾体类药物也备受关注。因此为满足当前的临床需求，亟待开发一种无成瘾性、依赖性及低毒副作用且镇痛效果明确的药物。

TRPV1是指“瞬态电压感受器阳离子通道，子类V，成员1”(transient receptorpotential cation channel,subfamily V,member 1)，是哺乳动物重要的痛觉感受器，用于哺乳动物感受外界的化学刺激和热刺激。而且无论是TRPV1激动剂或抑制剂都能最终抑制TRPV1的激活并产生镇痛效果。致力于药物研发的研究人员开始关注能与TRPV1发生相互作用的药物分子。但目前关于这方面的小分子药物还比较缺乏。

紫金龙(Dactylicapnos scandens)是中国云南省白族传统习用药材，具有显著的解痉镇痛作用。本发明人从紫金龙属植物中分离得到了一系列紫金龙素类衍生物，例如紫金龙素甲和乙及其对映异构体，并基于这些新颖化合物进行了结构改造和修饰。而现有技术中未见有本发明涉及的化合物的结构及其药用活性报道。

发明内容：

本发明的目的之一在于提供通式(I)所示的紫金龙素类衍生物及其立体异构体、药学上可接受的盐，其具有显著的镇痛活性，因而可用作治疗疼痛的药物。本发明的另一目的在于提供包含通式(I)所示的紫金龙素类衍生物及其立体异构体、药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的又一目的在于提供一种制备通式(I)所示的紫金龙素类衍生物及其立体异构体、药学上可接受的盐的方法，以及包括通式(I)所示的紫金龙素类衍生物及其立体异构体、药学上可接受的盐的植物提取物。

本发明的一个方面，提供如式(I)所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐：

其中，虚线部分代表单键或双键；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷分别独立地选自氢、羟基、C_1-10烷基、C_1-10醛基或 C_1-10烷酰基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、卤素原子、C_1-10烷氧基、C_2-10烯基氧基、C_2-10炔基氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基、氨基、C_1-10烷基氨基、N,N-二(C_1-10烷基)氨基或N-C_1-10烷基羰基氨基。

R⁶是氢、C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_6-10芳基、5-6元杂芳基、3-8 元杂环基、C_1-10烷基羰基、C_3-8环烷基羰基、C_1-10烷氧羰基、C_3-8环烷氧基羰基或氧代基团；

R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³分别独立地选自是氢、羟基、C_1-10烷氧基、C_2-10烯基氧基、炔基氧基、卤素原子、C_1-10烷基羰基、C_3-8环烷基羰基、C_1-10烷氧基羰基、C_3-8环烷氧基羰基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧基羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基、氨基、C_1-10烷基氨基、N,N-二C_1-10烷基氨基或N-C_1-10烷基羰基氨基，或者R⁸和R⁹可一起形成氧代基，或者R¹⁰和R¹¹可一起形成氧代基，或者R¹²和R¹³可一起形成氧代基。

在一个优选实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷分别独立地选自氢、羟基、卤素原子、C_1-10烷氧基、C_2-10烯基氧基、C_2-10炔基氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧羰氧基或C_3-8环烷氧基羰氧基；在更优选的实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷分别独立地选自氢、羟基、卤素原子、C_1-10烷氧基或C_1-10烷基羰氧基；在更优选的实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷分别独立地选自氢、羟基、F、Cl、Br、I、C_1-6烷氧基或C_1-6烷基羰氧基；在更优选的实施方案中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷分别独立地选自氢、羟基、F、Cl、Br、I、甲氧基或乙酰氧基。

在另一个优选实施方案中，R⁶是氢、C_1-10烷基或C_1-10烷基羰基；优选地， R⁶是氢、C_1-6烷基或C_1-6烷基羰基；更优选地，R⁶是氢、甲基或乙酰基。

在另一个优选实施方案中，R⁸和R⁹之一选自氢、羟基、C_1-10烷氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_1-10烷氧基羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基，且另一个选自C_1-10烷基、 C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_1-10烷基羰基、C_1-10烷氧基羰基或C_3-8环烷氧基羰基；优选地，R⁸和R⁹之一选自氢、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰氧基、C_1-6烷氧基羰氧基或C_3-6环烷氧基羰氧基，且另一个选自C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基或C_3-6环烷氧基羰基；更优选地，R⁸和R⁹之一选自氢、羟基、C_1-6烷氧基或C_1-6烷基羰氧基，且另一个选自C_1-6烷基、C_2-6烯基或 C_1-6烷氧基羰基；更优选地，R⁸和R⁹之一选自羟基，且另一个选自C_1-6烷氧基羰基；更优选地，R⁸和R⁹之一选自羟基且另一个选自甲氧基羰基。

