CN109781878A - 一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法，包括如下步骤：(1)烟用香料样品提取回流；(2)烟用香料样品浓缩；(3)将步骤(2)浓缩后的待测样品利用LC‑MS进行分析。本发明自制一种带有固相萃取功能的索氏提取装置，该装置可在密闭条件下对样品进行分离提纯、浓缩，本发明无需像传统的分离提纯、浓缩需要多次转移、浓缩的操作步骤，大大提高了提取效率。

Description

一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变 的方法

技术领域

本发明属于烟用香料化学分析技术领域，特别涉及一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法。

背景技术

香精香料是一种重要的添加剂,与食品安全休戚相关，因此对香精香料进行霉变监控与预防具有重要的现实意义。麦角甾醇和麦角甾酮是真菌细胞膜中的主要甾体类化合物，主要存在于绝大多数的真菌细胞膜中，维系着真菌细胞的正常代谢，据报道麦角甾醇的量与真菌的生物量存在着相关关系(麦角甾醇可作为评价粮食质量安全的敏感指标之一)；因其在大部分植物中不含有或含量很小，其良好的特异性和稳定性使其可作为霉菌污染的标记物，作为质量安全指标在世界范围内得到了广泛的研究与应用。因此可以通过监控香精香料中麦角甾醇和麦角甾酮的含量，从而了解香精香料原料以及相关产品是否存在霉变的情况或者是否存在使用了霉变原料从而导致霉变污染的情况。

目前.对麦角甾酮与麦角甾醇的定性与定量分析研究已经很多，主要报道的方法有毛细管电泳法，高效液相色谱法(HPLC)、LC-MS法和GC-MS法等。由于香精香料基质复杂，有些样品具有高水分高糖分的特点，单纯利用液相色谱紫外检测存在着色谱峰复杂，基质干扰大等定性困难的问题，而利用GC方法存在着前处理复杂的问题，LC/MS-MS在定性和定量方面都具有其优点。

由于香精香料霉变不仅会给生产产品的质量安全带来致命的影响，还会给生产企业带来极大的经济损失，风险成本较大；因此亟待寻找一种可以有效判定香精香料是否霉变或者是否霉变污染的有效判别手段；同时鉴于香精香料的基质特点，以及麦角甾醇和麦角甾酮含量较低的现状，利用稳定、可靠性高的前处理方法是对样品检测准确性和可应用性的有效保障。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法，其有效解决了提取烟用香料中香气成分时干扰大，香气成分回收率低的问题，并且无需多次提取、转移、浓缩等过程，整个样品前处理过程高效简便，保障了检测结果的准确性和精密度。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。

本发明第一方面涉及一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法，包括如下步骤：

(1)烟用香料样品提取回流：在固相萃取柱9中先后加入硅胶颗粒，称取 1～10g烟用香料样品于样品筒8中，将样品筒8与固相萃取柱9密封连接，将色谱进样瓶与圆底烧瓶1的螺纹接口2密封连接，并在圆底烧瓶1中加入50～ 100mL的溶剂并加入浓度为50μg/mL的内标工作液200μL(50μg/mL的胆甾烷醇酮-6-酮溶液)；将固相萃取柱9通过溶剂回流管6与第二接口4密封连接，将隔热导气管5与第一接口3密封连接，将三通转接管7的三个接口分别与样品筒8、密封冷凝管10和隔热导气管5密封连接，密封冷凝管10接通冷凝水，最后将烧瓶置于水浴锅中，60～80℃加热，冷凝回流0.25～4h；

(2)烟用香料样品浓缩：待步骤(1)样品回流提取完毕后，切换三通阀 13，使其与外界空气导通，不断挥发的溶剂通过三通阀13流出并回收，烧瓶1 中的溶液不断被浓缩至溶剂挥发完毕；

