KR101262733B1 - 헤테로랍디티스 메기디스의 액체 배양방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 골프장 잔디, 수목,농작물의 뿌리에 피해를 가하는 굼벵이류를 방제하는 고살충성을 갖는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스(Heterorhabditis megidis)를 상업적으로 사용할 수 있는 농도로 배양하는 방법에 관한 것으로, 곤충병원성선충을 액체 대량배양하기 위하여 마이크로스파저(Microsparger)를 이용하여 배지에 산소를 전달하면서 초기 선충접종 농도를 300~4,500/mL로 배양하는 배양방법을 제공함으로서, 고살충력을 갖는 헤테로랍디티스 메기디스를 배양하기 위한 최적환경을 조성하여 상업적으로 이용 가능한 농도 이상으로 배양이 가능하도록 하며 기존 관수 시설을 이용하여 손쉽게 적용, 사용하여 관리비용과 노동력을 절감시킬 수 있는 고살충력을 갖는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 대량배양방법의 제공이 가능도록 한 것이다.
Description
본 발명은 곤충병원성 선충인 헤테로랍디티스 메기디스(Heterorhabditis megidis)의 액체 배양 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 골프장 잔디 및 수목, 농작물의 뿌리에 피해를 가하는 굼벵이류를 방제하는 고 살충성을 갖는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스를 상업적으로 사용할 수 있는 농도로 배양하는 방법에 관한 것이다.
생활이 윤택해지고 여가시간의 증대로 인해 잔디로 형성된 골프장과 축구장 등의 건설이 증가되고 있으며, 친환경 농산물 재배 면적이 증대되고 있는 실정이다.
이러한 잔디와 농작물의 성장을 돕고 병해를 방지하고자 각종 비료와 살충제등이 사용되고 있으나, 이는 대부분 유기합성농약을 사용하고 있으므로, 강우 뒤에는 살포된 독성농약이 주변의 하천이나 지하수로 유출됨으로 환경오염의 주범이 되어 인간의 건강을 위협하고 있다.
따라서, 상기 유기 합성농약의 살포는 제한적으로 이루어지는데 반하여 병충해는 기하급수적으로 증가하고 있어 골프장과 농작물의 피해가 매년 증가하고 있는 실정이다.
특히 상기 잔디에 피해를 주는 해충으로는 잔디의 뿌리를 가해하는 풍뎅이 유충인 굼벵이류인 것으로 방제가 어려워 살충제 과다 사용의 원인이 되고 있으며, 이러한 굼벵이류에는 등얼룩풍뎅이, 녹색콩풍뎅이, 주황긴다리풍뎅이, 주둥무늬차색풍뎅이의 유충 등 8속 12종이 보고되어 왔다.
이 중 대표적으로 피해를 주는 풍뎅이류는, 토양 속 10cm 내외에서 서식하는 등얼룩풍뎅이(Blitopertha orientalis Waterhouse)와 녹색콩풍뎅이(Papillia guadriguttata Fabricius) 등인데, 밀도가 높은 곳은 1m2 당 120-150 마리까지 이르나 지상부에서 발생이 관찰되지 않으므로 예찰이 어렵고 방제가 매우 어려운 실정이다.
상기 풍뎅이류는 유충 시기에 활발한 섭식을 하여 잔디 뿌리를 가해하게 된다. 이와 같이 생육이 완전한 시기의 잔디는 굼벵이들이 가해를 하여도 표면적으로는 표시가 나지 않지만, 잔디가 휴면기를 거치고 이듬해 봄철이 되면 피해지역에 잔디가 올라오지 않고, 이 시기에 피해지역을 중심으로 방제를 시행하여도 이미 굼벵이들은 다른 지역으로 이동을 한 상태이므로, 예찰 및 방제가 매우 어렵다.
현재 굼벵이류의 방제에는 유기인계, 합성피레스로이드계, 클로로니코티닐계 및 티아니코티닐계의 유기농약이 사용되고 있으나 대상 해충이 토양 지하부에 서식하기 때문에 사용에 어려움이 많고, 유충의 약제에 대한 내성유발, 잔디에 대한 약해 유발 등의 문제가 심각하며, 특히 넓은 골프장을 부분 관주 처리에 의한 방법으로 방제하는 일은 매우 비효율적이며 비경제적인 방법이다.