在另一个优选实施方案中，R¹⁰和R¹¹分别独立地选自氢、羟基、C_1-10烷氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧基羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基，或者R¹⁰和R¹¹可一起形成氧代基；优选地，R¹⁰和R¹¹分别独立地选自氢、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰氧基或C_1-6烷氧基羰氧基，或者R¹⁰和R¹¹可一起形成氧代基；更优选地，R¹⁰和R¹¹分别独立地选自氢、羟基、C_1-6烷氧基或C_1-6烷基羰氧基，或者R¹⁰和R¹¹可一起形成氧代基；更优选地，R¹⁰和R¹¹分别独立地选自氢、羟基或甲氧基，或者R¹⁰和R¹¹可一起形成氧代基；更优选地，R¹⁰和R¹¹分别独立地选自甲氧基，或者R¹⁰和R¹¹可一起形成氧代基。

在另一个优选实施方案中，R¹²和R¹³分别独立地选自氢、羟基、C_1-10烷氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧基羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基，或者R¹²和R¹³可一起形成氧代基；更优选地，R¹²和R¹³分别独立地选自氢、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰氧基或C_1-6烷氧基羰氧基，或者R¹²和R¹³一起形成氧代基；更优选地，R¹²和R¹³分别独立地选自C_1-6烷氧基，或者R¹²和R¹³一起形成氧代基；更优选地，R¹²和R¹³分别独立地选自甲氧基，或者R¹²和R¹³一起形成氧代基。

在另一个优选实施方案中，其中R⁸和R⁹所连接的碳原子具有R或S构型。

在另一个优选实施方案中，所述的式(I)化合物具有式(I-1)所示的结构：

其中，R¹至R¹¹如上所定义。

在更优选的实施方案中，R¹，R⁴，R⁵和R⁷是氢，R⁶是甲基，R²，R³，R¹⁰和 R¹¹是甲氧基，R⁸是羟基，且R⁹是甲氧基羰基。

在更优选实施方案中，R¹，R⁴，R⁵和R⁷是氢，R⁶是甲基，R²，R¹⁰和R¹¹是甲氧基，R³和R⁸是羟基，且R⁹是甲氧基羰基。

在另一个优选实施方案中，提供一种选自下列的化合物或其药学上可接受的盐：

在另一个优选实施方案中，如上所述药学上可接受的盐选自所述化合物与有机酸或无机酸形成的盐，其中所述的有机酸为选自脂肪族、脂环族、芳香族的羧酸和磺酸类型的有机酸的有机酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、乙二酸、丙二酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、双羟萘酸、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。所述的无机酸优选为盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、硝酸。

本发明的另一个方面，提供如上所述的式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的制备方法，包括以下步骤：

a.使紫金龙属植物材料与水或者有机溶剂接触，以获得提取物；

b.使式(I)所示的化合物至少部分地从所述提取物中分离而被富集；

c.任选地，将一种式(I)所示的化合物转化成另一种式(I)所示的化合物；

d.任选地，将式(I)所示的化合物与无机酸或有机酸加成以形成药学上可接受的盐。

在一个优选实施方案中，所述的紫金龙属植物选自紫金龙Dactylicapnosscandens、丽江紫金龙Dactylicapnos lichiangensis、宽果紫金龙 Dactylicapnosroylei、扭果紫金龙Dactylicapnos torulosa；其中优选为紫金龙Dactylicapnosscandens。

在另一个优选实施方案中，步骤a中所述的有机溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂或烃类溶剂；所述的醇类溶剂优选为C_1-6脂肪醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、环戊醇、正己醇、环己醇等；所述的酮类溶剂优选为C_3-6脂肪酮，例如丙酮、甲基乙基酮或甲基异丁基酮；所述的酯类溶剂优选为C_1-6脂肪酸的C_1-6脂肪醇酯，例如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯或乙酸正丁酯；其中所述的醚类溶剂优选为C_2-6脂肪族醚，例如乙醚、四氢呋喃；所述的卤代烷类溶剂优选为C_1-6卤代烃，例如二氯甲烷、氯仿或二氯乙烷；所述的烃类溶剂优选为环己烷或石油醚。