(3)将步骤(2)浓缩后的待测样品利用LC-MS进行分析。

本发明优选的实施方案中，步骤(1)加入烧瓶1中的溶剂为乙酸甲酯或二氯甲烷。

本发明优选的实施方案中，步骤(1)还包括在硅胶颗粒上面覆盖无水硫酸钠。

本发明优选的实施方案中，步骤(3)的分析条件为：

液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18(1.7μm,2.1mm× 100mm)；流速：0.4mL/min；柱温：40℃，进样量：5μL；流动相：A为水， B为HPLC级别乙腈；流动相梯度洗脱程序：0.0～6.0min,95％B递增至100％B； 6.0～7.5min保持100％B；8.0min还原为初始状态95％B。质谱条件：电离方式：大气压化学电离源(APCI)；扫描方式：正离子模式扫描；检测方式：多反应监测(MRM模式)；电喷雾电压：5500V；离子源温度：650℃；离子对的驻留监测时间(dwell time)：100ms；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：70psi。

本发明第二方面涉及一种带固相萃取功能的索氏提取装置，包括如下部件：

烧瓶1，烧瓶1上设有第一接口3、第二接口4和螺纹接口2，烧瓶1通过第一接口3与隔热导气管5气流导通连接，隔热导气管5另一端与三通转接管7 气流导通连接，三通转接管7的另外两个接口分别与密闭冷凝管10和样品筒8 气流导通连接，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，样品筒8远离三通转接管7的一端设有筛板12并与固相萃取柱9气流导通连接，固相萃取柱9的另一端通过溶剂回流管6与第二接口4气流导通连接，溶剂回流管6内设有三通阀13。

本发明优选的实施方案中，固相萃取柱9中容纳有硅胶颗粒。

本发明优选的实施方案中，螺纹接口2与色谱进样瓶15可拆卸连接。

本发明优选的实施方案中，隔热导气管5和溶剂回流管6采用软质材料，如 PES；具有一定的伸缩性，方便操作过程中的组装连接。

本发明优选的实施方案中，样品筒8和固相萃取柱9为耐有机溶剂腐蚀的塑料材质，筛板12为塑料筛板或金属筛板，其余部件，例如烧瓶1、三通阀13以及密闭冷凝管10为玻璃材质。

本发明优选的实施方案中，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，当加热回流时提取装置中压力过高时可自动泄压，防止压力过高对装置造成破坏。

本发明优选的实施方案中，固相萃取柱9装填了硅胶颗粒，在进行样品前处理使用前预装填好固相萃取柱9，样品前处理过程中直接使用。

本发明优选的实施方案中，溶剂回流管6内设置三通阀13，可切换溶剂流回烧瓶1或者流出到烧瓶1外，实现样品回流提取和浓缩的切换。

本发明优选的实施方案中，提取装置中所有接口连接处均采用夹紧装置夹紧，接口带有密封环，保证提取装置在使用过程中的密封性，同时保证在泄压阀泄压的压力范围内各接口不会漏气。

本发明中带固相萃取功能的索氏提取装置的工作过程如下：

样品分析时，在固相萃取柱9中加入硅胶颗粒，在样品筒8中装入称量好的样品，并加入浓度为50μg/mL的内标工作液200μL(50μg/mL的胆甾烷醇酮-6- 酮溶液)；在样品上方覆盖一层无水硫酸钠(用于除去溶剂及管道内的水分)，将样品筒8与固相萃取柱9密封连接，在烧瓶1中加入回流提取的溶剂(二氯甲烷和内标物)，将固相萃取柱9通过溶剂回流管6与第二接口4密封连接，将隔热导气管5与第一接口3密封连接，将三通转接管7的三个接口分别与样品筒8、密封冷凝管10和隔热导气管5密封连接，密封冷凝管10接通冷凝水，最后将烧瓶置于水浴锅或油浴锅中加热冷凝回流。样品提取过程中，溶剂回流管6的三通阀13与第二接口4气流导通，挥发的溶剂将固相萃取柱9中所提取的待测样品回流至烧瓶1中，当样品提取完毕后，把三通阀13调整为与外界空气导通的状态，不断挥发的溶剂通过三通阀13流出并回收，此时烧瓶1中的溶液不断被浓缩直至溶剂蒸发完，即可进行色谱检测。

本发明有益效果：

1、本发明自制一种带有固相萃取功能的索氏提取装置，该装置可在密闭条件下对样品进行分离提纯、浓缩，本发明无需像传统的分离提纯、浓缩需要多次转移、浓缩的操作步骤，大大提高了提取效率。

