CN109790511A - 用于有效生产微生物的新型培养系统 - Google Patents

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Abstract

本发明通常涉及在实验工厂和工业规模上培养和生长细菌、真菌和酵母细胞，更具体地，涉及在疏水性沙基质中的含有预先接种的营养培养基的亲水性颗粒中/上的微生物细胞的培养和生长。

Description

用于有效生产微生物的新型培养系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月5日提交的美国临时申请62/404,516和2016年9月8日提交的美国临时申请385,057的权益，两者均通过引用整体并入本文。
技术领域
微生物如细菌、酵母和真菌的培养对于生产各种有用的生物制剂是重要的。微生物在例如食品工业、制药、农业、采矿、环境修复和废物管理等方面发挥着至关重要的作用。
例如，人们早就已经理解了涉及真菌的共生关系的益处。因此，在大范围的工业中使用真菌存在巨大的潜力。农业可能是真菌产品的所有商业应用中最重要的。作为一个例子，含有益菌根真菌的商品可用于小规模使用。菌根产品商业化的限制因素是每个繁殖体密度的成本，其中将真菌产品应用于具有足够接种物以观察其益处的大规模农业操作是特别昂贵和不可行的。
存在两种微生物培养的主要形式：浸没培养和表面培养。细菌、酵母和真菌都可以使用表面或浸没培养方法生长。两种培养方法都需要用于微生物生长的营养培养基。营养培养基可以是液体或固体形式，通常包括碳源、氮源、盐和适当的其他营养素和微量元素。将pH和氧水平维持在适合给定微生物的值。
在浸没培养的情况下，将微生物浸没在液体培养基(例如酒精，油或营养肉汤)中。用于微生物生长的所有营养成分都是通过从周围的液体培养基中吸收而获得的。使用各种通气方法中的一种或多种提供氧气。该技术的一个缺点是可以溶解在培养基中的氧气量通常是限制因素。
浸没培养方法是资金、操作和劳动力密集型的。例如，这种培养方法需要对大规模上游生产所需的设备进行大量投资。此外，需要下游处理以浓缩、纯化和干燥，用于储存和分配。
与表面培养方法相比，大规模浸没培养方法的另一个显著缺点是被其他微生物污染或噬菌体活化的风险。一旦培养物被污染或被噬菌体感染，污染或噬菌体溶解可迅速扩散到整个液体培养基中，导致整批产品的破坏。
对于工业生产，浸没式发酵系统的其他缺点包括：1)需要连续搅拌培养的微生物和底物；2)使用大量的水；3)需要连续供氧；4)发酵醪液的体积较大；5)生产大量液体废物；和6)高能量需求。
但是，与表面培养相比，浸没培养方法更加可扩展，因此目前在绝大多数微生物及其代谢物的试验和工业生产中使用。
在表面培养方法的情况下，微生物在如琼脂或液体介质的培养基的表面上生长。培养基提供必需的营养。表面培养非常有效地从周围空气中提供足够量的氧，并例如通过吸收到培养基中以有效去除代谢物。由于生长培养物的表面积有限，表面培养系统的广泛污染是罕见的。
然而，表面培养确实存在缺点。例如，与浸没培养方法相比，表面培养对于试验和工业生产而言不是高度可扩展的。大规模的表面处理是极其劳动密集型的，并且需要宽大的表面区域用于必须提供无菌条件的复杂培养箱中的培养。
表面培养还包括在填充床、流化床、托盘、泡沫介质和半透膜中在固体上使微生物生长的技术。
还发现固态发酵(SSF)可用于微生物培养。SSF定义为在不存在或几乎不存在游离水相的情况下，在确定的气相中固体基质上的微生物的生长。SSF已被用于生物过程的开发，如生物修复和生物降解有害化合物，农业工业残留物的生物解毒，生物制浆和例如具有生物活性的二级代谢产物的增值产品(包括抗生素、生物碱、植物生长因子、酶、有机酸、生物表面活性剂和芳香化合物)的生产。
对于工业生产，由于与浸没发酵相比的某些优点，对SSF的兴趣增加；然而，SSF系统存在缺点，包括1)由于缺乏原位灭菌而难以维持系统；2)混合是一个非常困难的过程；3)现有的SSF系统只在初始阶段是无菌的，之后不是。
对于用于大规模生产具有工业实用性的微生物和微生物代谢物的有效培养方法，存在需求。
发明简述
本发明提供了有效培养微生物和生产微生物生长副产物的方法和材料。本发明还提供了用于这种培养和生产的装置。
有利地，本发明的方法结合了浸没和表面培养技术的特性，因此提供了一种混合培养系统，其利用浸没和表面培养的有益特征，同时减少每种方法中固有的负面特征。
在一个实施方式中，该混合培养系统是三步法，包括产生微生物接种物的第一步骤。该第一步骤可以利用例如在一定条件下在液体营养物中标准发酵一段时间进行，以建立用作接种物的细胞数。第二步骤包括将亲水性颗粒与疏水性材料混合以形成基质。该步骤之后是使步骤1中制备的液体接种物与步骤2中制备的亲水-疏水基质物质接触的第三步骤。
在另一个实施方式中，在第一步骤中产生的微生物接种物在第二步中引入亲水性颗粒基质。第三步骤然后包括将接种物涂覆的亲水性颗粒与疏水性材料混合以形成生长基质。
在一个实施方式中，将亲水性颗粒与疏水性材料混合以形成基质的步骤可以在产生微生物接种物的步骤之前进行。
有利地，具有与其相关的接种物的单个颗粒在由疏水性材料形成的生长基质内稳定，从而提供大量微反应器用于微生物生长。
有利地，基质中包含的颗粒具有无菌环境。此外，如果某些颗粒被污染，不会导致整个批次的污染。另外，为各个湿润的亲水性颗粒提供有利的微环境，其具有降低的抑制性代谢物的作用和足够的氧气获取，导致有利的每单位培养体积的高微生物浓度。
根据本发明生长的微生物可以是例如细菌、酵母、真菌和多细胞生物。本发明特别适用于农业、工业、生物浸出、生物修复和其它使用微生物产品的领域的微生物培养。
