CN109776414B

CN109776414B - 一种Bcl-2蛋白抑制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109776414B
Application number: CN201910002550.XA
Authority: CN
Inventors: 方浩; 刘仁帅; 刘璐璐; 杨新颖
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2039-01-02
Also published as: CN109776414A

Abstract

本发明涉及一种Bcl‑2蛋白抑制剂及其制备方法和应用，具体涉及式(I)所示的化合物，其立体异构体或其药学上可接受的盐，这些化合物的制备方法，含有这些化合物的药物制剂，以及这些化合物、其立体异构体或其药学上可接受的盐在制备预防或/或治疗因Bcl‑2蛋白表达异常导致的相关哺乳动物疾病的药物中的应用。

Description

一种Bcl-2蛋白抑制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种Bcl-2蛋白抑制剂及其制备方法、药物组合物与医药用途，属于医药技术领域。

背景技术

B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemina/lymphoma-2,Bcl-2)家族蛋白是哺乳动物体内线粒体介导的内源性细胞凋亡通路的关键调控因子。目前已发现的该家族成员根据功能及结构的差异，可分为抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-X_L和Mcl-1等)、多结构域促凋亡蛋白(BAX和BAK)和促凋亡BH3-only蛋白(Bad、Bid、Bim、Puma和NOXA等)三类。

线粒体介导的内源性凋亡通路由遗传损伤、低氧、细胞质钙离子浓度过高等内源性刺激引发。当细胞接受上述凋亡刺激时，促凋亡BH3-only蛋白高表达，竞争结合抗凋亡蛋白，释放其结合的BAX和BAK并使之活化；某些促凋亡BH3-only蛋白(Bim、Bid和Puma)还可直接活化BAX和BAK。活化的BAX和BAK在线粒体外膜寡聚成孔，使线粒体外膜通透性提高，凋亡因子如细胞色素c(Cyt-c)释放进入细胞质。细胞色素c与细胞质Apaf-1结合形成凋亡复合体(apoptosome)，募集效应型caspase-9，使其自催化激活，进而激活下游的应型caspases-3、-6和-7，最终引起细胞死亡。研究发现，肿瘤细胞常通过过表达抗凋亡蛋白，导致抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白比例失衡，以此逃避细胞凋亡。因此，可通过抑制肿瘤细胞中的抗凋亡蛋白来恢复细胞凋亡，从而杀死肿瘤细胞。

至今已有多种抗凋亡Bcl-2蛋白抑制剂被报道，但是只有Venetoclax(ABT-199)得到FDA批准上市，大部分仍处于临床前及临床研究中。由于细胞凋亡途径的复杂性和多样性，现有的Bcl-2蛋白抑制剂无法满足临床应用需求，且易产生耐药性。因此，发展新型抗凋亡Bcl-2蛋白抑制剂是抗肿瘤药物研究中极具挑战性和巨大应用价值的研究课题。

棉酚是一种有效的泛Bcl-2蛋白天然产物抑制剂，是Bcl-2和Bcl-X_L有效的小分子阻断剂，其结构式如下式(A)所示：

因此，本发明包括一系列化合物，它们显示了意想不到的性能，在它们与抗凋亡Bcl-2蛋白结合的选择性和抑制其活性方面(相对于抗凋亡Bcl-X_L蛋白)，显著地高于目前背景技术中公开的化合物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种Bcl-2蛋白抑制剂，本发明还提供该化合物的制备方法和应用。本发明进一步还提供该类化合物的药物组合物及医药用途。

本发明的技术方案如下：

一、Bcl-2蛋白抑制剂

一种式(I)所示的化合物，其立体异构体、或其药学上可接受的盐，

其中，

X₁和X₂分别独立的代表氢原子或者卤素原子；

R₁代表被1-3个取代基取代或者未被取代的C₁-C₁₀烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，联苯基，萘基或者3-8元杂环基，所述的取代基选自羟基，氨基，卤素原子，硝基，氰基，C₁-C₆烷氧基，C₁-C₆烷基，被1-3个氟原子取代的C₁-C₆烷氧基或者被1-3个氟原子取代的C₁-C₆烷基；

R₂代表被1-3个取代基取代或者未被取代的C₁-C₁₀烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，联苯基，萘基或者3-8元杂环基，所述的取代基选自羟基，氨基，卤素原子，硝基，氰基，C₁-C₆烷氧基，C₁-C₆烷基，被1-3个氟原子取代的C₁-C₆烷氧基或者被1-3个氟原子取代的C₁-C₆烷基；

R₃代表氯原子或者-NH-(CH₂)_n-R₄；其中，n代表0-4的整数；

R₄代表C₁-C₁₀烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，萘基，联苯基，3-8元杂环基，5-10元稠环基，5-12元螺环基，6-10元桥环基或者-O-R₅，其中R₅代表苯基，萘基，联苯基，3-8元杂环基，5-10元稠环基，5-12元螺环基，6-10元桥环基。

根据本发明优选的，

R₁代表被1-3个取代基取代或者未被取代的C₁-C₆烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，联苯基或者5-6元杂环基，所述的取代基选自羟基，氨基，卤素原子，硝基，氰基，C₁-C₄烷氧基，C₁-C₄烷基，被1-3个氟原子取代的C₁-C₄烷氧基或者被1-3个氟原子取代的C₁-C₄烷基；

R₂代表被1-3个取代基取代或者未被取代的C₁-C₆烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，联苯基或者5-6元杂环基，所述的取代基选自羟基，氨基，卤素原子，硝基，氰基，C₁-C₄烷氧基，C₁-C₄烷基，被1-3个氟原子取代的C₁-C₄烷氧基或者被1-3个氟原子取代的C₁-C₄烷基；

R₃代表氯原子或者-NH-(CH₂)_n-R₄，其中，n代表0-4的整数；

R₄代表C₁-C₆烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，萘基，5-6元杂环基，8-10元稠环基或者-O-R₅，其中R₅代表苯基，萘基，5-6元杂环基或者8-10元稠环基。

根据本发明进一步优选的，

R₁代表被1个取代基取代或者未被取代的C₁-C₆烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，联苯基，吡啶基，哒嗪基，吡嗪基，嘧啶基，吡咯基，吡唑基，噻唑基，噻吩基，异噻唑基，四氮唑基，咪唑基或者呋喃基，所述的取代基选自卤素，硝基，氰基，C₁-C₄烷氧基或者C₁-C₄烷基；