在另一个优选实施方案中，步骤b包括：向步骤a所获得的提取物中加入适量水或者不加水，调节pH＝1.0-4.5，用酯类溶剂萃取，水相用碱调节至pH＝8.0-11.0，用酯类溶剂萃取，有机相浓缩，任选通过硅胶柱层析、反相柱层析、离子交换树脂柱层析、凝胶柱层析中的一种或多种，得到富集的式(I)所示的化合物。优选地，所述的反相柱层析选自C18反相柱层析，所述的离子交换树脂柱层析选自强酸性或弱酸性阳离子交换树脂，所述凝胶柱层析选自Sephadex LH-20。

更具体地，所述方法包括：取风干后的紫金龙植物根，用80％乙醇水溶液 70℃加热，回流提取3次，回收溶剂，浓缩，加入1％HCl调节pH值至大约为2，用乙酸乙酯萃取3次，水层用10％氨水调节pH值至9，再用乙酸乙酯萃取3次，有机相浓缩后，用硅胶拌样，加入200-300目硅胶层析柱，用氯仿 /甲醇梯度洗脱依次分为七部分(Fr 1-7)，分配比例为氯仿/甲醇10:0，20:1， 10:1，8:1，5:1，3:1，1:1。Fr 3用甲醇/水35:65，50:50，60:40，70:30， 80:20，90:10，100:0梯度洗脱得到七小段，其中Fr 3-5用石油醚/丙酮＝10： 1为洗脱剂，再用Sephadex LH-20(氯仿/甲醇1:1)分离得紫金龙素甲和乙。另外，对这两个分子进行了手性分析并拆分，拆分用色谱柱为：Reprosil chiral-AM，5m，250mm*4.6mm r65am.S2546德国迈克，紫金龙素甲的色谱条件：正己烷∶乙醇＝80:20，波长：380nm，流速：1.0mL/min。紫金龙素乙的色谱条件：正己烷∶乙醇＝70:30，波长：333nm，流速：1.0mL/min。

本发明的另一个方面，提供一种紫金龙属植物提取物，由如上所述的方法制备而得。优选地，所述提取物中含有式(I)所示的化合物的总量至少10 重量％，优选为至少20重量％，更优选为至少30重量％，更优选为至少50重量％，更优选为至少70重量％，更优选为至少80重量％。

本发明的另一方面，提供一种药物组合物，其中含有至少一种如上所述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的又一方面，提供如上所述的式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，所述的提取物，或者所述的药物组合物在制备治疗人或动物疼痛性疾病或病症或者改善疾病的疼痛症状的药物中的应用。优选地，所述的疼痛性疾病或病症包括根据国际疾病分类方法而划分的七大类：(1) 慢性原发性疼痛；(2)慢性癌性疼痛；(3)慢性术后痛和创伤后疼痛；(4)神经病理性疼痛；(5)慢性头部和颌面部疼痛；(6)慢性内脏疼痛；(7)慢性骨骼肌疼痛。更优选地，所述的疼痛性疾病或病症为炎性疼痛。

本说明书中，术语“烷基”是指仅含碳原子和氢原子的直链或支链烃基，优选具有1-10个碳原子，更优选具有1-6个碳原子，更优选具有1-4个碳原子。代表性的例子包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基等。

“烯基”是指具有至少一个碳碳双键，直链或支链的脂族烃基，优选具有2-10个碳原子，更优选具有2-6个碳原子，更优选具有2-4个碳。代表性的例子包括乙烯基、丙烯基、烯丙基、丁烯基、戊二烯基等。

“炔基”是指具有至少一个碳碳三键，直链或支链的脂族烃基，优选具有2-10个碳原子，更优选具有2-6个碳原子，更优选具有2-4个碳。代表性的例子包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。

“烷酰基”是指直链或支链的，环状或无环的脂族羧酸去掉羧基上的羟基形成的基团，优选具有1-10个碳原子，更优选具有1-6个碳原子，更优选具有1-4个碳，代表性的例子包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基。

“烷氧基”是指式-O-R'的基团，其中R'是烷基。烷氧基的代表性实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基等。

“环烷基”是指仅含碳原子和氢原子的环状烃基，优选具有3-8个环碳原子，更优选具有3-6个环碳原子。代表性的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。

“杂环基”是指含有至少一个杂原子的环状饱和或不饱和烃基，优选具有3-8个环原子，更优选具有3-6个碳原子，所述杂原子选自N、O和S，优选具有1、2、3个杂原子。代表性的例子包括氧杂环丙基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基。