在一个实施方式中，本发明进一步提供了包含至少一种微生物和/或至少一种微生物代谢产物的组合物，所述微生物代谢产物由使用本发明的混合培养系统生长的微生物产生。组合物中的微生物可以是活性或非活性形式。组合物也可以是干燥形式或流体形式。
本发明的培养方法可以分批或连续过程进行。
在一个实施方式中，本发明提供了利用本发明的混合培养系统培养微生物的设备。
有利地，本发明的方法和设备降低了大规模生产微生物及其代谢物的资金和劳动成本。此外，根据本发明的培养方法减少或消除了在完成培养后浓缩生物的需要。本发明提供了一种培养方法，其不仅显著提高了每单位营养培养基的微生物产物的产量，而且简化了生产并且便于携带。
有利地，在某些实施方式中，本发明的系统利用天然存在的局部微生物及其代谢副产物的能量来滋养、激活和保护作物生态系统以及存在这些生态系统的群落和环境。在其他情况中，当地微生物种群的增强也是有利的，包括但不限于环境修复(例如在石油泄漏的情况下)、畜牧业、水产养殖业、林业、牧场管理、草坪、园艺观赏生产、废物处置和处理、采矿、采油和人类健康，包括在偏远地区。
根据本发明的一个具体实施方式，菌根真菌在无数亲水性颗粒(例如亲水性沙子，珍珠岩，蛭石和/或硅藻土)中生长，所述亲水性颗粒与预先接种的生长培养基相关。这些颗粒悬浮在疏水基质中，有效地彼此隔离。这产生了一个其中多个单独的微反应器同时培养真菌的环境。生长基质的多孔性质允许整个培养物容易、有效地通气。另外，由于各个微反应器的隔离，基本上消除了对无菌环境的需求以及如下所述的污染风险。疏水性材料不利于污染微生物生长，因此任何少量污染颗粒将被增殖真菌的颗粒超过。因此，该系统将固体培养基的分离和通气益处与液体肉汤培养的高最终细胞密度和接种容易性相结合。
发明详述
本发明提供了有效培养微生物和生产微生物生长副产物的材料和方法。这些副产物可包括例如代谢物、聚合物、生物表面活性剂、酶、二氧化碳、有机酸和溶剂。
本发明还提供了用于这种培养和生产的系统。本发明进一步提供了适合于培养微生物和以所需规模生产微生物代谢物的培养方法。有利地，与常规方法相比，本发明可用于将微生物有效培养至高密度，具有较低的污染风险。
本发明的方法结合了浸没和表面培养原理。因此，该方法提供了一种混合培养系统，其利用了浸没和表面培养的有益特征，同时减少了每种方法固有的负面特征。
本发明进一步提供了用于生产生物质(例如，活细胞材料)、细胞外代谢物(例如小分子和大分子)和/或细胞内组分(例如酶和其他蛋白质)的材料和方法。本发明的微生物和微生物生长副产物也可用于转化底物，例如矿石，其中转化的底物是产物。
本发明进一步提供了基于微生物的产品，以及这些产品在许多情况中实现有益结果的用途，包括例如改进的生物修复和采矿、废物处置和处理、加强牲畜和其他动物健康；通过应用一种或多种基于微生物的产品来促进植物健康和生产力。
在具体的实施方式中，本发明的系统提供基于科学的方案，其通过例如促进作物活力、提高作物产量、增强抗虫性和抗病性、控制昆虫、线虫、疾病和杂草、改善植物营养、改善农林业和牧草土壤的营养含量、以及促进改善的且更有效的用水来提高农业生产力。
在一个实施方式中，混合培养系统是三步法，包括产生微生物接种物的第一步骤。该第一步骤可以利用例如在液体营养肉汤中发酵一段时间并在导致产生合适细胞数以用作接种物源的条件下来进行。第二步骤包括将亲水性颗粒与疏水性材料混合以形成基质。该步骤之后是使步骤1中产生的液体接种物与步骤2中产生的亲水-疏水基质接触的第三步骤。
在另一个实施方式中，在第一步骤中产生的微生物接种物在第二步骤中被引入到亲水性颗粒底物。第三步骤然后包括将接种物涂覆的亲水性颗粒与疏水性基质形成材料混合以形成生长基质。
在另一个实施方式中，在第一步骤中产生的微生物接种物在第二步骤中被引入到疏水材料。第三步骤然后包括将接种物和疏水材料与亲水颗粒混合以形成生长基质。
在一个实施方式中，根据本发明的用于培养微生物的方法不包括使接种物生长的步骤。因此，接种物可以例如从第三方获得。在这种情况下，该方法包括以下步骤：
1)混合疏水材料和亲水颗粒以产生基质；
2)使基质与接种有目标微生物的培养基接触，从而产生微反应器基质；
3)在所述微反应器内生长所述微生物。
可替代地，在混合亲水性颗粒和疏水性材料之前，可以将接种物与疏水性材料和/或亲水性颗粒混合。
固体底物(例如，疏水性材料和亲水性颗粒)和微生物接种物的混合可以在生长系统(例如发酵容器)的内部或外部发生。固体底物和接种体如何混合不受限制，只要获得含有微生物接种的微反应器基质的基本均匀的混合物即可。
在一个实施方式中，本发明进一步提供了一种用于生产微生物代谢物的方法，所述微生物代谢物例如为蛋白质、肽、多不饱和脂肪酸、生物表面活性剂和脂质。在一个实施方式中，根据本发明的用于生产微生物生长副产物的方法包括以下步骤：
1)将疏水性材料与亲水性颗粒混合以形成基质；
2)使基质与接种有目标微生物的培养基接触，从而产生生长基质；
3)使微生物在生长基质中生长；
4)收获由所述微生物产生的生长副产物。
由目标微生物产生的微生物生长副产物可以保留在微生物中或分泌到培养基中。
在另一个实施方式中，用于生产微生物生长副产物的方法可以进一步包括浓缩和纯化目标副产物的步骤。
在一个实施方式中，本发明进一步提供了一种组合物，其包含至少一种微生物和/或由所述微生物产生的至少一种微生物生长副产物。所述组合物中的微生物可以是活性或非活性形式。该组合物可以包含或不包含其中生长微生物的生长基质。所述组合物也可以是干燥形式或液体形式。
在一个实施方式中，该组合物适用于农业。例如，该组合物可用于处理土壤、植物和种子。该组合物也可用作杀虫剂。