R₂代表被1个取代基取代或者未被取代的C₁-C₆烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，联苯基，吡啶基，哒嗪基，吡嗪基，嘧啶基，吡咯基，吡唑基，噻唑基，噻吩基，异噻唑基，四氮唑基，咪唑基或者呋喃基，所述的取代基选自卤素，硝基，氰基，C₁-C₄烷氧基或者C₁-C₄烷基；

R₃代表氯原子或者-NH-(CH₂)_n-R₄，其中，n代表0，1，2或者3；

R₄代表C₁-C₆烷基，C₃-C₈环烷基，苯基，萘基，吡啶基，哒嗪基，吡嗪基，噻唑啉基，嘌呤基，吲哚基，喹啉基，嘧啶基，吡咯基，吡唑基，噻唑基，噻吩基，异噻唑基，四氮唑基，咪唑基，三嗪基，呋喃基或者-O-R₅，其中R₅代表苯基，萘基，吡啶基，哒嗪基，吡嗪基，噻唑啉基，嘌呤基，吲哚基，喹啉基，嘧啶基，吡咯基，吡唑基，噻唑基，噻吩基，异噻唑基，四氮唑基，咪唑基，三嗪基或者呋喃基。

根据本发明再进一步优选的，

X₁和X₂分别独立的代表氢原子或者溴原子；

R₁代表被1个取代基取代或者未被取代的C₁-C₄烷基，苯基或者联苯基，所述的取代基选自卤素，硝基，氰基或者甲氧基；

R₂代表被1个取代基取代或者未被取代的C₁-C₄烷基，苯基或者联苯基，所述的取代基选自卤素，硝基，氰基或者甲氧基；

R₃代表氯原子或者-NH-(CH₂)_n-R₄，其中，n代表0，1或者2；

R₄代表环戊基，环己基或者苯氧基。

根据本发明更进一步优选的，本发明的化合物为下列之一：

以上优选化合物，后面的括号内的编号是对应于下面反应路线及表1中的化合物结构的编号。

发明详述

本文中所用的术语和定义含义如下：

本发明所述的“卤素原子”包括氟原子、氯原子、溴原子、碘原子。

本发明所述“C_1-10烷基”指含有1～10个碳原子的烷烃部分去除一个氢原子衍生的直链或支链的烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丙基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基，1-乙基-2-甲基丙基，庚基，辛基，壬基和癸基。优选C_1-6烷基，更优选C_1-4烷基，术语“C_1-6烷基”、“C_1-4烷基”指上述实例中的含有1～6个、1～4个碳原子的具体实例。

本发明所述“C_1-6烷氧羰基”为术语“C_1-6烷氧基”通过羰基与其他结构相连接的基团，如甲氧羰基、乙氧羰基、丙氧羰基、异丙氧羰基、丁氧羰基、异丁氧羰基、叔丁氧羰基、仲丁氧羰基、戊氧羰基、新戊氧羰基、己氧羰基等。

本发明所述的“C_3-8环烷基”是指3～8个碳原子的烷烃部分去除一个氢原子衍生的环状烷基，如环丙基、环丁基、1-甲基环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。优选C_4-7环烷基、C_4-6环烷基和C_5-6环烷基。

本发明所述“3-8元杂环基”是指含有一至多个杂原子的3-8元环状基团，所述“杂原子”是指氮原子、氧原子、硫原子等。“杂环基”包括饱和或不饱和的单杂环基和饱和或不饱和的稠杂环基。

所述“饱和或不饱和的单杂环基”的实例有：环氧乙烷基、二氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、氮杂环丙烷基、2H-氮杂环丙烷基、二氮杂环丙烷基、3H-二氮杂环丙烯基、氧氮杂环丙烷基、氧杂环丁烷基、1,2-二氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、1,2-二硫杂环丁烯基、氮杂环丁烷基、1,2-二氮杂环丁烷基、氮杂环丁二烯基、1,2-二氮杂环丁烯基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、2,5-二氢噻吩基、四氢噻吩基、吡咯基、二氢吡咯基、吡咯烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、1,3-二氧杂环戊烯-2-酮基、1,2-二硫杂环戊烯基、1,3-二硫杂环戊烷基、咪唑基、4,5-二氢咪唑基、咪唑烷基、吡唑基、4,5-二氢吡唑基、吡唑烷基、噁唑基、4,5-二氢噁唑基、异噁唑基、4,5-二氢异噁唑基、2,3-二氢异噁唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、噻唑基、4,5-二氢噻唑基、异噻唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、四唑基、2H-吡喃基、2H-吡喃-2-酮基、3,4-二氢-2H-吡喃基、4H-吡喃基、四氢吡喃基、4H-吡喃-4-酮基、吡啶基、2-吡啶酮基、4-吡啶酮基、哌啶基、1,4-二氧杂环己二烯基、1,4-二硫杂环己二烯基、1,4-氧硫杂环己二烯基、1,4-二氧杂环己烷基、1,3-二氧杂环己烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、4H-1,2-噁嗪基、6H-1,2-噁嗪基、2H-1,3-噁嗪基、4H-1,3-噁嗪基、6H-1,3-噁嗪基、2H-1,4-噁嗪基、4H-1,4-噁嗪基、5,6-二氢-4H-1,3-噁嗪基、吗啉基、2H-1,3-噻嗪基、4H-1,3-噻嗪基、5,6-二氢-4H-1,3-噻嗪基、6H-1,3-噻嗪基、2H-1,4-噻嗪基、4H-1,4-噻嗪基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、1,2,3-三嗪基、1,2,4-三嗪基、1,3,5-三嗪基、1,2,4,5-四嗪基、氧杂环庚三烯基、硫杂环庚三烯基、1,4-二氧杂环辛三烯基、氮杂环庚三烯基、1,2-二氮杂环庚三烯基、1,3-二氮杂环庚三烯基、1,4-二氮杂环庚三烯基、氮杂环辛四烯基、1,4-二氢-1,4-二氮杂环辛三烯基等。