2、本发明自制的提取装置采用全封闭的冷凝管，有效避免了提取溶剂的挥发损失，大大降低了样品前处理过程对实验室环境造成的污染；并且，密闭冷凝器带有泄压阀，压力过高时可自动泄压，有效避免了可能因压力过高对提取装置造成的损坏。

3、本发明自制的提取装置中在溶剂回流管中设置三通阀，通过切换阀门可直接切换样品回流提取和浓缩，整个操作流程不需要转移样品；本装置中还设计了连接色谱进样瓶接口的圆底烧瓶，样品浓缩完成后，旋下色谱进样瓶即可直接进行分析，避免了常规样品尾管浓缩烧瓶浓缩完后，需用吸管把尾管中溶液取出并洗涤尾管和吸管的步骤。进一步简化了样品前处理操作。

5、检测方法以麦角甾醇和麦角甾酮为霉变标志物，采用LC-MS/MS进行定性定量分析，具有准确性可靠性的优点。

附图说明

图1是本发明自制提取净化装置的结构示意图；

图2为麦角甾醇和麦角甾酮标准溶液质谱图；

图3为无花果浸膏霉变样品中麦角甾醇和麦角甾酮的质谱图；

图中附图标记含义如下：

1-烧瓶，2-螺纹接口，3-第一接口，4-第二接口，5-隔热导气管，6-溶剂回流管，7-三通转接管，8-样品筒，9-固相萃取柱，10-密闭冷凝管，11-泄压阀， 12-筛板，13-三通阀，14-硅胶颗粒，15-色谱进样瓶。

具体实施方式

下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。

实施例1

本实施例以2个香料样品为考察对象，检测是否发生霉变。

分析过程如下：

1、配制标准溶液：

a、标准溶液：分别准确称取5.0mg(精确至0.1mg)的麦角甾醇和麦角甾酮于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度均为0.5mg/mL的标准储备液，使用时用甲醇稀释成所需浓度的标准工作液；

b、内标溶液：称取5.0mg的胆甾烷醇酮-6-酮至10mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为0.5mg/mL的内标储备液；使用时稀释成 50μg/mL的内标工作液。

2、样品处理及分析

(1)样品提取、浓缩：在固相萃取柱9内先后填充10g硅胶颗粒和2.5g 无水硫酸钠，然后把待测样品1.0g和2.0g的硅胶充分研磨均匀后加入到样品筒 8中，并加入浓度为50μg/mL的内标工作液200μL(50μg/mL的胆甾烷醇酮-6- 酮溶液)；装好样品后，用夹紧装置密封，并在烧瓶1中加入60mL二氯甲烷溶剂，然后将上述装置放入水浴锅中在60℃下加热回流45min。样品提取完后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1尾管中的样品溶液蒸发至干，浓缩好的样品利用1mL乙腈溶解残余物，并进行LC-MS/MS检测分析麦角甾醇和麦角甾酮的含量。

(2)色谱条件：

液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18(1.7μm,2.1mm×100 mm)；流速：0.4mL/min；柱温：40℃，进样量：5μL；流动相：A为水，B 为HPLC级别乙腈；流动相梯度洗脱程序：0.0～6.0min,95％B递增至100％B； 6.0～7.5min保持100％B；8.0min还原为初始状态95％B。

质谱条件：电离方式：大气压化学电离源(APCI)；扫描方式：正离子模式扫描；检测方式：多反应监测(MRM模式)；电喷雾电压：5500V；离子源温度：650℃；离子对的驻留监测时间(dwell time)：100ms；辅助气Gas1压力： 60psi；辅助气Gas2压力：70psi；各分析物的质谱检测参数见表1,其中“*”代表为定量离子。

表1化合物质谱检测参数

通过检测发现香料A中检测有7.53μg/g的麦角甾醇，5.87μg/g的麦角甾酮，而香料B中未检出麦角甾醇和麦角甾酮，根据实验结果，可以判定香料A 已发生了霉变，而香料B稍微发生霉变。

实施例2

取云南中烟在用的3个香精香料样品(经检测未发生霉变)，1号样品为无花果浸膏，2号样品为酸角浸膏，3号样品为烟草提取物。由于企业都是大批量采购香精香料原料，存在生产过程中多次取用，一段时间的储存，由于储存不当，或者外来污染引入等，可能会出现香精香料霉变的情况，因此采用人工加速霉变的方式：采用增加水分后在80％空气湿度，37℃的高温高湿条件下培养加速霉变，持续跟踪监测霉变情况，发现具有霉变风险较高的产品，可以开展有效的防控措施，从而减少生产企业的经济损失。