在一个实施方式中，本发明还根据本地需要提供对材料和方法的定制。例如，用于培养微生物的方法可用于生长位于本地土壤或特定油井或污染场所的那些微生物。在具体的实施方式中，本地土壤可以用作培养方法中的固体底物，以提供天然生长环境。有利地，这些微生物可以是有益的并且更适应当地需要。
根据本发明的培养方法不仅显著提高了每单位营养培养基的微生物产物的产量，而且提高了生产操作的简便性。此外，培养过程可以消除或减少在最终发酵后浓缩微生物的需要。
有利地，在一个实施方式中，与常规培养方法相比，本发明使每克的真菌繁殖能力增加了至少3个对数。
有利地，该方法不需要复杂的设备或高能耗，因此降低了大规模生产微生物及其代谢物的资金和劳动成本。感兴趣的微生物可以在现场小规模或大规模地培养并利用，甚至仍然包封在疏水基质中。类似地，微生物代谢物也可以在需要的地点大量生产。
选定的定义
如本文所用，提及“基于微生物的组合物”是指包含由于微生物或其他细胞培养物的生长而产生的组分的组合物。因此，基于微生物的组合物可包含微生物本身和/或微生物生长的副产物。细胞可以处于营养状态或孢子形式，或两者的混合物。细胞可以是浮游生物或生物膜形式，或两者的混合物。生长的副产物可以是例如代谢物、细胞膜组分、表达的蛋白质和/或其他细胞组分。细胞可以是完整的或裂解的。在优选的实施方式中，细胞处于营养状态，并且和它们在其中生长的肉汤一起存在于基于微生物的组合物中。细胞可以以例如每毫升组合物1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010或1×1011或更多细胞的浓度存在。
本发明进一步提供“基于微生物的产品”，其是在实践中应用以获得所需结果的产品。基于微生物的产品可以简单地是从微生物培养过程中收获的基于微生物的组合物。可替代地，基于微生物的产品可包含已添加的其他成分。这些额外的成分可包括例如缓冲剂、适当的载体(例如水)、添加的用于支持进一步的微生物生长的营养物、和/或有助于追踪施用环境中的微生物和/或组合物的试剂。基于微生物的产品还可包含基于微生物的组合物的混合物。基于微生物的产品还可以包含基于微生物的组合物的一种或多种组分，其已经以某种方式加工，例如但不限于过滤、离心、裂解、干燥、纯化等。
如本文所用，“收获”是指从生长容器中除去一些或全部基于微生物的组合物。
微生物
根据本发明生长的微生物可以是例如细菌、酵母、真菌或多细胞生物。
在一个实施方式中，微生物是细菌，包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。这些细菌可以是，但不限于，例如，大肠杆菌、根瘤菌(例如，大豆根瘤菌、苜蓿中华根瘤菌、费氏中华根瘤菌、豆科三叶变种根瘤菌和菜豆根瘤菌)、慢生根瘤菌(例如，大豆慢生根瘤菌和山黄麻慢生根瘤菌)、芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌)、固氮菌(例如棕色固氮菌和圆褐固氮菌)、Arhrobacter(例如农杆菌放射杆菌)、假单胞菌(例如，Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens(Kluyver))、固氮螺菌(例如巴西固氮螺菌)、氮单胞菌、德克斯氏菌、拜叶林克氏菌、诺卡氏菌、克雷白氏杆菌、棒形杆菌(例如C.xyli subsp.xyi和C.xyli subsp.cynodontis)、蓝细菌、泛生菌(例如，成团泛生菌)、鞘氨醇单胞菌(例如，少动鞘氨醇单胞菌)、链霉菌(例如，灰产色链霉菌、Streptomyces qriseus、可可链霉菌、金色链霉菌和Streptomyces kasugaenis)、链轮丝菌(例如，龟裂链轮丝菌)、Ralslonia(例如，Ralslonia eulropha)、红螺菌(例如，深红螺菌)、黄单胞菌(例如野油菜黄单胞菌)、欧文氏菌(例如，胡萝卜软腐欧文氏菌)、梭菌(例如，Clostridium bravidaciens和Clostridium malacusomae)及其组合。
在另一个实施方式中，微生物是酵母。许多酵母物种适合于根据本发明的生产，包括但不限于酵母菌(酿酒酵母菌，鲍氏酵母菌后代和圆酵母菌)，德巴利氏酵母，Issalchenkia，克鲁维酵母(例如，乳酸克鲁维酵母，脆壁克鲁维酵母)，毕赤酵母(例如巴斯德毕赤酵母)及其组合。
在一个实施方式中，微生物是真菌，包括但不限于例如Starmerella，菌根(例如，泡囊-从枝状菌根(VAM)，从枝菌根(AM)，被孢霉属，须霉属，布拉霉属，破囊壶菌，青霉菌，Phythium，虫霉菌，出芽短梗霉菌，F usarium venenalum，曲霉属真菌，木霉属(例如，里氏木霉,哈茨木霉,绿色木霉和钩状木霉)，根霉菌，内生真菌(例如，Piriformis indica)及其组合。
在具体的实施方式中，微生物是菌根真菌，例如球囊霉属和无梗囊霉属。微生物也可以是丛枝菌根真菌(AMF)。有利地，本发明有助于以商业规模将菌根接种物资源有效且成本有效地引入农业工业中。
亲水颗粒
亲水性颗粒优选是容易用含水接种物润湿的颗粒。优选地，接种物完全包覆并粘附到颗粒上。
亲水性颗粒是任何亲水性底物或材料，例如蛭石，珍珠岩，亲水性含金属的矿石，无定形二氧化硅颗粒状粘土硅藻土，或涂有一种或多种亲水性化合物的任何底物。
这些材料形成松散、通风的颗粒状结构，优选具有0.00001-50mm的颗粒尺寸和大的表面积，更优选具有直径为0.0001-10mm的颗粒尺寸。
亲水性颗粒优选具有小于90°、80°、70°、60°、50°、40°、30°或甚至20°的水接触角。