本发明所述“5-10元稠环基”是指一类由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子连接起来形成的含有5-10个碳原子的稠环结构。包括“5-10元饱和稠环”及“5-10元不饱和稠环”。如双环[3.1.0]己烷、双环[4.1.0]庚烷、双环[3.2.0]庚烷、双环[4.2.0]辛烷、八氢十五烯、双环[3.3.0]辛二烯、1,2,3,4-四氢十五烯、八氢-1H-茚、十氢萘、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、二苯并呋喃基、苯并[b]噻吩基、苯并[c]噻吩基、吲哚基、异吲哚基、咔唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、2H-色原烯基、2H-色原烯-2-酮基、4H-色烯基、4H-色烯-4-酮基、色满基、喹啉基、异喹啉基、2-喹啉酮基、4-喹啉酮基、1-异喹啉酮基、吖啶基、菲啶基、4H-1,3-苯并噁嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、酞嗪基、噌啉基、2,3-二氢杂萘、喹唑啉基、3,4-二氢喹唑啉基、嘌呤基、1,8-萘啶基、1,7-萘啶基、1,6-萘啶基、1,5-萘啶基、2,7-萘啶基、2,6-萘啶基、蝶啶基、喹喔啉基、1,2-二氢喹喔啉基、吩嗪基、四氢咪唑并[4,5-c]吡啶基、3-氧代-1,3-二氢异苯并呋喃基、4,6-二氢-1H-呋喃并[3,4-d]咪唑基、3a,4,6,6a-四氢-1H-呋喃并[3,4-d]咪唑基、4,6-二氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑基、4,6-二氢-1H-吡咯并[3,4-d]咪唑基、4,5,6,7-四氢-1H-苯并[d]咪唑基、1H-吡唑并[3,4-b]吡啶基等。

本发明所述“5-12元螺环基”是指一类至少有两个环共享一个原子形成的含有5～12个碳原子的结构。包括“5-12元饱和螺环”及“5-12元不饱和螺环”。5-12元饱和螺环基是指该螺环基中的所有环均为饱和的环状基团，具体实例包括但不仅限于：

等环状结构取代任意可取代的氢原子所形成的基团等。5-12元部分饱和螺环基，是指该螺环基中至少有一个环为不饱和的环状基团，具体实例包括但不仅限于：

等环状结构取代任意可取代的氢原子所形成的基团等。优选7-10元螺环基，包括“7-10元饱和螺环基”及“7-10元不饱和螺环基”。

本发明所述“6-10元桥环基”是指任意两个环共用两不直接相连的原子形成的含有6～10个碳原子的结构。包括“6-10元饱和桥环”及“6-10元不饱和桥环”。如双环[2.1.1]己烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[3.2.0]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、双环[3.2.1]辛烷、双环[3.3.0]辛烷、双环[3.3.1]壬烷、双环(4.3.0)壬烷、4-氮杂双环[5.3.0]癸烷、双环[2.2.1]庚-5-烯、双环[3.2.1]辛-6-烯、双环(4.3.0)壬-5-烯、双环戊二烯等。

本发明所述“0-4的整数”是指0、1、2、3、4；

本发明的通式(Ⅰ)所示化合物可以通过公知的方法制成药学上可接受的盐，该盐是指式(Ⅰ)所示化合物与酸或碱混合制成的盐。

适宜的酸加成盐是由形成无毒盐的酸形成。具有代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、碳酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐(digluconate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐(hemisulfate)、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、谷氨酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(isethionate)、乳酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐(nicotinate)、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐(picrate)、三甲基乙酸盐(pivalate)、丙酸盐、蔗糖盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、对甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐及十一酸盐。

碱加成盐可在化合物的最后分离和纯化过程中，通过使含有羧酸的部分与适当的碱(如但不限于药用可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)或者与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应原位制备。药用可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子，如但不限于锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，以及非毒性季氨和胺阳离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺等。其它可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。

本发明的一种新的Bcl-2蛋白抑制剂有一个或者更多的手性中心。合成得到的是消旋体，所需要的对映体纯的化合物可以通过手性拆分的方法得到：可以通过具有手性固定相的色谱法(像高压制备液相、超临界流体色谱)。手性填料包括但不限于：ChiralcelOJ-H,Chiralpak AD-H,Chiralpak IA,Chiralpak AS-H。对映体纯的含有螺环的二氢吡唑类化合物可以像消旋的含有螺环的二氢吡唑类化合物一样进一步衍生化。

包含NH，C(O)OH，OH或SH部分的本发明的化合物可以具有连接到其的形成前药的部分。形成前药的部分是通过代谢过程除去的并且在体内释放具有游离的羟基、氨基或羧酸的化合物。前药可用于调节化合物的药物动力学性能，如溶解度和/或疏水性，在胃肠道中的吸收率，生物利用率，组织穿透率和清除比率。

如上所述的取代基自身还可被一个或多个取代基取代。这样的取代基包括在C.Hansch和A.Leo,Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistryand Biology(1979)中列出的那些取代基。优选的取代基包括烷基，烯基，烷氧基，羟基，氧基，硝基，氨基，氨基烷基(如氨甲基等)，氰基，卤素，羧基，羰基烷氧基(如羰基乙氧基等)，硫基，芳基，环烷基，杂芳基，杂环烷基(如哌啶基，吗啉基，吡咯基等)，亚氨基，羟烷基，芳基氧基，芳基烷基及其结合。

二、Bcl-2蛋白抑制剂的制备方法

一种Bcl-2蛋白抑制剂的制备方法，步骤包括：起始原料L-酪氨酸1经二溴代得到中间体2，中间体2通过Pictet-Spengler反应得到关键中间体3；中间体3经甲酯化、N-Boc保护的得到中间体4；中间体4氢化脱溴、O-烷基化和脱Boc保护得到中间体5a和5b，或只通过O-烷基化和脱Boc保护得到中间体5c-5k；中间体5a-5k经N-烷基化得到6a-6w；中间体6a-6w甲酯水解后，通过混合酸酐法与不同苯磺酰胺反应得到B1-B30所示化合物。