이를 극복하기 위해 곤충병원성선충을 이용한 생물학적방제가 대두되고 있으며, 국제적으로 매우 많은 특허가 존재한다. 하지만 대부분이 곤충병원성선충 중 스테이네마(Steinernema) 속의 캅포캅세(carpocapsae)와 글라제리(glaseri)를 이용하여 방제가 이루어지도록 하고 있으나 온실 등의 제한적인 장소에서만 일부 사용되고 있으며, 대량 배양이 어려운 시점에 있어 농민들도 점차로 사용을 기피하는 추세이다.
이러한 이유는 기주 특이성으로 인한 낮은 살충율과 생존율이 낮아 방제제로써의 제 역할을 수행하지 못하고 있기 때문이며, 대량 배양할 수 있는 기반지식이 없어 생산 수율이 낮고 수요예측이 불가능함은 물론 생산공정에도 고비용이 요구되어 대량생산이 어려움으로 이에 대한 액체 대량 배양 방법의 연구가 절실한 실정이다.
상기의 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 굼벵이류에 대한 고 살충력을 갖는 헤테로랍디티스 메기디스의 배양 최적환경을 조성하여 상업적으로 이용 가능한 농도로 액체 대량 배양이 가능하도록 하는 고 살충력을 갖는 헤테로랍디티스 메기디스의 대량배양방법의 제공을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 특징은, 곤충병원성선충을 배양하기 위한 배양 방법에 있어서, 배지에 곤충병원성선충을 mL 당 3000~4500마리 접종하고, 마이크로스파저(Microsparger)를 이용하여 배지에 산소를 전달하면서 배양하는 것을 특징으로 하는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양방법에 있는 것으로, 최종 배양된 곤충병원성선충의 농도는 200~400×103/mL이다.
상기에서 곤충병원성선충은 소용량 배양기로 종배양한 선충을 이용하여 대용량발효조의 배양액에 접종해 대량 배양한다.
그리고, 배양은 25℃에서 산소요구도(OUR)는 0.63×10-2 mmol O2/L.min으로 이루어지고, 상기 배지의 질소원인 단백질은 10~40g/mL이며, 소포제로 콘오일(corn oil)을 20~60 g/mL로 혼합된다.
상기한 바와 같은 구성을 갖는 본 발명의 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양 방법은, 상세하게는 골프장 잔디, 수목,농작물의 뿌리에 피해를 가하는 굼벵이류를 방제하는 고살충성을 갖는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스(Heterorhabditis megidis)를 상업적으로 사용할 수 있는 농도로 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 배양방법에 의하여 링스파저를 이용한 산소 전달 속도를 나타내는 도면
도 2는 발명의 배양방법에 의하여 마이크로스파저를 이용한 산소 전달 속도를 나타내는 도면
도 3은 헤테로랍디티스 메기디스 접종 마리수가 배양 수율에 미치는 영향을 나타내는 도면
도 4는 헤테로랍디티스 메기디스의 온도별 산소요구도를 나타내는 도면
도 5는 헤테로랍디티스 메기디스의 배양일별 선충발육단계별 개체수를 나타내는 도면
도 6은 본 발명의 헤테로랍디티스 메기디스의 증식 모습을 나타내는 사진
도 2는 발명의 배양방법에 의하여 마이크로스파저를 이용한 산소 전달 속도를 나타내는 도면
도 3은 헤테로랍디티스 메기디스 접종 마리수가 배양 수율에 미치는 영향을 나타내는 도면
도 4는 헤테로랍디티스 메기디스의 온도별 산소요구도를 나타내는 도면
도 5는 헤테로랍디티스 메기디스의 배양일별 선충발육단계별 개체수를 나타내는 도면
도 6은 본 발명의 헤테로랍디티스 메기디스의 증식 모습을 나타내는 사진
이하, 본 발명의 실시예를 설명한다.
곤충병원성선충을 대량 배양하기 위한 배양법에 있어서, 마이크로스파저(Microsparger)를 이용하여 산소를 전달하는 단계와; 곤충병원성선충 접종 마리수에 따른 배양 수율을 확립하는 단계;를 포함하여 이루어진다.
상기 곤충병원성선충은 소용량 배양기로 종 배양한 선충을 접종원으로 하여 대용량발효조의 배양액에 접종해 대량 배양하는 배양 단계가 더 이루어질 수 있다.
상기에서 종배양이란 균을 키울 때 한번에 큰 통에서 키우게 되면 다른 균의 오염이 있을 수 있기 때문에 항상 작은 용량부터 시작하는 배양법으로, 배양과정에서는 최초에 3mL에서 1L로, 1L에서 100L로, 100L에서 1톤의 크기와 같이 점점 키워나가는데, 최초 3mL가 종배양이다.