在优选的实施方式中，颗粒是多孔的，使得接种物渗透到孔、裂缝和其他开放空间中。颗粒的孔隙率可以为例如5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或更多。
疏水材料
疏水材料是任何疏水材料，例如气相二氧化硅、疏水沙、疏水硅沙和涂有疏水化合物的任何颗粒。
商购获得的“Magic Sand”疏水沙可以由涂有疏水化合物的沙制成。这种疏水化合物的存在使得沙粒在暴露于水时彼此粘附并形成圆柱体(以使表面积最小化)。当从水中除去组合物时，它是干燥和自由流动的。Magic Sand也被称为Aqua Sand。
疏水沙的性质可以用普通的沙滩沙实现，沙滩沙含有微小的纯二氧化硅颗粒，并将其暴露于例如三甲基硅烷醇(CH3)3SiOH(一种有机硅化合物)的蒸汽中。这是一种防水或疏水的有机硅分子，可密封沙粒中的裂缝或凹坑，防止水粘附在沙粒上。在暴露时，三甲基硅烷化合物与二氧化硅颗粒结合，同时形成水。因此，沙粒的外部涂有疏水基团。MagicSand在水中呈现银色，因为水分子之间的氢键导致水在沙周围形成气泡。
其他疏水涂层可用于产生疏水材料。在优选的实施方式中，疏水性材料的疏水性为涂覆有三甲基硅烷醇的沙(例如Magic Sand)的疏水性的至少约50％、75％、90％、100％或更多。
在具体的实施方式中，疏水性材料是疏水性沙，其可以是粗糙的或细的。
“沙”包括以下：a)小于小粒并且大于粗粉粒的岩石碎片或碎屑颗粒，直径在1/16至2mm范围内，在运输过程中由于磨损而略微变圆，b)沙尺寸的松散的聚集体、未岩化的矿物或岩石颗粒；未固结或中等固结的沉积物，主要由中粒碎屑组成。该材料通常由石英组成，当无条件地使用术语“沙”时，暗示了硅质组合物；但是颗粒可以是任何矿物组合物或岩石或矿物碎片的混合物，例如珊瑚沙。此外，沙包含大量此类材料，特别是在海滩、沙漠或河床上的材料。
“粗沙”包括以下：a)直径范围为0.5至1mm的沙颗粒的地质术语，以及由粗沙颗粒组成的松散沙聚集体，b)沙颗粒的工程术语，直径范围为2mm(保留在美国10号标准筛上)至4.76mm(通过美国4号标准筛)。
“细沙”包括以下：a)直径范围为0.125-0.25mm的沙颗粒的地质术语，以及由细沙颗粒组成的松散沙聚集体，b)沙颗粒的工程术语，直径范围为0.074mm(保留在美国200号标准筛上)至0.42mm(通过美国40号标准筛)。
这些术语是根据美国矿务局矿业、矿物和相关术语词典定义的。
在一个优选的实施方式中，根据本发明使用的沙是细沙。
接种
本发明涉及将微生物接种剂加入生长基质或生长基质的组分中的一个步骤。
接种步骤通常首先利用温育过程进行，该过程为足够量的用作接种物的微生物的生长和发育提供适当的条件。温育过程可以在适合于产生这种微生物的任何环境中进行，例如实验室或工业环境。温育过程可以例如在需氧条件下进行。在其他实施方式中，温育过程可包括厌氧发酵。接种物可以是例如液体或固体形式。
在一个实施方式中，温育步骤在约5°至约100℃、优选约20°至约60℃、更优选约25°至约50℃下进行，持续时间适于构建作为接种源的细胞数量。该时间可以是例如8小时、12小时、24小时、48小时、4天、7天或更长时间。在一个实施方式中，接种步骤在pH 2至12时进行，优选pH在4至10之间，更优选在6至8之间。
在其他实施方式中，接种体从第三方获得。
在某些实施方式中，生长基质的受控质量流量或生长基质的组分(例如，亲水或疏水底物，或两者的组合)通过接种的接种点。可以通过垂直或水平行进来移动固体。接种的生长基质优选混合至均匀。
在某些实施方式中，通过例如流、喷雾、雾等或其组合将接种液引入到生长基质或其组分。此外，接种液可以均匀且连续地施加，或者间隔地脉冲施加。在某些实施方式中，可以以至少102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL或更高的浓度提供接种体。
在一个实施方式中，生长基质与接种体的体积比为25：1至1：1，优选20：1至5：1、15：1至10：1，或约12：1。
亲水性颗粒与疏水性材料的比例为至少1：25、1：20、1：15、1：10、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1或5：1。
在另一个实施方式中，被接种有目标微生物的液体培养基润湿的固体底物占培养系统的总体积的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％。
生长基质的形成
在一个实施方式中，通过亲水性颗粒和疏水性材料的有效混合产生生长基质。在具体的实施方式中，亲水性颗粒已经用预先接种了目标微生物(接种体)的营养培养基润湿。单个颗粒在疏水材料内稳定，形成生长基质，从而提供大量微反应器。
有利地，包含在基质中的每个颗粒在培养物内具有无菌环境。因此，如果某些颗粒被污染，不会导致整批污染。另外，单独的湿润亲水颗粒具有有利的微环境，其具有降低的抑制性代谢物的作用并且可以充分利用氧气，从而导致每单位培养物中微生物浓度的显著增加。
培养和生长培养基
在一个实施方式中，根据本发明使用的培养基可含有微生物的补充营养物。通常，这些包括碳源，蛋白质或脂肪，氮源，微量元素和/或生长因子(例如，维生素，pH调节剂)。对于本领域技术人员显而易见的是，可以调节营养物浓度、水分含量、pH等，以优化特定微生物的生长。
在一个实施方式中，该方法包括为培养补充氮源。氮源可以是例如无机形式，如硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素和氯化铵，或有机形式，如蛋白质和氨基酸。这些氮源可以单独使用，也可以两种或更多地组合使用。