合成路线如下：

其中，R₁、R₂、R₃的定义如前文所定义；

试剂和条件：a)溴素，冰醋酸，室温；b)多聚甲醛，乙二醇二甲醚，浓盐酸，75℃；c)氯化亚砜，甲醇，85℃；d)二碳酸二叔丁酯，三乙胺，1,4-二氧六环/水体积比2:1，0℃→室温；e)10％钯碳，三乙胺，甲醇，室温；f)(i)各种取代的溴苄或1-碘丙烷，碳酸钾，丙酮，65℃；(ii)饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液，室温；g)各种取代的溴苄或1-碘丙烷，碳酸钾，乙腈，85℃或氢化钠，N,N-二甲基甲酰胺，0℃→室温；h)1mmol/L氢氧化钠溶液，四氢呋喃，50℃；i)(i)氯甲酸异丁酯，N-甲基吗啉，四氢呋喃，0℃→室温；(ii)各种取代苯磺酰胺，氢化钠，四氢呋喃，-20℃；

f)中所述的各种取代的溴苄是指溴苄、3-氰基溴苄、3-甲氧基溴苄、4-溴溴苄、4-氰基溴苄、4-硝基溴苄、4-苯基溴苄、4-(4-甲基苯基)溴苄；g)中所述的各种取代的溴苄是指溴苄、3-氰基溴苄、3-甲氧基溴苄、4-氰基溴苄、4-硝基溴苄、4-苯基溴苄；i)中所述的各种取代苯磺酰胺是指3-硝基-4-氯苯磺酰胺、3-硝基-4-环戊胺基苯磺酰胺、3-硝基-4-(环己基甲基)胺基苯磺酰胺、3-硝基-4-(苯氧乙胺基)苯磺酰胺。

本发明中所涉及的“室温”具体的温度范围是25-30℃。

合成路线中目标化合物的结构式如下表1所示：

表1目标化合物的结构式

根据本发明优选的，本发明化合物的制备方法，以化合物(S)-7-(苄氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B1)为例，具体制备步骤如下：

(1)(S)-2-氨基-3-(3,5-二碘-4-羟基苯基)丙酸氢溴酸盐(2)的合成

将10.00g L-酪氨酸溶于100mL冰醋酸，缓慢滴加含26.46g的溴素的冰醋酸溶液20mL，室温反应4小时；旋除冰醋酸，粗品经乙醚洗涤，得21.21g白色固体，收率96％；

(2)(S)-6,8-二碘-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸盐酸盐(3)的合成

将21.21g化合物2溶于190mL浓盐酸中，依次加入15.5mL乙二醇二甲醚和5.90g多聚甲醛，缓慢升温至75℃；30分钟后，依次补加7.8mL乙二醇二甲醚和4.00g多聚甲醛，75℃反应70小时；冰浴冷却30分钟，过滤；滤饼乙二醇二甲醚洗涤，得到11.20g粉红色固体，收率57％；

(3)2-叔丁基-3-甲基-(S)-6,8-二溴-7-羟基-3,4-二氢异喹啉-2,3(1H)-二羧酸酯(4)的合成

将11.20g化合物3分散于160mL甲醇中，冰浴条件下滴加10.5mL氯化亚砜，冰浴继续反应30分钟后，转移到油浴，回流4小时；旋除溶剂，固体以体积比1:2的乙醚/正己烷洗涤，再分散于体积比2:1的150mL 1,4-二氧六环/水混合溶剂中；冰浴条件下，依次加入15.3mL三乙胺和9.03g二碳酸二叔丁酯，转移至室温反应过夜；6mmol/L盐酸调节反应液pH为5～6，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品经硅胶柱层析纯化，得10.70g白色固体，收率79％；

(4)(S)-7-苄氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酯盐酸盐(5a)的合成

向80mL含3.56g化合物4的甲醇溶液中依次加入1.97mL三乙胺和0.35g 10％Pd/C，室温常压氢化反应8小时；硅藻土过滤，滤液浓缩；固体重新分散于50mL乙腈，依次加入3.17g碳酸钾和1.09mL苄溴，回流8小时；乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品溶解于98mL氯化氢气体饱和的乙酸乙酯中，室温反应过夜；过滤，干燥得1.40g白色固体，总收率54％。

(5)(S)-7-苄氧基-2-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酯(6a)的合成

将1.12g化合物5a以饱和碳酸氢钠溶液中和得游离胺，游离胺溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺，冰浴条件下加入0.16g氢化钠，20分钟后再加入0.33mL 1-碘丙烷；室温反应1小时后，用水淬灭反应；乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品经硅胶柱层析纯化，得0.88g无色油，收率77％；

(6)(S)-7-(苄氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B1)的合成

向11mL含0.88g化合物6a的四氢呋喃溶液加入11mL 1mmol/L氢氧化钠溶液，油浴50℃反应8小时；浓缩，调节pH为2～3，过滤沉淀，干燥备用；

溶液A：冰浴条件下，向10mL含0.17g氢化钠的无水四氢呋喃悬浊液中分批加入0.48g 4-氯-3-硝基苯磺酰胺，自然升温至室温，反应4小时；

溶液B：-20℃条件下，将0.56g以上步骤(6)干燥好的固体溶于10mL无水四氢呋喃，加入0.21mL N-甲基吗啉，反应15分钟；然后缓慢滴入0.25mL氯甲酸异丁酯，继续反应45分钟；

将溶液B缓慢滴入溶液A中，室温反应过夜；乙酸乙酯萃取，5％柠檬酸溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品经硅胶柱层析纯化，得0.51g黄色固体即为化合物B1，收率54％。

所述化合物的具体操作步骤将在实施例中将加以详细说明。

本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene,Protecting Groupsin Organic Synthesis.

三、Bcl-2蛋白抑制剂的应用

式(I)所示化合物在制备用于预防和/或治疗因Bcl-2表达异常导致的相关哺乳动物疾病药物中的应用，所述的与Bcl-2活性异常表达相关的哺乳动物疾病选自癌症、神经变性疾病、病毒感染、炎症、疟疾或糖尿病相关疾病。

式(I)所示化合物的化合物，其立体异构体或其药学上可接受的盐的药物制剂，包含一种或多种药用载体。

一种药物组合物，含有式(I)所示的化合物，其立体异构体或其药学上可接受的盐和一种或多种治疗活性物质，所述治疗活性物质选自其他类的Bcl-2抑制剂，抗肿瘤药物，抗癌药物或者化疗剂。

本本所述的癌症包括膀胱癌，脑癌，乳腺癌，骨髓癌，子宫颈癌，慢性淋巴细胞性白血病，结肠直肠癌，食道癌，肝细胞癌，淋巴细胞性白血病，滤泡性淋巴瘤，T细胞或B细胞源的淋巴恶性肿瘤，黑素瘤，粒细胞性白血病，骨髓瘤，口腔癌，卵巢癌，非小细胞肺癌，慢性淋巴细胞性白血病，骨髓瘤，前列腺癌，小细胞肺癌或脾癌等。

