CN109793736A - 一种乐伐替尼在制备自然杀伤细胞激动剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种乐伐替尼在制备自然杀伤细胞激动剂中的应用，乐伐替尼可显著增加NK细胞浸润进入肿瘤组织的数量，相比于空白对照组，数量可提升2～3倍左右；并且，通过对肿瘤组织中NK细胞的杀伤受体检测，乐伐替尼能够显著增加NK细胞表面自然杀伤受体CD16以及NKp46的表达水平，进一步发挥了NK细胞的活性，从而提升了NK细胞的活化作用，发挥抗肿瘤的效果。

Description

一种乐伐替尼在制备自然杀伤细胞激动剂中的应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，涉及一种乐伐替尼在制备自然杀伤细胞激动剂中的应用。

背景技术

乐伐替尼(Lenvatinib)是一种口服的受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，包括KDR(VEGFR-2)，FGFR1，Flt-1(VEGFR-1)，RET，PDGFR-β和c-kit。在2012年至2013年期间，乐伐替尼陆续被日本，美国和欧洲指定为甲状腺癌的孤儿药物(Orphan Drug Designation)。除甲状腺癌外，美国FDA还根据2016年临床试验的阳性结果，批准了用乐伐替尼和依维莫司联合治疗晚期肾细胞癌(RCC)。由于乐伐替尼的广谱抑制潜力，乐伐替尼也在其他几项临床试验中进行了测试，包括胶质瘤(NCT01137604)，肝细胞癌(NCT00946153)，非小细胞肺癌(NCT00832819)和黑色素瘤(NCT01136967，NCT01133977，NCT00121680)。根据目前的报道，乐伐替尼对这些癌症的疗效主要归因于通过靶向RTK介导的抗血管生成活性和肿瘤增殖抑制。

最近的一份研究显示，乐伐替尼显示出免疫调节活性，特别是对CD8⁺T细胞群，并且这种效应在免疫活性条件下促成了乐伐替尼的强效抗肿瘤活性(Immunomodulatoryactivity of lenvatinib contributes to antitumor activity in the Hepa1-6hepatocellular carcinoma model)。该研究进一步表明了乐伐替尼存在联合PD-1抗体达到抗肿瘤效果的可能。

乐伐替尼联合PD-1抑制剂使用：因为乐伐替尼是多靶点的靶向药，而PD1抑制剂又是广谱的抗癌药，所以乐伐替尼和PD-1抑制剂的组合能扩大癌症治疗范围以及治愈率。2016年ESMO公布的乐伐替尼和PD-1的Ib期研究结果中，截止2016年10月，纳入患者13名，包括非小细胞肺癌、肾细胞癌、子宫腺癌、膀胱癌、头颈部鳞癌、黑色素瘤患者。结果：13名患者中7位肿瘤缩小，有效率54％，6位肿瘤没有增大，疾病控制率100％。可见，乐伐替尼联合PD-1抑制剂对肿瘤具有良好的抑制作用。

目前，关于乐伐替尼的研究还比较局限，还没有研究显示乐伐替尼可促进提升自然杀伤细胞(NK)发挥抗肿瘤的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乐伐替尼在制备自然杀伤细胞(NK)激动剂中的应用，以达到促进NK细胞浸润肿瘤并增强NK细胞活化来发挥抗肿瘤的作用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种乐伐替尼在制备自然杀伤细胞(NK)激动剂中的应用。

本发明所述激动剂指的是促进和提升自然杀伤细胞(NK)的浸润活性和抗肿瘤作用。

本发明意外地发现，乐伐替尼可显著增加NK细胞浸润进入肿瘤组织的数量，相比于空白对照组，数量可提升2～3倍左右；并且，通过对肿瘤组织中NK细胞的杀伤受体检测，乐伐替尼能够显著增加NK细胞表面自然杀伤受体CD16以及NKp46的表达水平，进一步发挥了NK细胞的活性，从而提升了NK细胞的活化作用，发挥抗肿瘤的效果。

由于乐伐替尼显现出了促进受体CD16以及受体NKp46的功能，因此，其也有可能成为一种潜在的受体CD16以及受体NKp46的激动剂。

优选地，所述激动剂还包括辅料。

优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述激动剂的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。

本发明提供的激动剂可以由乐伐替尼与辅料制备成各种常用的剂型。

优选地，所述乐伐替尼溶解于含有甲基纤维素的水溶液中。

优选地，所述甲基纤维素的水溶液中甲基纤维素的质量浓度为3％～8％，例如可以是3％、4％、5％、6％、7％或8％等。

优选地，所述甲基纤维素的水溶液中甲基纤维素的质量浓度为5％。

在本发明中，使用甲基纤维素可促进乐伐替尼的溶解，可提升乐伐替尼的作用效果。而如果直接将乐伐替尼溶解使用，则溶解效果较差，会降低乐伐替尼的作用效果。

优选地，所述激动剂的用量为8～10mg/kg，例如可以是8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg等。