该方法可以进一步包括为培养补充碳源。碳源通常是：碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇和麦芽糖；有机酸，如乙酸、富马酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙二酸和丙酮酸；醇，如乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和甘油；脂肪和油，如豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油和亚麻籽油等。这些碳源可以单独使用，也可以两种或更多地组合使用。
在一个实施方式中，培养基中包含微生物的生长因子和微量营养素。培养基中还可包括无机营养素，包括微量元素如铁、锌、铜、锰、钼和钴。
在一个实施方式中，还可包括无机盐。无机盐可以是，例如，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，磷酸氢二钠，硫酸镁，氯化镁，硫酸铁，氯化铁，硫酸锰，氯化锰，硫酸锌，氯化铅，硫酸铜，氯化钙，碳酸钙，碳酸钠。这些无机盐可以单独使用，也可以两种或更多地组合使用。
有利地，该方法为生长培养物易于氧化提供了，例如，空气的缓慢运动以除去含氧低的空气并引入富氧空气。富氧空气可以是周期性(例如每天)补充的环境空气。
在一些实施方式中，用于培养的方法可以进一步包括在培养过程之前和/或期间，在液体培养基中添加额外的酸和/或抗微生物剂。抗微生物剂或抗生素用于防止培养物污染。另外，还可以添加消泡剂，以防止在培养和发酵过程中产生气体时泡沫的形成和/或积聚。
在一个实施方式中，培养微生物的方法在约5°至约100℃，优选15°至60℃，更优选25至50℃下进行。在另一个实施方式中，培养可以在恒定温度下连续进行。在另一个实施方式中，培养可以经受变化的温度。
在一个实施方式中，混合物的水分含量应适合于目标微生物。在另一个实施方式中，水分含量可以从20％至90％、优选30至80％、更优选40至60％变化。
在一个实施方式中，混合物的pH应适合于目标微生物。缓冲盐和pH调节剂，例如碳酸盐和磷酸盐，可用于稳定接近最佳值的pH。当金属离子以高浓度存在时，可能需要在液体介质中使用螯合剂。
微生物可以浮游形式生长或作为生物膜生长。在生物膜的情况下，容器内可以具有底物，微生物可以在底物上以生物膜状态生长。该系统还可具有例如施加刺激(例如剪切应力)的能力，该刺激鼓励和/或改善生物膜生长特征。
生长容器
根据本发明使用的微生物生长容器可以是任何用于工业用途的发酵罐或培养反应器。培养过程在容器中进行，容器可以是例如圆锥形或管形。在一个实施方式中，容器可以具有功能控制器/传感器，或者可以连接到功能控制器/传感器，以测量培养过程中的重要因素，例如pH、氧气、压力、温度、搅拌轴功率、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。
优选地，每个生长容器具有其自己的用于至少温度和pH的控制器和测量系统。除了监测和控制温度和pH之外，每个容器还可以具有监测和控制例如溶解氧、搅拌、发泡、微生物培养物纯度、所需代谢物的产生等的能力。
在一个实施方式中，单一类型的微生物在容器中生长。在替代实施方式中，可以在单个容器中生长多个微生物，其可以一起生长而对生长或所得产物没有有害影响。例如，可以在单个容器中同时生长2至3种或更多种不同的微生物。
生长容器可以是例如5升至2000升或更多。通常，容器为10至1500升，优选为100至1000升，更优选为250至750升，或400至600升。
这些容器可以例如由玻璃、聚合物、金属、金属合金及其组合制成。在微生物生长之前，可以对容器进行消毒或灭菌。
在另一个实施方式中，容器还能够监测容器内微生物的生长(例如，细胞数和生长期的测量)。或者，可以从容器中取出每日样品，并通过本领域已知的技术(例如稀释平板技术)进行计算。稀释平板是一种用于估算样品中细菌数量的简单技术。该技术还可以提供可以比较不同环境或处理的指标。
在一个实施方式中，发酵容器/反应器是移动式或便携式生物反应器，其可以提供用于包括合适量的所需微生物菌株的微生物产品的现场生产。因为微生物产品(例如，浆液或流体)是在应用的现场产生的，而不依赖于常规生产的细菌稳定化、保存、储存和运输过程，所以可能产生更高密度的活微生物，从而需要用于现场应用的更小体积的微生物浆料。这允许缩小比例的生物反应器(例如，较小的发酵罐，较小的起始材料、营养物、pH控制剂和消泡剂等的供应)，其促进系统的移动性和便携性。
在一个实施方式中，将方法和培养过程中使用的固体颗粒、发酵培养基、空气和设备消毒。如反应器/容器的培养设备可以与消毒单元(例如高压釜)分离，但是连接到消毒单元。培养设备还可以具有在开始接种之前原位消毒的消毒单元。可以通过本领域已知的方法对空气进行消毒。例如，环境空气可以在补充到容器中之前通过至少一个过滤器。在其他实施方式中，培养基可以进行巴氏消毒或任选地根本不加热，其中可以利用低水分活性和低pH来控制细菌生长。
基于微生物的产品的制备
本发明的基于微生物的产品包括含有微生物和/或微生物生长副产物和任选的疏水性材料、亲水性颗粒和/或其他成分(例如水、载体、佐剂、营养素、粘度调节剂和其他活性试剂)的产品。
本发明的一种基于微生物的产品简单地是含有微生物和/或微生物产生的微生物生长副产物和/或任何残留营养素的发酵培养基。发酵产物可以直接使用而无需提取或纯化。如果需要，可以使用文献中描述的标准提取方法或技术容易地实现提取和纯化。
基于微生物的产品中的微生物可以是活性或非活性形式。可以使用基于微生物的产品而无需进一步稳定、保存和储存。有利地，直接使用这些基于微生物的产品保持了微生物的高生存力，降低了外来试剂和不期望的微生物污染的可能性，并且保持了微生物生长的副产物的活性。