1、实验室模拟霉变样品：

取生产企业的3个香精香料样品，采用增加水分后在80％空气湿度，37℃的高温高湿条件下培养加速霉变，持续跟踪监测麦角甾醇和麦角甾酮含量，根据霉变时间长短判定霉变风险。

2、霉变判别方法同实施例1。

3、模拟加速霉变样品情况见表2。

表2霉变样品情况

从表2中发现，原本没有发生霉变的样品，通过高温高湿的加速模拟霉变后，不同天数后均发生了霉变，这说明这些样品的生产使用中应该注意储存条件，例如低温以及保持干燥；另外样品酸角浸膏在5天就发生了霉变情况，说明该样品霉变风险较大，在使用过程中，更需要通过低温以及减少水分接触等措施进行风险防控，这样的判别方式可以为生产企业提供有效的风险预知的数据支持，真正落地风险预警，同时可以通过加速模拟霉变的方法，制定有效的风险防控措施。

Claims (5)

1.一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)烟用香料样品提取回流：在固相萃取柱(9)中先后加入硅胶颗粒，称取1～10g烟用香料样品于样品筒(8)中，将样品筒(8)与固相萃取柱(9)密封连接，将色谱进样瓶与圆底烧瓶(1)的螺纹接口(2)密封连接，并在圆底烧瓶(1)中加入50～100mL的溶剂和内标工作液200μL，将固相萃取柱(9)通过溶剂回流管(6)与第二接口(4)密封连接，将隔热导气管(5)与第一接口(3)密封连接，将三通转接管(7)的三个接口分别与样品筒(8)、密封冷凝管(10)和隔热导气管(5)密封连接，密封冷凝管(10)接通冷凝水，最后将烧瓶置于水浴锅中，60～80℃加热，冷凝回流0.25～4h；

(2)烟用香料样品浓缩：待步骤(1)样品回流提取完毕后，切换三通阀(13)，使其与外界空气导通，不断挥发的溶剂通过三通阀(13)流出并回收，烧瓶(1)中的溶液不断被浓缩至溶剂挥发完毕；

(3)将步骤(2)浓缩后的待测样品利用LC-MS进行分析。

2.根据权利要求1所述的利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法，其特征在于，步骤(1)加入烧瓶(1)中的溶剂为乙酸甲酯或二氯甲烷。

3.根据权利要求2所述的利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法，其特征在于，步骤(1)还包括在硅胶颗粒上面覆盖无水硫酸钠。

4.根据权利要求3所述的利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法，其特征在于，步骤(3)的分析条件为：

液相色谱条件：色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18(1.7μm,2.1mm×100mm)；流速：0.4mL/min；柱温：40℃，进样量：5μL；流动相：A为水，B为HPLC级别乙腈；流动相梯度洗脱程序：0.0～6.0min,95％B递增至100％B；6.0～7.5min保持100％B；8.0min还原为初始状态95％B。质谱条件：电离方式：大气压化学电离源(APCI)；扫描方式：正离子模式扫描；检测方式：多反应监测(MRM模式)；电喷雾电压：5500V；离子源温度：650℃；离子对的驻留监测时间(dwell time)：100ms；辅助气Gas1压力：60psi；辅助气Gas2压力：70psi。

5.根据权利要求1所述的利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测烟用香料霉变的方法，其特征在于，带固相萃取功能的索氏提取装置包括如下部件：

烧瓶(1)，烧瓶(1)上设有第一接口(3)、第二接口(4)和螺纹接口(2)，烧瓶(1)通过第一接口(3)与隔热导气管(5)气流导通连接，隔热导气管(5)另一端与三通转接管(7)气流导通连接，三通转接管(7)的另外两个接口分别与密闭冷凝管(10)和样品筒(8)气流导通连接，样品筒(8)远离三通转接管(7)的一端设有筛板(12)并与固相萃取柱(9)气流导通连接，固相萃取柱(9)的另一端通过溶剂回流管(6)与第二接口(4)气流导通连接，溶剂回流管(6)内设有三通阀(13)。