本文所述的神经变性病(Neurodegenerative Diseases)是指由于神经元变性、凋亡所导致的神经系统退行性疾病。

具有式(I)的化合物，当与烷基化剂，血管生成抑制剂，抗体，抗代谢剂，抗有丝分裂剂，抗增殖剂，抗病毒剂，极光激酶抑制剂，其它细胞凋亡启动子(例如，Bcl-XL，Bcl-w和Bfl-1)抑制剂，死亡受体途径的活化剂，Bcr-Abl激酶抑制剂，BiTE(双特异性T细胞接合器(Bi-Specific T cell engager))抗体，抗体药物缀合物，生物响应改性剂，依赖于细胞周期蛋白的蛋白激酶抑制剂，细胞周期抑制剂，环加氧酶-2抑制剂，DVDs，白血病病毒癌基因同系物(ErbB2)受体抑制剂，生长因子抑制剂，热休克蛋白(HSP)-90抑制剂，组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂，激素疗法，免疫制剂(immunologicals)，细胞凋亡蛋白质的抑制剂的抑制剂(IAPs)，插入抗生素，激酶抑制剂，驱动蛋白抑制剂，Jak2抑制剂，雷帕霉素抑制剂的哺乳动物目标，microRNA's，促细胞分裂剂-活化的胞外信号调节激酶抑制剂，多价结合蛋白，非类固醇抗炎药物(NSAIDs)，聚ADP(腺苷二磷酸)-核糖聚合酶(PARP)抑制剂，铂化疗药物，polo样激酶(Plk)抑制剂，磷酸肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂，蛋白体抑制剂，嘌呤同型物，嘧啶同型物，受体酪氨酸激酶抑制剂，etinoids/deltoids植物生物碱，小抑制性核醣核酸(siRNAs)，局部异构酶抑制剂，泛素连接酶抑制剂等一起，以及与这些药剂中的一个或多个组合使用时，被预计是有用的。

具有式(I)的化合物可以与其它化疗剂相结合，如ABRAXANE(ABI-007)，ABT-100(法尼基转移酶抑制剂)，

(Ad5CMV-p53疫苗)，

或

(洛伐他汀)，

(poly I:poly C12U，一种合成RNA)，

(依昔舒林)，

(帕米膦酸)，arglabin，L-天冬酰胺酶，阿他美坦(1-甲基-3,17-二酮-雄(甾)烷-1,4-二烯)，

(他扎罗汀)，AVE-8062(combreastatin衍生物)BEC2(米妥莫单抗)，恶液质因子或cachexin(肿瘤坏死因子)，canvaxin(疫苗)，

(癌疫苗)，

(西莫白介素)，

(二盐酸组胺)，

(人乳头瘤病毒疫苗)，

(C:

(环磷酰胺)；H:

(hydroxydoxorubicin)；O:长春新碱

P:泼尼松)，CYPAT(醋酸环丙氯地孕酮)，combrestatin A4P，DAB(389)EGF(通过至人表皮生长因子的His-Ala连接体融合的白喉毒素的催化和易位域)或TransMID-107R(白喉毒素)，达卡巴嗪，放线菌素D，5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)，恩尿嘧啶，EVIZON(角鲨胺乳酸盐)，

(T4N5脂质体洗剂)，discodermolide，DX-8951f(依沙替康甲磺酸盐)，enzastaurin，EPO906(epithiloneB)，

(四价人乳头瘤病毒(6，11，16，18型)重组疫苗)，

GMK(神经节糖苷缀合物疫苗)，

(前列腺癌疫苗)，常山酮(halofuginone)，histerelin，羟基脲，伊班膦酸，IGN-101，IL-13-PE38，IL-13-PE38QQR(cintredekin besudotox)，IL-13-假单胞菌外毒素，干扰素-α，干扰素-γ，JUNOVANMEPACT(mifamurtide)，lonafarnib，5,10-亚甲基四氢叶酸酯(methylenetetrahydrofolate)，米替福新(十六烷基磷酸胆碱)，

(AE-941)，

(三甲曲沙葡糖醛酸盐)，

(pentostatin)，

(一种核糖核酸酶)，

(黑素瘤疫苗治疗)，

(IL-2疫苗)，ORATHECIN(卢比替康)，

(抗体型细胞药物)，

MAb(鼠科单克隆抗体)，紫杉醇，PANDIMEX(来自人参的糖苷配基皂草苷，含20(S)原人参萜二醇(aPPD)和20(S)原人参萜三醇(aPPT))，panitumumab，

(试验癌疫苗)，培门冬酶，PEG干扰素A，phenoxodiol，丙卡巴肼，rebimastat，

(catumaxoma b)，

(lenalidomide)，RSR13(efaproxiral)，

LA(兰瑞肽)，

(阿维A)，十字孢碱(链霉菌属星状孢子)，tala bostat(PT100)，

(贝沙罗汀)，

(DHApaclitaxel)，

(canfosfamide，TLK286)，temilifene，

(替莫唑胺)，替米利芬，沙利度胺，

(STn-KLH)，thymitaq(2-氨基-3,4-二氢-6-甲基-4-氧代-5-(4-吡啶基硫基)喹唑啉二盐酸盐)，TNFERADE(adenovector：含肿瘤坏死因子-α的基因的DNA载体)，

或

(波生坦)，维A酸(Retin-A)，粉防己碱，

(三氧化二砷)，

ukrain(来自白屈菜植物的生物碱的衍生物)，vitaxin(抗-alphavbeta3抗体)，

(莫特沙芬钆)，XINLAY(阿曲生坦)，XYOTAX(紫杉醇poliglumex)，

(trabectedin)，ZD-6126，

(右雷佐生)，

(zolendronic酸)，佐柔比星等等。

本文所用术语"药用载体"是指无毒、惰性的固体、半固体或液体的填充剂、稀释剂、包囊材料或任何类型的制剂用助剂。可用作药用载体的物质的一些实例是糖类，但不限于乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如但不限于玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如但不限于如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末化西黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可油和栓剂蜡；油，例如但不限于如花生油、棉子油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类如丙二醇；酯，例如但不限于如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如但不限于如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水、等渗生理盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲液，根据配制者的判断，其它无毒的相容润滑物，例如但不限于如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、芳香剂和香料、防腐剂和抗氧化剂也可存在于所述药物制剂中。