可以从生长容器中除去由微生物生长得到的微生物和/或培养基，并通过例如管道转移以立即使用。
在其他实施方式中，组合物(微生物，培养基，或微生物和培养基)可以放置在适当大小的容器中，考虑到如预期用途、预期的施用方法、发酵罐的大小和从微生物生长设施到使用地点的任何运输方式。因此，放置基于微生物的组合物的容器可以是例如从1加仑至1000加仑或更大。在其他实施方式中，容器是2加仑、5加仑、25加仑或更大。
在从生长容器中收获基于微生物的组合物时，在将收获的产品放入容器和/或用管道输送(或以其他方式运输使用)时，可以添加其他组分。添加剂可以是例如缓冲剂、载体、在相同或不同设施中生产的其他基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长的营养物、植物生长的营养物、追踪剂、杀虫剂、除草剂、动物饲料、食品和其他特定用途的成分。
有利地，根据本发明，基于微生物的产品可包含其中生长微生物的肉汤。按重量计，该产品可以是例如肉汤的至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的肉汤。以重量计，产品中的生物质的量可以是如0％至100％，包括其间的所有百分比。
任选地，产品可在使用前储存。储存时间优选较短。因此，储存时间可以少于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天或12小时。在一个优选的实施方式中，如果产品中存在活细胞，则将产品储存在冷却温度下，例如，低于20℃、15℃、10℃或5℃。另一方面，生物表面活性剂组合物通常可以在环境温度下储存。
本发明的基于微生物的产品可以是例如微生物接种体，生物杀虫剂，营养源，修复剂，健康产品和/或生物表面活性剂。
在一个实施方式中，在培养过程后获得的发酵产物(例如，微生物和/或代谢物)通常具有很高的商业价值。含有微生物的那些产品比那些缺乏微生物的产品具有增强的营养含量。微生物可以存在于培养系统、培养肉汤和/或培养生物质中。可以将培养肉汤和/或生物质干燥(例如，喷雾干燥)，以产生目标产物。
在一个实施方式中，培养产品可以制备成喷雾干燥的生物质产物。可通过已知方法分离生物质，例如离心，过滤，分离，倾析，分离和倾析的组合，超滤或微滤。可以进一步处理生物质培养产品以促进瘤胃旁路。可以将生物质产物与培养基分离，喷雾干燥，并任选地处理以调节瘤胃旁路，并作为营养源添加到饲料中。
在一个实施方式中，培养产品可以用作动物饲料或用作人类的食物补充。培养产品可富含以下物质的至少一种或多种：脂肪，脂肪酸，脂质如磷脂，维生素，必需氨基酸，肽，蛋白质，碳水化合物，甾醇，酶和微量矿物质，如铁、铜、锌、锰、钴、碘、硒、钼、镍、氟、钒、锡和硅。肽可含有至少一种必需氨基酸。
在其他实施方式中，必需氨基酸包封在用于培养反应的主题改进微生物内。必需氨基酸包含在由微生物表达的异源多肽中。需要时，异源肽在合适的微生物(例如真菌)中表达并储存在包涵体中。
在一个实施方式中，培养产品具有高营养含量。结果，更高百分比的培养产品可用于完整的动物饲料中。在一个实施方式中，饲料组合物包含改进的培养产品，其范围为饲料的15％至饲料的100％。
应当理解，本文描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且本领域技术人员在启示下可以建议对其进行各种修改或改变，这些修改或改变包括在本申请的精神和范围内。
实施例1-用蛭石作为亲水底物的细菌培养
蛭石，一种水合硅酸铝镁，是一种廉价且常用的园艺产品，非常多孔。
芽孢杆菌的培养在容器中进行，其中将少量液体肉汤接种物以1:12的比例引入蛭石和疏水沙的混合物中。然后将该生长基质混合至均匀。然后将容纳容器温育并每天用环境空气进行通气处理。
或者，将少量液体肉汤接种物(例如，105CFU/mL或104CFU/mL)与蛭石以1/5体积比混合。将该混合物充分混合，留下涂有接种物的单个颗粒。在含有通气口的适当生长容器中，将该混合物进一步与疏水性沙混合，沙与接种物的体积比为5：1至12：1。
这可以通过搅拌或混合进一步均化。然后将容器在适当的温度下温育并每天至少通气三次。
为了量化细胞密度，采集每日样品并根据连续稀释平板技术进行计数。简而言之，获得样品的连续稀释。当将固定体积的该稀释系列展开到固体生长培养基上并温育时，将获得不同数量的菌落。通过记录菌落的数量、添加的接种体的体积以及稀释的样品的质量或体积，可以计算原始样品中的微生物数量。
在该实施例给出的条件下，在培养的两天内，细胞浓度从104增加至至少109CFU/mL。
实施例2-用珍珠岩作为亲水性底物的细菌培养
珍珠岩是一种来自黑曜石的高度多孔的火山玻璃。它通常用于绝缘和园艺应用。
按照前面对蛭石所述的相同方法，开发了一种培养芽孢杆菌的最佳方法，利用珍珠岩作为亲水底物。这涉及以1:12的比例向均化并温育的珍珠岩和疏水沙混合物中加入液体接种物。
或者，将少量液体肉汤接种物(例如，105CFU/mL或104CFU/mL)与蛭石以1/5体积比混合。将该混合物充分混合，留下小的单个饱和颗粒。在含有通气口的适当生长容器中，将该混合物与疏水性沙基质混合，沙与接种物的体积比为5：1至12：1。
这可以通过搅拌或混合进一步均化。然后将容器在适当的温度下温育并每天至少通气三次。
为了量化细胞密度，采集每日样品并根据连续稀释平板技术进行计数。
计数采样显示该方法还能够在接种后2-3天内(从104)达到至少109CFU/mL的活菌数。
实施例3-用硅藻土作为亲水性底物培养菌根真菌