“芳基”是指具有至少一个芳香环的烃基，优选具有6-10个碳原子。代表性的例子包括苯基、萘基等。

“杂芳基”是指5至10个环原子的单价芳族杂环的单环或二环的环体系，其包含1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，其余的环原子是碳原子。代表性的例子包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基。

本发明化合物可以单独直接应用或组合应用，也可以与其他药物包括植物提取物组成复方形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物一单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者年龄、体重、所治疗疾病类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。

经口服给药时，首先使化合物与常规的药用辅剂如药用载体、赋形剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、芳香剂、表面活性剂等混合，将其制成颗粒剂、胶囊、片剂等形式给药；非经口给药时可以注射液、输液剂或栓剂等形式给药。制备上述制剂时，可使用常规的制剂技术。

具体实施方式：

下面的实施例可更详细地说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：

化合物1和2的分离纯化：

取风干后的紫金龙植物根3.9kg，粉碎后用80％乙醇70℃加热，回流提取 3次，回收溶剂，浓缩到小体积，加入1％HCl调节pH值至2，用乙酸乙酯萃取3次，水层用10％氨水调节pH值至9，再用乙酸乙酯萃取3次，浓缩乙酸乙酯层(104g)，乙酸乙酯部分用硅胶拌样后，进行700g，200-300目硅胶柱层析，用氯仿/甲醇梯度洗脱分段，分配比例为氯仿/甲醇10:0，20:1，10:1， 8:1，5:1，3:1，1:1，按照每份300mL收集为7个合并Frs 1-7。组分Fr3用甲醇/水35:65，50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0为洗脱剂，TLC 检测合并斑点相同组分得到7个亚组分，其中Fr3-5用石油醚/丙酮＝10:1为洗脱剂，再用Sephadex LH-20(氯仿/甲醇1:1)分离得紫金龙素甲和乙。其经手性HPLC拆分柱子为：Reprosil chiral–AM，5m，250mm*4.6mm r65am. S2546德国迈克，化合物1色谱条件：正己烷：乙醇＝80:20，波长：380nm，流速：1.0mL/min，得(+)-1(1.0mg)和(-)-1(1.0mg)。化合物2色谱条件：正己烷：乙醇＝70:30，波长：333nm，流速：1.0mL/min，得(+)-2(0.5mg) 和(-)-2(0.5mg)。

化合物1和2的结构式分别如下所示：

紫金龙素甲：分子量431，分子式C₂₂H₂₅NO₈。易溶于氯仿，丙酮，甲醇，微溶于水。

紫金龙素甲的结构是基于它的紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振谱特别是二维核磁共振谱而确定。

紫外光谱数据：UVλ(max)(MeOH)：211(4.03),264(3.87),294(3.59), 394(3.84)

红外光谱数据：IRν(max)(KBr)：3436,2947,1739,1709,1602,1583, 1526,1463,1413,1166cm^-1

质谱数据：HREIMS(m/z):431.1591([M]⁺)

¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。

以上数据结合2D NMR分析证实了紫金龙素甲的化学结构。

紫金龙素乙：分子量417，分子式C₂₁H₂₃NO₈。易溶于氯仿，丙酮，甲醇，微溶于水。

紫金龙素乙的结构是基于它的紫外光谱、红外光谱、质谱和核磁共振谱特别是二维核磁共振谱而确定。

紫外光谱数据：UVλ(max)(MeOH)：206(4.12),275(3.73),333(3.56), 425(3.60)；

红外光谱数据：IRν(max)(KBr)：3411,2947,2853,1739,1631,1528, 1460,1384,1316,1180cm^-1

质谱数据：HREIMS(m/z):417.1392([M]⁺)

¹H NMR和¹³C NMR数据见表1。

以上数据结合2D NMR分析证实了紫金龙素乙的化学结构。

化合物1和2的结构鉴定数据：

表1.化合物1和2的¹H和¹³C NMR数据(δ，ppm)(CDCl₃).