本发明中激动剂的用量的单位为mg/kg，含义为相对于1kg重量的动物体或人体，激动剂的用量为mg级。

在本发明中，自然杀伤细胞(NK)激动剂可进一步开发成为抗肿瘤药物，应用到抗肿瘤领域。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了乐伐替尼在制备自然杀伤细胞(NK)激动剂中的应用。乐伐替尼制备得到的激动剂可显著增加NK细胞浸润进入肿瘤组织的数量，相比于空白对照组，数量可提升2～3倍左右；并且，通过对肿瘤组织中NK细胞的杀伤受体检测，乐伐替尼能够显著增加NK细胞表面自然杀伤受体CD16以及NKp46的表达水平，进一步发挥了NK细胞的活性，从而提升了NK细胞的活化作用，来发挥抗肿瘤的效果。

本发明揭示了一种新的抗肿瘤的机制，为乐伐替尼抗肿瘤的研究提供了新的研究策略和研究方向。

附图说明

图1是实施例1中使用乐伐替尼灌胃后的肿瘤重量对比图。

图2是实施例1中液氮保存肿瘤组织提RNA后qRT-PCR结果图。

图3是实施例1中肿瘤单细胞悬液流式染色结果图。

图4是实施例1中肿瘤单细胞悬液流式染色结果统计图。

图5A是实施例1中空白对照组甲醛固定肿瘤组织IHC结果图。

图5B是实施例1中乐伐替尼组甲醛固定肿瘤组织IHC结果图。

图6是实施例1中甲醛固定肿瘤组织IHC结果的统计图。

图7是实施例2中C57BL/6N小鼠中肿瘤重量对比图。

图8是实施例2中在治疗期间连续流式检测血液中的NK细胞结果图

图9是实施例2中肿瘤单细胞悬液流式染色结果图

图10是实施例3中乐伐替尼治疗后NK细胞整合素α4β7表达流式结果图。

图11是实施例3中乐伐替尼治疗后肿瘤血管内皮细胞相应配体VCAM-1检测流式结果图。

图12是实施例3中趋化因子阵列分析结果统计图。

图13A是实施例3中未处理组趋化因子阵列分析代表图。

图13B是实施例3中乐伐替尼组趋化因子阵列分析代表图。

图14是实施例4中乐伐替尼治疗后肿瘤浸润性NK细胞表面CD16流式平均荧光强度分析结果图。

图15是实施例4中乐伐替尼治疗后肿瘤浸润性NK细胞表面NKp46流式平均荧光强度分析结果图。

图16是实施例4中肿瘤组织进行RNA提取后以β-actin为内参的qRT-PCR结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

本发明以下实施例中所用的BALB/c鼠、C57BL/6N鼠购买于北京维通利华。

实施例1

本实施例进行乐伐替尼抑制肿瘤的测试并检测NK细胞瘤内浸润情况

取6-8周雌性BALB/c,C57BL/6N鼠，6只小鼠/笼，饲养于SPF级动物房。一周后分别皮下种瘤Renca和B16-F10，3天后给予10mg/kg/天的乐伐替尼灌胃处理，其中乐伐替尼溶解于含有5％的甲基纤维素的水溶液中。药物治理12天后小鼠处死，收取肿瘤组织，称重后分为三份，一份液氮保存用于qRT-PCR和趋化因子阵列，一份匀浆后制成单细胞悬液流式染色，一份甲醛固定用于IHC。

结果如图1-图6所示。其中，图1中显示了使用乐伐替尼灌胃后的肿瘤重量相比于空白对照组明显减少。

图2中为qRT-PCR结果，由图2中结果可知，与空白对照相比，乐伐替尼治疗的肿瘤组织中NK1.1mRNA表达显着增加。

图3和图4为肿瘤单细胞悬液流式染色及统计结果。图3中从左至右依次为同型对照组、空白对照组和乐伐替尼组，结果显示乐伐替尼组中NK细胞的数量明显多于空白对照组。

图4中的流式统计结果表明与空白对照组相比，乐伐替尼组肿瘤组织中NK细胞数量增加约3倍。

图5A(空白组)和图5B(乐伐替尼组)为甲醛固定肿瘤组织IHC结果(免疫组化结果)。

图6为甲醛固定肿瘤组织IHC结果的统计图，与空白对照组相比，乐伐替尼治疗的肿瘤组织中NK1.1的阳性率提高约6倍。

实施例2

本实施例通过删除NK细胞，测试乐伐替尼对肿瘤生长的抑制作用

取6-8周雌性C57BL/6N鼠，6只小鼠/笼，饲养于SPF级动物房。一周后B16-F10皮下种瘤。种瘤4天后，使用NK细胞删除抗体(PK136)或同型对照抗体预处理荷瘤的C57BL/6N小鼠，随后给予乐伐替尼灌胃处理。期间尾静脉采血流式染色检测NK删除效果，治疗结束后收取肿瘤，称重后匀浆制成单细胞悬液流式染色。