还开发了用于利用疏水沙和硅藻土培养菌根的方法。
在这种情况下，将含有105CFU/mL真菌的培养物以1/5体积比与硅藻土组合，并混合成一致的细颗粒。然后将其与疏水性沙进一步组合，沙与接种物的体积比为5：1至12：1，优选6：1的沙与接种物比例。
使该混合物在最佳真菌生长条件下在生长容器中温育，所述生长容器通常是具有通气容器的适当尺寸的玻璃瓶，并进一步摇动至均匀。
每天计数样品，在接种后2周内产量为至少10000个繁殖体/克(初始浓度为150个繁殖体/克)。
实施例4-用于农业的微生物的生产
本发明的方法可用于产生大量用于农业应用的浓缩培养物。存在许多用于农业目的的微生物应用实例，包括使用芽孢杆菌、假单胞菌和菌根菌株。
在某些实施方式中，本发明的方法有助于在距离应用近的现场产生大量细菌。微生物可以在现场生长并在生长基质中使用。微生物将整合到土壤中，微生物将以足够的量存在，以改善植物的健康和生长。
在一个实施方式中，本发明提供了基于微生物的组合物，以及使用该组合物促进植物健康、土壤微生物多样性、植物营养、土壤营养能力、优化土壤水分状况、土壤通气、土壤持水能力和降低植物对害虫、疾病和杂草的易感性的方法。这是通过改善植物的天然防御、营养成分、土壤的微生物和毒理健康以及直接影响植物害虫、疾病或杂草来实现的。由于将一种或多种本发明的基于微生物的产品施用于植物和/或其环境，出现这种植物促进作用。
在一个实施方式中，组合物可用于促进植物生长、产量和/或健康。该组合物可具有对抗如真菌和/或细菌植物病原体的活性。该组合物还可具有抗杂草的活性。该组合物可具有抗农业、草皮、观赏植物、林业和/或基于植物的生产的虫害的活性。该组合物可以添加到园艺土壤混合物中；在种植种子或移植时添加；或用手或机器播放到农田、池塘、森林或任何需要其以影响农作物、动物及其害虫的环境。
实施例5-生物浸出
本发明可用于生物浸出过程。在这种情况下，该方法涉及培养能够在细胞内积累金属的微生物。例如，Cupriavidus matallidurans可以将矿石中的金溶解成可溶性离子形式并在细胞内转化成纳米颗粒。
含金矿石可以用作用适当营养培养基润湿的微粒，用于在疏水沙基质中生长细菌。
由于该方法不需要复杂的设备和高能耗，因此可以在矿石的现场安装培养设施。
实施例6-生物修复
本发明可用于生长大量可用于生物修复受污染的土壤和水的细菌和/或真菌。
许多微生物可通过生物修复用于净化，包括例如假单胞菌、节细菌和芽孢杆菌菌株。微生物可以在现场生长并释放，但仍然包封在疏水基质中。当被引入污染的土壤或水中时，净化微生物将大量存在。
实施例7-油生产
本发明提供了基于微生物的产品，以及它们在改进的油生产中的用途。在某些实施方式中，本发明提供了通过用微生物和/或其副产物处理钻井现场(包括井和相关管道)以提高油的回收率来改进油生产的材料和方法。
在一些实施方式中，微生物可以是耐盐的和/或表面活性剂过量产生的微生物及其副产物。这些副产物可包括例如代谢物，聚合物，生物表面活性剂，酶，二氧化碳，有机酸和溶剂。
在优选的实施方式中，与野生型菌株相比，此类菌株的特征在于增强的生物表面活性剂产生。
实施例8-结构害虫
在一个实施方式中，本发明的组合物具有抗结构害虫的活性。这些害虫可以是例如白蚁、蚂蚁或蟑螂。为了控制这些害虫，可以将组合物直接施用于害虫，或施用于建筑物或建筑物附近，使得害虫与组合物接触。
实施例-动物害虫
在另一个实施方式中，本发明的组合物可用于控制动物(包括人)的害虫。这些害虫可以是例如蚊子、苍蝇、线虫、蜱和跳蚤。为了控制这些害虫，可以将组合物直接施用于害虫或其环境，使得害虫与组合物接触。微生物可以是例如苏云金芽孢杆菌。控制可以包括杀死以及减少进食繁殖或其他活性。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和公开均通过引用整体并入本文，包括所有附图和表格，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。
本文中使用关于一种要素或多种要素的如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”等术语的本发明的任何方面或实施方式的描述旨在提供对发明类似方面或实施方式(“由...组成”、“基本上由......组成”或“大体上包括”那特定要素)的支持，除非另有说明或与上下文明显矛盾(例如，本文中描述为包含特定要素的组合物也应理解为描述由该要素组成的组合物，除非另有说明或与上下文明显矛盾)。
本文描述的实施例和实施方式仅用于说明目的，并且对于本领域技术人员而言，可以对其进行各种修改或改变，它们包括在本申请的精神和范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方式的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任何组合)或任何其他发明或其实施方式组合，并且所有这些组合在本发明的范围内，但不是对发明的限制。

Claims (48)

1.一种培养微生物的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a）将疏水材料和亲水颗粒混合以形成基质；
b）使所述基质、所述疏水材料和/或所述亲水颗粒与接种有微生物的培养基接触，从而产生生长基质；和
c）在所述生长基质内使微生物生长。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细菌是芽孢杆菌、贪铜菌或假单胞菌。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是酵母细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是真菌细胞。