紫金龙素甲(1):[]¹⁸ _D+5.90(c 0.13,CH₃OH)；UV(CH₃OH)λ_max (logε)nm 211(4.03),264(3.87),294(3.59),394(3.84)；IR (KBr)ν_max 3436,2947,1739,1709,1602,1583,1526,1463,1413, 1166cm^-1；¹H,¹³C-NMR数据参见表1；ESIMS m/z 454[M+Na]⁺；高分辨质谱HREIMS m/z 431.1591[M]⁺(计算分子式为C₂₂H₂₅NO₈,431.1580)。

(+)-紫金龙素甲：[]²⁵ _D+115(c 0.10,CHCl₃)；

(-)-紫金龙素甲：[]²⁵ _D-118(c 0.10,CHCl₃)。

紫金龙素乙(2):[]¹⁸ _D-11.03(c 0.13,CH₃OH)；UV(CH₃OH)λ_max (logε)nm 206(4.12),275(3.73),333(3.56),425(3.60)；IR (KBr)ν_max 3411,2947,2853,1739,1631,1528,1460,1384,1316, 1180cm^-1；¹H,¹³C-NMR数据参见表1；ESIMS m/z 440[M+Na]⁺；高分辨质谱HREIMS m/z 417.1392[M]⁺(计算分子式为C₂₁H₂₃NO₈,417.1424)。

(+)-紫金龙素乙：[]²⁴ _D+42(c 0.04,CH₃OH)；

(-)-紫金龙素乙：[]²⁴ _D-47(c 0.06,CH₃OH)。

实施例2：

实施例1中的四个化合物均能激活TRPV1离子通道，与阳性对照药物辣椒素(capsaincin)相比，可能具有更好的镇痛效果。实验方法和结果如下：

一.材料与方法：

1.1人胚肾细胞(HEK293)细胞培养和转染

1.1.1细胞复苏

细胞复苏时，应快速融化冻存细胞，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5-0℃)，以保证细胞存活率高，生长及形态良好。具体步骤如下：

①从液氮罐中取出细胞，迅速放入37℃温水中解冻并不断搅动，使冻存管中的细胞尽快融化(必须在一分钟以内)，然后在无菌的情况下取出细胞。

②细胞无菌取出后，将细胞移入装有10倍以上预热培养液的离心管中，在1000rpm/min速度下离心10分钟，弃去上清。此步骤重复一次。复苏的细胞接种浓度5×10⁵/L，置于37℃、5％CO₂、15％相对湿度培养箱中培养，次日更换一次培养液。复苏的HEK293T在24h内，应尽量或不作观察或是减少观察细胞次数，以免因晃动而影响细胞生长。复苏后24h左右进行首次更换培养基。

1.1.2细胞传代

①当HEK293细胞基本上长满培养皿时，应及时传代以避免生长过密而影响细胞状态。

②弃培养液，加适量PBS，轻轻把贴壁的细胞漂洗两次。

③弃PBS，加0.25％胰酶以覆盖培养皿底部为宜。无菌操作台上酶解并观察细胞是否脱壁。如果观察到细胞大量隆起胞质回缩、细胞间隙增大，加入适量10％培养液终止胰酶反应。

④用移液管反复吹打细胞制成均匀的细胞悬液，然后将细胞以1:3比例分入新的培养皿中，置于温度为37℃、5％CO₂、15％相对湿度培养箱中培养。

1.1.3细胞转染

脂质体，又称为人工生物膜，是磷脂分子分散在水中后形成的脂质双分子层，核酸的磷酸根带负电荷，而阳离子脂质体表面带正电荷，它们通过静电作用形成DNA一脂复合体。阳离子脂质体法转染方法如下:

①转染前一天，用不含抗生素的培养液培养更换培养皿中含抗生素培养液。

②当细胞密度达到80-90％，弃培养液，PBS漂洗一次，加2mL无血清培养液(Opti-MEM)。

③A液配置：240μL无血清培养基+10μL脂质体，室温下静置5min。B 液配置：250μL无血清培养液中加4ng质粒DNA(包含质粒:EGFP＝4:1)，室温静置5min。

④将A液加入B液并混匀，室温下静置20min。

⑤将DNA-脂质体混后匀，轻轻滴加入细胞中。4-6h后，用普通培养基更换含有血清的全培养基。

1.2全细胞模式记录细胞膜离子通道的活动

全细胞记录细胞膜离子通道的优势在于记录到的通道数量多，形成的电流比较大，有利于比较准确地评价药物的浓效关系，因此被广泛用于与离子通道相互作用的药物筛选。

1.2.1细胞的选择

取出恒温培养箱中转染后的HEK293细胞，用室温下平衡好的细胞外液更换培养皿内的培养液，以防止溶液温度的剧烈变化。加细胞外液是用枪沿着皿壁轻轻加入，以防止细胞从培养皿底部脱落。将换好液的细胞放置倒置显微镜下观察，选择细胞膜较为光滑、细胞质均匀的细胞，在室温20-25℃条件下进行膜片钳实验。