本发明化合物可以用本领域已知的方法制成任何药物制剂，以口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服给药时，可制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；也可制成口服液体制剂，如口服溶液剂、口服混悬剂、糖浆剂等。制成口服制剂时，可以加入适宜的填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等。用于肠胃外给药时，可制成注射剂，包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。制成注射剂时，可采用现有制药领域中的常规方法生产，配制注射剂时，可以不加入附加剂，也可根据药物的性质加入适宜的附加剂。用于直肠给药时，可制成栓剂等。用于经肺给药时，可制成吸入剂或喷雾剂等。

活性筛选实验显示本发明化合物可抑制Bcl-2蛋白和Mcl-1蛋白活性、抗肿瘤细胞增殖、剂量依赖性诱导细胞凋亡和capase-3活化。因此，本发明还提供了该系列化合物在制备预防或治疗因Bcl-2蛋白表达异常导致的相关哺乳动物疾病药物中的应用。所述的与Bcl-2蛋白活性异常表达相关的哺乳动物疾病包括癌症、神经变性疾病、病毒感染、疟疾和糖尿病等。

利用荧光偏振实验测定方法测定化合物Bcl-2蛋白抑制活性。5-FAM标记的Bid-BH3多肽为荧光标记分子，该分子能够与Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Bcl-X_L和Mcl-1)发生特异性结合，其解离常数为36-60nM，二者结合可产生较高的极化值。如果化合物也可与这些蛋白发生特异性结合，则会导致极化值降低。将加入目标化合物的极化值与一下对照和阳性对照对比，如果极化值相对于阴性对照的降低水平到达阴性与阳性值之差的一半左右，则认为该化合物有明显活性，可进一步准确测定其IC₅₀值，进而导出其竞争性抑制常数K_i。

使用MTT法测试化合物的抗肿瘤细胞增殖活性。MTT商品名为噻唑蓝，全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，是一种接受氢离子的黄色染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性的MTT还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜，并沉积在细胞中，细胞中形成甲臜结晶的量仅与活细胞数目成正相关。而死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原。生成的甲臜结晶可在二甲基亚砜中溶解，利用酶标仪测定570nm处的吸光度OD值，可反映出活细胞数目。

Bcl-2蛋白抑制实验表明，本发明式(I)所示的化合物对Bcl-2蛋白具有明显的抑制活性，并优于阳性对照药棉酚。进一步的Bcl-2蛋白亚型抑制试验中，本发明式(I)所示的化合物对Mcl-1蛋白具有明显的抑制活性，而对Bcl-X_L蛋白无抑制作用，表明本发明式(I)所示的化合物选择性较高，同时，化合物B25和B26对测试的肿瘤细胞有明显抑制活性。

具体实施方式

下面结合实施例和实验例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

实施例1.(S)-7-(苄氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B1)的合成

(S)-2-氨基-3-(3,5-二碘-4-羟基苯基)丙酸氢溴酸盐(2)的合成

将10.00g L-酪氨酸溶于100mL冰醋酸，缓慢滴加含26.46g的溴素的冰醋酸溶液20mL，室温反应4小时；旋除冰醋酸，粗品经乙醚洗涤，得21.21g白色固体，收率96％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ13.94(s,1H),9.90(s,1H),8.25(s,3H),7.45(s,2H),4.23(t,J＝6.0Hz,1H),3.06(dd,J＝14.5,5.8Hz,1H),2.99(dd,J＝14.5,6.9Hz,1H).

(S)-6,8-二碘-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸盐酸盐(3)的合成

将21.21g化合物2溶于190mL浓盐酸中，依次加入15.5mL乙二醇二甲醚和5.90g多聚甲醛，缓慢升温至75℃；30分钟后，依次补加7.8mL乙二醇二甲醚和4.00g多聚甲醛，75℃反应70小时；冰浴冷却30分钟，过滤；滤饼乙二醇二甲醚洗涤，得到11.20g粉红色固体，收率57％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ14.19(s,1H),10.06(s,3H),7.57(s,1H),4.34(dd,J＝11.0,4.4Hz,1H),4.26–4.14(m,1H),4.09(d,J＝16.2Hz,1H),3.26(dd,J＝16.9,4.7Hz,1H),3.10(dd,J＝16.3,11.7Hz,1H).

2-叔丁基-3-甲基-(S)-6,8-二溴-7-羟基-3,4-二氢异喹啉-2,3(1H)-二羧酸酯(4)的合成

将11.20g化合物3分散于160mL甲醇中，冰浴条件下滴加10.5mL氯化亚砜，冰浴继续反应30分钟后，转移到油浴，回流4小时；旋除溶剂，固体以体积比1:2的乙醚/正己烷洗涤，再分散于体积比2:1的150mL 1,4-二氧六环/水混合溶剂中；冰浴条件下，依次加入15.3mL三乙胺和9.03g二碳酸二叔丁酯，转移至室温反应过夜；6mmol/L盐酸调节反应液pH为5～6，乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品经硅胶柱层析纯化，得10.70g白色固体，收率79％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.29(s,1H),5.89(s,1H),5.26–4.90(m,1H),4.80–4.59(m,1H),4.40–4.25(m,1H),3.72–3.59(m,3H),3.24–3.04(m,2H),1.55–1.43(m,9H).

(S)-7-苄氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酯盐酸盐(5a)的合成

向80mL含3.56g化合物4的甲醇溶液中依次加入1.97mL三乙胺和0.35g 10％Pd/C，室温常压氢化反应8小时；硅藻土过滤，滤液浓缩。固体重新分散于50mL乙腈，依次加入3.17g碳酸钾和1.09mL苄溴，回流8小时；乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品溶解于98mL氯化氢气体饱和的乙酸乙酯中，室温反应过夜；过滤，干燥得1.40g白色固体，总收率54％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.17(s,2H),7.52–7.29(m,5H),7.17(d,J＝8.2Hz,1H),7.00–6.88(m,2H),5.09(s,2H),4.53(dd,J＝11.1,5.1Hz,1H),4.35–4.21(m,2H),3.80(s,3H),3.23(dd,J＝16.7,5.0Hz,1H),3.07(dd,J＝16.6,11.2Hz,1H).

(S)-7-苄氧基-2-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酯(6a)的合成

将1.12g化合物5a以饱和碳酸氢钠溶液中和得游离胺，游离胺溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺，冰浴条件下加入0.16g氢化钠，20分钟后再加入0.33mL 1-碘丙烷；室温反应1小时后，用水淬灭反应；乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品经硅胶柱层析纯化，得0.88g无色油，收率77％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.54–7.27(m,5H),7.00(d,J＝8.4Hz,1H),6.77(dd,J＝8.4,2.6Hz,1H),6.65(d,J＝2.3Hz,1H),5.01(s,2H),4.02(d,J＝15.7Hz,1H),3.82(d,J＝15.7Hz,1H),3.77–3.72(m,1H),3.66(s,3H),3.09(dd,J＝16.1,5.8Hz,1H),3.02(dd,J＝16.1,4.9Hz,1H),2.75–2.50(m,2H),1.58(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.92(t,J＝7.4Hz,3H).