또한 상기 선충 배양기는 외경이 15cm, 내경 13cm, 두께 1cm, 높이 36cm인, 유리로 된 원통형 7L 선충 전용 배양기를 제작하였다. 내경에 장착할 임펠러로는 2개의 날개가 있는 패들형(paddle impeller)을 이용하였다. 패들형 임펠러의 경우 지름이 6cm 이고 높이가 10cm이며, 하층 임펠러와 바닥 사이의 거리는 13cm로 하였다.
제작된 선충 배양기에 프로브(Do probe)를 부착하고, 프로브로부터 출력되는 신호의 데이터는 컴퓨터를 이용하여 5초 간격으로 자동 저장되도록 하여 컴퓨터에 전달된 전압 값은 계산식에 의해 용존산소농도(%)로 환산되어 화면상에 표기되는 것이 바람직하다.
산소 전달 장치는 통기 구멍 크기가 2㎛ 인 Microsparger로서 외경 10mm, 내경 7mm, 길이 50mm를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 산소 전달계수(KLa)를 구하기 위해, 일반적으로 많이 쓰이고 있는 다이나믹 메써드(dynamic method)를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 선충 배양 단계에서의 선충 출발 접종 농도는 4,000/mL로 하였으며, 최종 배양된 곤충병원성선충의 농도는 상업적으로 이용이 가능한 200~400×103/mL로 이루어지도록 하며, 25℃에서 산소요구도(OUR)는 0.63×10-2 mmol O2/L.min으로 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.
상기, 배양액에서 질소원인 단백질은 선충을 생산하기 위해 10~40g/mL로 혼합 사용하는 것이 바람직하며, 배양과정에서 거품의 발생을 최소화하기 위한 소포제로 콘오일(corn oil)을 20~60 g/mL로 혼합되는 것이 바람직하다.
상기 선충 배양 단계에서 수용성 배지는 115-125℃의 온도에서 14-16 psi 압력으로 살균하는 단계가 선행되어 이루어지는 것이 바람직하다.
이하, 실시 예를 통해 본 발명에 따른 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 대량 배양방법을 상세히 설명한다.
실시예
1. : 통기 구멍 크기의 산소 전달 속도에 미치는 영향
산소 전달 속도는 주로 교반 속도, 기체가 단위 부피당 액체와 맞닿아 있는 표면적에 비례한다. 반응기내에서 도 1의 링스파저(ringsparger)를 사용하여 물(a)과 배지(b)를 사용하여 통기하였을 때 (a)와 같이 물을 매질로 하였을 때 산소 전달 계수(KLa) 값은 5-10h-1 정도였고 (b)와 같이 배지를 매질로 하였을 때는 5-20h-1 정도를 보였다.
도 2의 마이크로스파저(Microsparger)를 사용하여 물(c)과 배지(d)를 사용하여 통기하였을 때 (c)와 같이 물을 매질로 하였을 때 산소 전달 계수(KLa) 값은 5-30h-1 정도였고 (d)와 같이 배지를 매질로 하였을 때는 5-60h-1 정도로, 배지를 사용하였을 때가 높은 것을 관찰하였다.
이것은 배양기내 산소를 공급시 스파저(sparger)에서 나온 공기 방울이 서로 응집하는 현상이 배지 성분들에 의해 완화되어 산소 전달이 증가한 것으로 사료된다.
또한 측정 결과를 보면 스파저(sparger)의 기공(pore) 사이즈가 작은 마이크로스파저(microsparge)가 링스파저(ringsparager)보다 KLa 값이 더 크게 나타났다. 이는 물로 사용하였을 때와 배지를 사용했을 때 모두 같은 경향을 보였다.
이것은 기공사이즈가 작을수록 상대적으로 더 작은 공기가 생성되어 표면적이 증가했기 때문으로 판단된다.
본 실시예를 통하여 배양기내 마이크로스파저(microsparger)를 사용하여 공기를 전달하는 방법을 달리함으로써 산소가 선충 배양에 미치는 영향을 간접적으로 확인할 수 있었다.