1.2.2微电极的制备

选用100μL硼硅酸盐玻璃毛坯为玻璃微电极材料，在拉制仪(PC-10， Narishige)上经两步拉制而成，玻璃微电极热抛光后电极尖端口径约为 1.5-3.0μm，拉制完成后在玻璃微电极内灌细胞内液并将电极尖端内气泡弹出。玻璃微电极入液后初始电阻为2-4MΩ较好，灌入约1/4相应的电极内液备用。

1.2.3全细胞膜片钳电流记录

细胞爬片翻入盛有相应电极外液的细胞槽中，电极连接HEKA epc10usb膜片钳系统后，电动微操(ShutterTM MP-285)控制正压电极入水。接触细胞后松掉正压并同时给一个较小力度的负压，关闭气密系统后电阻值立刻上升到GO级别。需要注意此时的封接阻值，GO级别的阻值是记录到高质量数据的基础。然后将细胞钳制在-60mV，给予一短而有力的负压，将钳制在微电极中的细胞膜迅速打破，再进行细胞慢电容(Slow capacitance)补偿。此时可以利用On-Cell模式观察被牵制的膜片上单通道的活动以估计该细胞上所有通道的总电流值。形成全细胞记录模式后将细胞钳制为-80mV，细胞稳定 4-6min开始记录电流。串联电阻(Rs)在实验过程中最好在<10MΩ的范围之内始终保持不变，系统串联电阻(Rseriescompensation)补偿一般在30～ 70％之间。

将全细胞放置于RSC-200快速切药系统的8并管前，打开电极外液的通道，用相应的刺激模式重复打开通道并记录通道的活动。切换不同的药物或不同的药物浓度，记录离子通道活动规律的变化。记录过程中需要注意封接电阻和串联电阻都需要处在稳定的状态，否则记录到的数据不可用。另外， RSC-200的管道切换数据通过数据线连接到放大器A/D通道，可在Patch Master上实时记录相应药物所对应的电流数据。

1.3钙成像与电生理记录

HEK293细胞用溶解有Fluo-4AM的Ringer’s溶液(140mM NaCl,5mM KCl,2mMMgCl₂,10mM glucose,2mM CaCl₂and 10mM HEPES,pH7.4) 孵育40-60分钟(37℃)。MetaFluor Software(Molecular Devices)控制 Hamamatsu C4742用于采集HEK293细胞的细胞钙荧光变化。500/20nm的激发滤片过滤汞蒸汽激发光后用于激发Fluo-4，Fluo-4的发射荧光被535/30nm 的发射滤片过滤后进行检测。MetaMorph software(MolecularDevices)用以处理分析荧光图像。

电生理的记录简要描述为，全细胞模式下的通道电流使用HEKAEPC10放大器记录。电极内液和细胞外液相同，配方为：130mM NaCl,3mM HEPES, 0.2mM EDTA(pH 7.4)。对于脱敏试验部分，电极内液配方为：140mM KCl, 5Mm EGTA和10mM HEPES(pH 7.4)。细胞外液配方为：140mM NaCl,5mM KCl,2mM CaCl₂,2mM MgCl₂,10mM HEPES和10Mm glucose(pH 7.4)。没有特殊注明的实验都在室温下进行，钳制电压为0mV，测试电压为80mV。 Student’s t-test用于数据之间显著性的统计，**代表P<0.001。

二、结论：

在本实验条件下，通过本发明的研究，紫金龙素甲和乙都是TRPV1激动剂，其EC₅₀值分别为1：1.78±0.23μM(n＝6)；2：10.46±0.54μM(n＝10)。此外，紫金龙素甲和乙在TRPV1电流正向出现更为显著的脱敏反应，其在疼痛治疗中具有非常重要的意义，可能具有比辣椒素更好的治疗疼痛的作用。因此，紫金龙中的新骨架化合物1和2，及基于他们的一系列结构修饰的衍生物可能会开辟一条崭新的控制痛觉感受器的途径。

实施例3：

化合物1和2的结构改造和修饰示例：

通过实施例2的方法测试，修饰后的化合物3-6具有与化合物1和2相似的活性。

制剂实施例1：

按实施例1的方法先制得紫金龙素甲[(+)-dacscandensine A和 (-)-dacscandensine A]和乙[(+)-dacscandensine B和(-)-dacscandensine B]，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。制剂实施例2：

按实施例1的方法先制得紫金龙素甲[(+)-dacscandensine A和 (-)-dacscandensine A]和乙[(+)-dacscandensine B和(-)-dacscandensine B]，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐,将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