(S)-7-(苄氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B1)的合成

将溶液B缓慢滴入溶液A中，室温反应过夜；乙酸乙酯萃取，5％柠檬酸溶液、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品经硅胶柱层析纯化，得0.51g黄色固体即为化合物B1，收率54％。mp:207-209℃.¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.55(s,1H),8.32(d,J＝1.8Hz,1H),7.98(dd,J＝8.4,1.7Hz,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.47–7.28(m,5H),7.15(d,J＝8.3Hz,1H),6.96–6.90(m,1H),6.90–6.84(m,1H),5.06(s,2H),4.35(d,J＝15.2Hz,1H),4.30–4.15(m,1H),4.12–3.95(m,1H),3.15(dd,J＝16.9,5.4Hz,1H),3.05(dd,J＝16.8,8.7Hz,1H),3.00–2.80(m,2H),1.71–1.52(m,2H),0.80(t,J＝7.3Hz,3H).HRMS(AP-ESI)m/zCalcd for C₂₆H₂₆ClN₃O₆S[M-H]^-542.1153,found:542.1143.

实施例2.(S)-2-苄基-7-(苄氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B2)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率54％，mp:176-178℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.99(s,1H),8.34(d,J＝1.7Hz,1H),8.04–7.88(m,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.52–7.24(m,10H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),6.99–6.80(m,2H),5.07(s,2H),4.34(d,J＝12.7Hz,1H),4.20(s,2H),4.18–4.07(m,1H),4.07–3.90(m,1H),3.23(dd,J＝17.0,5.5Hz,1H),3.11(dd,J＝17.0,8.8Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd forC₃₀H₂₆ClN₃O₆S[M-H]^-590.1153,found:590.1160.

实施例3.(S)-7-(苄氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B3)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率56％，mp:107-108℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.34(s,1H),8.35(d,J＝1.7Hz,1H),7.98(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),7.88(d,J＝8.1Hz,2H),7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(d,J＝8.1Hz,2H),7.49–7.29(m,5H),7.16(d,J＝8.3Hz,1H),6.97–6.91(m,1H),6.90(s,1H),5.06(s,2H),4.37(d,J＝13.0Hz,1H),4.28–4.10(m,3H),4.10–3.96(m,1H),3.22(dd,J＝16.9,5.6Hz,1H),3.09(dd,J＝16.9,8.4Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₁H₂₅ClN₄O₆S[M-H]^-615.1105found:615.1100.

实施例4.(S)-7-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-2-苄基-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B4)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率55％，mp:192-194℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.97(s,1H),8.35(s,1H),7.98(d,J＝8.0Hz,1H),7.83(d,J＝8.4Hz,1H),7.77–7.60(m,4H),7.60–7.26(m,10H),7.19(d,J＝8.0Hz,1H),7.03–6.86(m,2H),5.13(s,2H),4.35(d,J＝12.6Hz,1H),4.22(s,2H),4.20–4.08(m,1H),4.08–3.92(m,1H),3.24(dd,J＝16.9,5.1Hz,1H),3.12(dd,J＝16.8,8.8Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd forC₃₆H₃₀ClN₃O₆S[M-H]^-666.1466,found:666.1468.

实施例5.(S)-7-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B5)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例1。收率22％，mp:221-222℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.56(s,1H),8.34(s,1H),8.00(d,J＝8.0Hz,1H),7.83(d,J＝8.3Hz,1H),7.75–7.59(m,4H),7.53(d,J＝7.9Hz,2H),7.47(t,J＝7.5Hz,2H),7.37(t,J＝7.2Hz,1H),7.16(d,J＝8.1Hz,1H),7.00–6.83(m,2H),5.12(s,2H),4.38(d,J＝15.2Hz,1H),4.31–4.13(m,1H),4.13–3.87(m,1H),3.16(dd,J＝16.7,4.8Hz,1H),3.07(dd,J＝16.7,8.5Hz,1H),3.01–2.70(m,2H),1.77–1.48(m,2H),0.80(t,J＝7.2Hz,3H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcdfor C₃₂H₃₀ClN₃O₆S[M-H]^-618.1466,found:618.1469.

实施例6.(S)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-7-丙氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B6)的合成

(S)-2-氨基-3-(3,5-二碘-4-羟基苯基)丙酸氢溴酸盐(2)、(S)-6,8-二碘-7-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸盐酸盐(3)、2-叔丁基-3-甲基-(S)-6,8-二溴-7-羟基-3,4-二氢异喹啉-2,3(1H)-二羧酸酯(4)的制备方法如实施例1。

(S)-6,8-二碘-7-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酯盐酸盐(5c)的合成

向30mL含2.79g化合物4的丙酮溶液中依次加入1.65g碳酸钾和0.87mL 1-碘丙烷，回流8小时；乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，浓缩；粗品溶解于77mL氯化氢气体饱和的乙酸乙酯中，室温反应过夜；过滤，干燥得1.80g白色固体，收率67％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.43(s,2H),7.70(s,1H),4.52(dd,J＝11.1,4.8Hz,1H),4.25(d,J＝16.5Hz,1H),4.13(d,J＝16.5Hz,1H),3.90(t,J＝6.4Hz,2H),3.82(s,3H),3.32(dd,J＝17.1,4.8Hz,1H),3.20(dd,J＝16.9,11.1Hz,1H),1.91–1.73(m,2H),1.05(t,J＝7.4Hz,3H).

(S)-6,8-二碘-2-(4-cyanobenzyl)-7-丙基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酯盐酸盐(6f)和(S)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-7-丙氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B6)的制备方法如实施例1。收率43％，mp:106-108℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.62(s,1H),8.44(d,J＝1.9Hz,1H),8.07(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),7.92(d,J＝8.5Hz,1H),7.86(d,J＝8.1Hz,2H),7.67–7.53(m,3H),4.13(d,J＝13.8Hz,1H),4.03(d,J＝13.7Hz,1H),3.98–3.92(m,1H),3.88(s,2H),3.86–3.78(m,2H),3.19(dd,J＝17.2,5.7Hz,1H),3.06(dd,J＝17.3,6.0Hz,1H),1.89–1.70(m,2H),1.03(t,J＝7.4Hz,3H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₂₇H₂₃Br₂ClN₄O₆S[M-H]^-724.9295,found:724.9283.