6.根据权利要求5的方法，其中所述真菌细胞是菌根或Starmerella。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水性材料和亲水性颗粒是基质形成材料，并且与接种有微生物的培养基混合，基质形成材料与培养基的比例为20：1至5：1。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲水性颗粒和疏水性材料以约5：1至1：5的比例混合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲水性颗粒的直径为约0.0001至10mm。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲水性颗粒具有90°或更小的水接触角。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲水性颗粒的孔隙率为至少约5％。
12.根据权利要求1所述的方法，其中亲水性颗粒选自珍珠岩、蛭石、含金属的矿石和硅藻土。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水性材料是疏水沙。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水沙涂覆有有机硅化合物。
15.根据权利要求14的方法，其中有机硅化合物是三甲基硅烷醇。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述沙是细沙。
17.一种包含通过权利要求1的方法培养的微生物和/或所述微生物的至少一种微生物生长副产物的组合物。
18.根据权利要求17所述的组合物，还包含亲水性颗粒和/或疏水性材料。
19.一种包含微生物、疏水沙和亲水性颗粒的组合物，其中所述亲水性颗粒的直径为约0.0001至10mm并且具有90°或更小的水接触角，并且其中所述微生物以至少104CFU/ml的浓度存在。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述亲水性颗粒具有至少约5％的孔隙率。
21.根据权利要求19的组合物，其中所述疏水沙涂有有机硅化合物。
22.根据权利要求21的组合物，其中所述有机硅化合物是三甲基硅烷醇。
23.根据权利要求19所述的组合物，其中所述沙是细沙。
24.根据权利要求19所述的组合物，其中所述疏水性材料和亲水性颗粒是基质形成材料，并且以基质形成材料与培养基20：1至5：1的比例存在于所述组合物中。
25.根据权利要求19所述的组合物，其中所述亲水性颗粒和疏水性材料以约5：1至1：5的比例存在。
26.根据权利要求19的组合物，其中微生物是细菌。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述细菌是芽孢杆菌、贪铜菌或假单胞菌。
28.根据权利要求19所述的组合物，其中所述微生物是酵母细胞。
29.根据权利要求19所述的组合物，其中微生物是真菌细胞。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述真菌细胞是菌根或Starmerella。
31.一种增加可从含油层中回收的油量的方法，其中所述方法包括将权利要求19的组合物施用到含油层中。
32.一种从油污染的现场降解烃的方法，其中所述方法包括向所述现场施用权利要求19的组合物。
33.一种用于清洁油井杆、管道和/或套管的方法，其中所述方法包括向油井杆、管道和套管结构施用权利要求19的组合物。
34.一种改善植物生长、产量和/或健康的方法，其中所述方法包括向植物或其环境施用权利要求19的组合物。
35.根据权利要求34所述的方法，还包括施用一种或多种营养素。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述组合物包含微生物以及其中生长微生物的基质。
37.根据权利要求34所述的方法，其中，微生物细胞处于营养状态。
38.根据权利要求34所述的方法，其中所述组合物具有抗线虫的活性。
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述组合物具有抗真菌和/或细菌植物病原体的活性。
40.根据权利要求34所述的方法，其中所述组合物具有抗农业、草皮、观赏植物、林业和/或其他基于植物的生产的害虫的活性。
41.根据权利要求34所述的方法，其中所述组合物具有抗杂草的活性。
42.一种控制结构害虫的方法，其中所述方法包括将权利要求19的组合物施用于所述结构或所述结构附近，或直接施用于所述害虫。
43.一种控制动物害虫的方法，其中所述方法包括使害虫与权利要求19的组合物接触。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述组合物具有抗人类害虫的活性。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述组合物具有抗蚊子和/或其幼虫的活性。
46.一种生物浸出矿石的方法，其中所述方法包括向矿石施用权利要求19的组合物。
47.根据权利要求39所述的方法，其中矿石是含金矿石。
48.根据权利要求40所述的方法，其中所述微生物是贪铜菌。
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