制剂实施例3：

将所分离得到紫金龙素甲[(+)-dacscandensine A和(-)-dacscandensine A]和乙[(+)-dacscandensine B和(-)-dacscandensine B]，以及利用有机酸 (酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

制剂实施例4：

按实施例1的方法先制得紫金龙素甲[(+)-dacscandensine A和 (-)-dacscandensine A]和乙[(+)-dacscandensine B和(-)-dacscandensine B]，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，按照一定比例配比制成每片含有药物1-100mg的片剂样品。。

制剂实施例5：

按实施例1的方法先制得紫金龙素甲[(+)-dacscandensine A和 (-)-dacscandensine A]和乙[(+)-dacscandensine B和(-)-dacscandensine B]，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，用无菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。

制剂实施例6：

按实施例1的方法先制得紫金龙素甲[(+)-dacscandensine A和 (-)-dacscandensine A]和乙[(+)-dacscandensine B和(-)-dacscandensine B]，以及利用有机酸(酒石酸，柠檬酸，甲酸，乙二酸等)或无机酸(盐酸，硫酸，磷酸等)制成的盐，使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分，按照一定比例配比制成每粒胶囊中含有化合物成分1-100mg的胶囊剂。

Claims

1.式(I)所示的化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，

其中，虚线部分代表单键或双键；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷分别独立地选自氢、羟基、C_1-10烷基、C_1-10烷酰基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、卤素原子、C_1-10烷氧基、C_2-10烯基氧基、C_2-10炔基氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基、氨基、C_1-10烷基氨基、N,N-二(C_1-10烷基)氨基或N-C_1-10烷基羰基氨基；

R⁶是氢、C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_6-10芳基、5-6元杂芳基、3-8元杂环基、C_1-10烷酰基、C_1-10烷基羰基、C_3-8环烷基羰基、C_1-10烷氧羰基、C_3-8环烷氧基羰基或氧代基团；

R⁸、R⁹、R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³分别独立地选自氢、羟基、C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_1-10烷氧基、C_2-10烯基氧基、C_2-10炔基氧基、卤素原子、C_1-10烷基羰基、C_3-8环烷基羰基、C_1-10烷氧基羰基、C_3-8环烷氧基羰基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧基羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基、氨基、C_1-10烷基氨基、N,N-二C_1-10烷基氨基或N-C_1-10烷基羰基氨基，或者R⁸和R⁹可一起形成氧代基，或者R¹⁰和R¹¹可一起形成氧代基，或者R¹²和R¹³可一起形成氧代基。

2.如权利要求1所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷分别独立地选自氢、羟基、卤素原子、C_1-10烷氧基、C_2-10烯基氧基、C_2-10炔基氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧羰氧基或C_3-8环烷氧基羰氧基。

3.如权利要求1所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁷分别独立地选自氢、羟基、卤素原子、C_1-6烷氧基或C_1-6烷基羰氧基。

4.如权利要求1所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中R⁶是氢或C_1-10烷基。

5.如权利要求1所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中R⁸和R⁹之一选自氢、羟基、C_1-10烷氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_1-10烷氧基羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基，且另一个选自C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_1-10烷基羰基、C_1-10烷氧基羰基或C_3-8环烷氧基羰基。

6.如权利要求1所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中R¹⁰和R¹¹分别独立地选自氢、羟基、C_1-10烷氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧基羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基，或者R¹⁰和R¹¹可一起形成氧代基。

7.如权利要求1所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中R¹²和R¹³分别独立地选自氢、羟基、C_1-10烷氧基、C_1-10烷基羰氧基、C_3-8环烷基羰氧基、C_1-10烷氧基羰氧基、C_3-8环烷氧基羰氧基，或者R¹²和R¹³可一起形成氧代基。

8.如权利要求1-7任一项所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中R⁸和R⁹所连接的碳原子具有R或S构型。

9.如权利要求8所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其具有式(I-1)所示的结构：

其中，R¹至R¹¹如权利要求1-6任一项所定义。

10.如权利要求9所述的8所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，所述的式(I-1)化合物其中，R¹，R⁴，R⁵和R⁷是氢，R⁶是甲基，R²，R³，R¹⁰和R¹¹是甲氧基，R⁸是羟基，且R⁹是甲氧基羰基。

11.如权利要求9所述的式(I)化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中R¹，R⁴，R⁵和R⁷是氢，R⁶是甲基，R²，R¹⁰和R¹¹是甲氧基，R³和R⁸是羟基，且R⁹是甲氧基羰基。