测试的结果如图7、图8和图9所示。图中Len+Iso代表的含义为乐伐替尼联合同型对照抗体，Len+PK136代表的含义为乐伐替尼联合NK细胞删除抗体PK136。

由图7的结果可知，乐伐替尼联合NK细胞删除抗体PK136组的肿瘤重量明显高于乐伐替尼联合同型对照抗体组，表明NK细胞删除后显著削弱了乐伐替尼对肿瘤的生长抑制作用，即乐伐替尼诱导的NK细胞肿瘤浸润在抗肿瘤免疫应答中起主导作用。

图8为在治疗期间连续流式检测血液中的NK细胞，表明NK细胞删除抗体处理的小鼠相对于其他两组NK细胞几乎被完全删除。

图9是对肿瘤组织单细胞悬液流式染色的统计结果，和图8结果相对应。

实施例3

本实施例测试乐伐替尼对NK细胞的浸润性能

瘤内NK细胞浸润增加可能是由于乐伐替尼治疗增加了NK细胞向肿瘤部位的募集。这一过程涉及一系列作用，包括从NK细胞与内皮细胞的粘附开始，然后是趋化因子-趋化因子受体相互作用，调节NK细胞向肿瘤组织的外渗。整合素α4β7存在于大多数外周淋巴细胞上，包括NK细胞。整合素α4β7在肿瘤血管内皮细胞上结合包括VCAM-1(CD106)在内的配体，在淋巴细胞粘附和血淋巴细胞向血管外肿瘤组织的定向迁移中起重要作用。为了研究乐伐替尼驱动NK细胞向肿瘤部位浸润增加的机制，我们通过流式细胞仪检测了整合素α4β7在NK上的表达量及其相应配体VCAM-1(CD106)在肿瘤血管内皮细胞上的表达量并对肿瘤组织进行了趋化因子阵列分析检测相关趋化因子的表达量。

流式检测的结果如图10和图11显示，乐伐替尼治疗后NK细胞整合素α4β7表达增加，肿瘤血管内皮细胞相应配体VCAM-1上升。

趋化因子阵列分析的结果如图12、图13A(未处理组)和图13B(乐伐替尼组)所示。该分析显示，与未处理组相比，乐伐替尼治疗的肿瘤组织中与NK细胞密切相关的趋化因子CXCL9和CXCL10的表达显著上调且具有统计学意义。

这些数据表明肿瘤部位NK细胞浸润增加可能是由于乐伐替尼治疗引起的粘附分子和趋化因子的表达增加。

实施例4

本实施例测试乐伐替尼促进肿瘤浸润性NK细胞活化和毒性

自然细胞毒性受体NCRs(NKp46,NKp44,NKG2-D)和抗体依赖性细胞毒性ADCC(CD16)是两种主要杀伤机制。为此，我们通过对肿瘤单细胞悬液流式染色检测肿瘤浸润性NK细胞表面CD16，NKp46和NKG2-D的表达。同时，对液氮保存的肿瘤组织进行RNA提取及后续的qRT-PCR实验。

结果如图14和图15所示，对流式结果进行平均荧光强度(MFI)分析表明经乐伐替尼治疗后，肿瘤浸润性NK细胞表面CD16和NKp46表达升高。

图16为液氮保存肿瘤组织提取RNA后以(肌动蛋白)β-actin为内参的qRT-PCR结果。结果显示，相对于空白对照组，经乐伐替尼治疗后，肿瘤组织中CD16,NKp46,NKG2-D,FN-γ，穿孔素和颗粒酶B的mRNA表达显著上升且具有统计学差异。

这些数据表明，乐伐替尼的治疗可以促进肿瘤浸润性NK细胞的活化和细胞毒性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的乐伐替尼在制备自然杀伤细胞(NK)激动剂中的应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种乐伐替尼在制备自然杀伤细胞激动剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述激动剂还包括辅料。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述激动剂的剂型包括混悬剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、片剂、乳剂、溶液剂、滴丸剂、注射剂、栓剂、灌肠剂、气雾剂、贴剂或滴剂中的任意一种。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述乐伐替尼溶解于含有甲基纤维素的水溶液中。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述甲基纤维素的水溶液中甲基纤维素的质量浓度为3％～8％。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述甲基纤维素的水溶液中甲基纤维素的质量浓度为5％。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于，所述激动剂的用量为5～10mg/kg；优选为10mg/kg。