실시예 2. : 헤테로랍디티스 메기디스 접종 마리수가 배양 수율에 미치는 영향
도 3을 참조한 바와 같이, 헤테로랍디티스 메기디스의 접종 마리수에 따른 3일 배양 후 배양 최종 수율을 확인한 결과 mL당 4,000마리를 접종하였을 때, mL 당 300×103 마리로 가장 높은 수율을 나타냈으며, 5,000마리를 접종하였을 때는 오히려 수율이 mL당 200×10 3 마리로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
실기예 3. : 헤테로랍디티스 메기디스 산소요구도 측정
도 4를 참조한 바와 같이, 헤테로랍디티스 메기디스의 10, 15, 20, 25, 30℃ 각 온도와 마이크로스파저(microsparger)와 50 rpm의 교반 속도에 따른 산소요구도를 측정한 결과 10, 15℃에서 OUR이 0.7×10-3mmol O2/L.min로 비교적 일정하였으나 20℃에서 급격히 산소요구가 증가하여 배양 적정 온도인 25℃ 부근에서 0.63×10-2 mmol O2/L.min로 급격히 상승하는 것으로 나타났으며 30℃에서는 0.8×10-2 mmol O2/L.min으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4.: 비 생장 속도의 조절에 따른
곤충병원성선충과
공생세균의 배양 양상
배지농도를 조절하여 세균의 비생장 속도를 인위적으로 조절하여 산소가 선충의 배양에 미치는 영향을 간접적으로 측정하였다. 공생세균을 24시간 배양한 후 배양액을 8,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 얻은 상등액, 그리고 0.9% 식염수를 사용하였다.
공생세균은 배지의 부피와 상관없이 배지농도에 따라 비 생장속도와 최종농도가 다르게 유도되었으며 이 과정에서 소비하는 산소의 속도와 양도 차이가 있을 것으로 예측하였다.
선충의 경우 1mL의 배양부피로 선충을 배양하였을 때 세균농도가 1.0×109 cfu/mL 이상으로 유지되는 120시간까지 꾸준한 증식이 이루어 졌으나 3mL의 부피에서는 공생세균의 농도가 증가함에 따라 선충의 농도도 비례하여 감소하였다.
공생세균의 증식이 빠르게 진행될수록 선충 농도의 감소 속도도 함께 증가되는 사실을 확인하였으며 이는 배양액 내의 용존 산소의 농도저하에 의한 것이라 판단된다.
실시예
5. : 저비용 대량 배양 방식
<소포제의 선발>
호기성 발효는 배양기내 산소를 공급하기 위하여 통기를 하기 때문에 배지조성에 의존하여 다량의 거품이 발생하게 된다. 배양기 내의 거품 발생은 배양액의 손실을 초래하는 사이펀 현상(siphon)을 유발할 수 있으며, 또한 거품위에 떠오른 세균이나 선충은 영양분의 결핍 또는 자기 분해로 사멸하기 때문에 가능하면 배양기에서 거품을 억제하는 것이 좋다. 거품의 발생은 배지 중 질소원(단백질) 종류에 크게 영향을 받으므로 질소원 또한 고려되어야 한다. 보통 질소원으로 사용되는 배지 종류에는 peptone, tryptone, yeast extract 등이 있다.
거품 발생을 감소시키는 방법에는 물리적인 방법과 화학적인 방법이 있다. 유리병을 이용한 카보이 배양에서는 기계적인 소포법보다는 화학적인 소포법이 유리하므로 화학적인 소포법을 이용한다. 소포제에는 시약으로 판매되고 있는 시약과 동식물성의 지방산이 있다. 시약으로 시판되는 소포제는 소량으로도 소포효과가 높은 것과 동시에 물질전달을 방해하는 정도가 미미한데 비하여 동식물성 기름은 화학적 소포체에 비해 다량이 첨가되면 아울러 물질전달을 억제시키는 작용을 일으킨다.
그러나 화학적 소포제는 단지 소포작용만을 하지만 동물 또는 식물유래의 기름은 소포작용과 함께 생육촉진 물질과 에너지원으로도 작용하는 장점을 가지고 있다. 따라서 본 발명에서는 소포제로서 콘오일(corn oil)을 선발하여 본 배양에 사용하였다.
<배지의 멸균>
통상적으로 사용되는 배양용기에 수용성 배지를 첨가하여 살균하게 되는 시간은 대개의 경우 115-125℃의 온도에서 14-16 psi에서 15분에서 30분 정도면 충분하게 된다. 그러나 동일한 액량의 배지일 지라도 배지성분이 물에 불용성일 때는 수용성일 때보다 살균에 요구되는 시간이 증가하게 된다.