12.选自下列的化合物或其药学上可接受的盐，

13.如权利要求1-12任一项所述的化合物、其立体异构体或药学上可接受的盐，其中所述的药学上可接受的盐选自与无机酸或有机酸的加成盐，所述的有机酸选自脂肪族、脂环族、芳香族的羧酸和磺酸类型的有机酸的有机酸，优选为甲酸、乙酸、丙酸、乙二酸、丙二酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、双羟萘酸、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸；所述的无机酸为盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸。

14.权利要求1-13任一项所述的式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

15.如权利要求14所述的制备方法，其中所述的紫金龙属植物选自紫金龙Dactylicapnos scandens、丽江紫金龙Dactylicapnos lichiangensis、宽果紫金龙Dactylicapnos roylei、扭果紫金龙Dactylicapnos torulosa；优选为紫金龙Dactylicapnos scandens。

16.如权利要求14所述的制备方法，步骤a中所述的有机溶剂选自醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂、卤代烷类溶剂或烃类溶剂；所述的醇类溶剂为为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或环己醇；所述的酮类溶剂为丙酮、甲基乙基酮或甲基异丁基酮；所述的酯类溶剂为甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯或乙酸正丁酯；其中所述的醚类溶剂为乙醚、四氢呋喃；所述的卤代烷类溶剂为二氯甲烷、氯仿或或二氯乙烷；所述的烃类溶剂为环己烷或石油醚。

17.如权利要求14-16任一项所述的制备方法，其中步骤b包括：向步骤a所获得的提取物中加入适量水或者不加水，调节pH＝1.0-4.5，用酯类溶剂萃取，水相用碱调节至pH＝8.0-11.0，用酯类溶剂萃取，有机相浓缩，任选通过硅胶柱层析、反相柱层析、离子交换树脂柱层析、凝胶柱层析中的一种或多种，得到富集的式(I)所示的化合物；优选地，所述的反相柱层析选自C18反相柱层析，所述的离子交换树脂柱层析选自强酸性或弱酸性阳离子交换树脂，所述凝胶柱层析选自Sephadex LH-20。

18.如权利要求14-16任一项所述的制备方法，其特征在于所述方法包括：取风干后的紫金龙植物根，用80％乙醇水溶液70℃加热，回流提取3次，回收溶剂，浓缩，加入1％HCl调节pH值至大约为2，用乙酸乙酯萃取3次，水层用10％氨水调节pH值至9，再用乙酸乙酯萃取3次，有机相浓缩后，用硅胶拌样，加入200-300目硅胶层析柱，用氯仿/甲醇梯度洗脱依次分为七部分Fr 1-7，分配比例为氯仿/甲醇10:0，20:1，10:1，8:1，5:1，3:1，1:1；Fr 3用甲醇/水35:65，50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0梯度洗脱得到七小段，其中Fr 3-5用石油醚/丙酮＝10：1为洗脱剂，再用Sephadex LH-20、氯仿/甲醇1:1分离得紫金龙素甲和乙；进一步地，对这两个分子进行手性分析并拆分，拆分用色谱柱为：Reprosil chiral-AM，5m，250mm*4.6mm r65am.S2546德国迈克，紫金龙素甲的色谱条件：正己烷∶乙醇＝80:20，波长：380nm，流速：1.0mL/min，紫金龙素乙的色谱条件：正己烷∶乙醇＝70:30，波长：333nm，流速：1.0mL/min。

19.一种提取物，由权利要求14-18任一项所述的方法制备而得。

20.如权利要求19所述的提取物，其中含有式(I)所示的化合物的总量至少10重量％，优选为至少20重量％，更优选为至少30重量％，更优选为至少50重量％，更优选为至少70重量％，更优选为至少80重量％。

21.药物组合物，其含有至少一种如权利要求1-13任一项所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

22.如权利要求1-13任一项所述的化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐，或者如权利要求19-20任一项所述的提取物，或者如权利要求21所述的药物组合物，在制备治疗人或动物疼痛性疾病或病症或者改善疾病的疼痛症状的药物中的应用。

23.如权利要求22所述的应用，其中所述的疼痛性疾病或病症包括根据国际疾病分类方法而划分的七大类：(1)慢性原发性疼痛；(2)慢性癌性疼痛；(3)慢性术后痛和创伤后疼痛；(4)神经病理性疼痛；(5)慢性头部和颌面部疼痛；(6)慢性内脏疼痛；(7)慢性骨骼肌疼痛。