실시예 6. : 생산된 헤테로랍디티스 메기디스의 살충력 검정
상기 실시예 1,2,3,4에서 생산된 도 6의 본 발명에 따른 헤테로랍디티스 메기디스를 이용한 등얼룩풍뎅이 유충에 대한 살충력 검정을 수행하였다. 채집된 100마리의 건전한 등얼룩풍뎅이를 50×50×30cm 크기의 잔디가 이식된 골프장 토양에서 유충 한 마리 당 100 IJ의 선충을 처리, 10일 경과 후 유충의 생존 유무를 조사한 결과 95%의 살충률을 보였다.
본 발명을 통해 개발된 곤충병원성선충 제제를 이용하여 효과적으로 굼벵이를 방제하기 위해서는 다음과 같은 부분을 고려하여야 할 것으로 생각된다.
우선, 등얼룩풍뎅이를 비롯한 굼벵이류 해충이 1-2령충으로 토양 속 10cm 내외에서 잔디 뿌리를 가해하는 8월 하순에서 10월 상순경을 방제시기로 한다.
굼벵이의 밀도는 50×50cm 크기로 잔디를 떠내고 토양 중 10cm 내외의 굼벵이 수를 처리 전에 조사하여야 하며, 잔디에 수분을 충분히 공급해야 한다. 관수를 하게 되면 굼벵이들이 잔디 뿌리 부근의 지표면으로 이동하므로 효과적으로 방제할 수 있고 곤충병원성선충 또한 수분이 충분히 공급된 토양에서 생존이 가능하기 때문에 살포시기를 가급적이면 강우 직후로 선택한다.
곤충병원성선충 살포 후 효과를 높이기 위해서는 지표면의 잔디를 제거하거나 구멍을 뚫어 선충이 효과적으로 토양에 스며들 수 있도록 해주는 것이 유리할 것으로 판단된다.
Claims (8)
- 곤충병원성선충을 배양하기 위한 배양 방법에 있어서,
마이크로스파저(Microsparger)를 이용하여 배지에 산소를 전달하면서 배양하는 것을 특징으로 하는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양방법. - 삭제
- 곤충병원성선충을 배양하기 위한 배양 방법에 있어서,
배지에 곤충병원성선충을 mL 당 3,000~4,500마리 접종하고, 마이크로스파저(Microsparger)를 이용하여 배지에 산소를 전달하면서 배양하는 것을 특징으로 하는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양방법. - 제 1항 또는 3항에 있어서,
상기 곤충병원성선충은 배양기로 종배양한 선충을 이용하여 발효조의 배양액에 접종해 배양하는 것을 특징으로 하는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양 방법. - 제 1항 또는 3항에 있어서,
최종 배양된 곤충병원성선충의 농도는 200~400×103/mL인 것을 특징으로 하는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양 방법. - 제 1항 또는 3항에 있어서,
배양은 25℃에서 산소요구도(OUR)는 0.63×10-2 mmol O2/L.min으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양 방법. - 제 1항 또는 3항에 있어서,
상기 배지의 질소원인 단백질은 10~40g/mL인 것을 특징으로 하는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양 방법. - 제 1항 또는 3항에 있어서,
배지의 소포제로 콘오일(corn oil)을 20~60 g/mL로 혼합되는 것을 특징으로 하는 곤충병원성선충인 헤테로랍디티스 메기디스의 배양 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020120079196A KR101262733B1 (ko) | 2012-07-20 | 2012-07-20 | 헤테로랍디티스 메기디스의 액체 배양방법 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR101262733B1 true KR101262733B1 (ko) | 2013-05-09 |
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ID=48665872
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| KR1020120079196A KR101262733B1 (ko) | 2012-07-20 | 2012-07-20 | 헤테로랍디티스 메기디스의 액체 배양방법 |
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| Country | Link |
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| KR (1) | KR101262733B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024071540A1 (ko) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | 주식회사 남보 | 헤테로랍디티스 메기디스 nb-gj1-2 선충, 이를 포함하는 병해충 방제용 조성물 및 이를 이용한 방제 방법 |
-
2012
- 2012-07-20 KR KR1020120079196A patent/KR101262733B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ehlers, R-U. et al., BioControl, vol.43, pp.77-86 (1998) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024071540A1 (ko) * | 2022-09-30 | 2024-04-04 | 주식회사 남보 | 헤테로랍디티스 메기디스 nb-gj1-2 선충, 이를 포함하는 병해충 방제용 조성물 및 이를 이용한 방제 방법 |
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