实施例7.(S)-2-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-7-丙氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B7)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率21％，mp:117-119℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.70(s,1H),8.44(d,J＝1.9Hz,1H),8.05(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),7.84(d,J＝8.4Hz,1H),7.79–7.69(m,4H),7.68(s,1H),7.60–7.45(m,4H),7.45–7.35(m,1H),4.33(d,J＝12.9Hz,1H),4.25–4.10(m,3H),4.07–3.98(m,1H),3.87(t,J＝6.4Hz,2H),3.31(dd,J＝17.5,5.4Hz,1H),3.18(dd,J＝17.5,8.2Hz,1H),1.93–1.70(m,2H),1.04(t,J＝7.4Hz,3H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₂H₂₈Br₂ClN₃O₆S[M-H]^-775.9657,found:775.9654.

实施例8.(S)-2-苄基-7-(苄氧基)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B8)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率53％，mp:158-160℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.69(s,1H),8.41(d,J＝1.4Hz,1H),8.04(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,1H),7.72(s,1H),7.64–7.52(m,2H),7.51–7.29(m,8H),4.94(s,2H),4.30(d,J＝12.8Hz,1H),4.21–4.06(m,3H),4.06–3.95(m,1H),3.32(dd,J＝17.5,5.4Hz,1H),3.19(dd,J＝17.5,8.1Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₀H₂₄Br₂ClN₃O₆S[M-H]^-747.9343,found:747.9337.

实施例9.(S)-7-(苄氧基)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B9)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率44％，mp:109-111℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.71(s,1H),8.45(s,1H),8.08(d,J＝8.3Hz,1H),7.94(d,J＝8.4Hz,1H),7.86(d,J＝7.9Hz,2H),7.64(s,1H),7.63–7.50(m,4H),7.49–7.31(m,3H),4.92(s,2H),4.13(d,J＝13.7Hz,1H),4.04(d,J＝13.8Hz,1H),3.98–3.93(m,1H),3.90(s,2H),3.22(dd,J＝17.0,5.1Hz,1H),3.09(dd,J＝17.2,5.5Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd forC₃₁H₂₃Br₂ClN₄O₆S[M-H]^-772.9296,found:772.9272.

实施例10.(S)-7-(苄氧基)-6,8-二溴-2-(4-氰基苄基)-N-((3-硝基-4-((2-苯氧乙基)胺基)苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B10)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率25％，mp:173-175℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.25(s,1H),8.78(t,J＝5.4Hz,1H),8.50(d,J＝2.0Hz,1H),7.86(dd,J＝9.2,1.6Hz,1H),7.79(d,J＝8.1Hz,2H),7.55(d,J＝6.9Hz,2H),7.53–7.45(m,3H),7.46–7.37(m,3H),7.34(d,J＝9.4Hz,1H),7.27(t,J＝7.9Hz,2H),7.01–6.86(m,3H),4.88(s,2H),4.22(t,J＝5.3Hz,2H),3.90–3.80(m,2H),3.80–3.70(m,3H),3.63(q,J＝16.9Hz,2H),3.06(dd,J＝16.9,5.5Hz,1H),2.94(dd,J＝17.0,3.7Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcdfor C₃₉H₃₃Br₂ClN₅O₇S[M-H]^-874.0373,found:874.0355.

实施例11.(S)-7-(苄氧基)-6,8-二溴-2-(4-氰基苄基)-N-((4-((环己基甲基)胺基)-3-硝基苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B11)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率36％，mp:149-151℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.23(s,1H),8.62(t,J＝5.6Hz,1H),8.50(d,J＝2.0Hz,1H),7.87–7.70(m,3H),7.63–7.51(m,3H),7.49(d,J＝8.1Hz,2H),7.46–7.33(m,3H),7.18(d,J＝9.4Hz,1H),4.94–4.79(m,2H),3.85–3.69(m,3H),3.69–3.53(m,2H),3.25(t,J＝6.2Hz,2H),3.06(dd,J＝17.0,5.7Hz,1H),2.95(dd,J＝17.1,3.8Hz,1H),1.81–1.50(m,6H),1.25–1.09(m,3H),1.02–0.85(m,2H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₈H₃₇Br₂N₅O₆S[M-H]^-850.0736,found:850.0712.

实施例12.(S)-7-(苄氧基)-6,8-二溴-2-(4-氰基苄基)-N-((4-(环戊胺基)-3-硝基苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B12)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率33％，mp:116-118℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.25(s,1H),8.50(d,J＝1.8Hz,1H),8.37–8.23(m,1H),7.94–7.68(m,3H),7.62–7.46(m,5H),7.46–7.31(m,3H),7.20(d,J＝9.3Hz,1H),4.88(s,2H),4.19–3.96(m,1H),3.77(s,3H),3.63(q,J＝17.0Hz,2H),3.06(dd,J＝16.7,5.3Hz,1H),2.94(dd,J＝16.9,3.6Hz,1H),2.20–1.97(m,2H),1.82–1.67(m,2H),1.67–1.39(m,5H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₆H₃₃Br₂N₅O₆S[M-H]^-822.0423,found:822.0413.

实施例13.(S)-2-([1,1'-联苯]-4-基甲基)-7-(苄氧基)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B13)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率64％，mp:193-194℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.80(s,1H),8.45(d,J＝1.8Hz,1H),8.07(dd,J＝8.4,1.7Hz,1H),7.85(d,J＝8.4Hz,1H),7.81–7.67(m,5H),7.58(d,J＝6.9Hz,2H),7.55–7.47(m,4H),7.47–7.33(m,4H),4.94(s,2H),4.34(d,J＝12.8Hz,1H),4.26–4.10(m,3H),4.10–3.99(m,1H),3.34(dd,J＝17.4,5.2Hz,1H),3.21(dd,J＝17.6,8.2Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd forC₃₆H₂₈Br₂ClN₃O₆S[M-H]^-823.9657,found:823.9644.

实施例14.(S)-6,8-二溴-7-((4-溴苄基)氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B14)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率53％，mp:107-109℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.42(d,J＝1.9Hz,1H),8.06(dd,J＝8.5,1.9Hz,1H),7.96–7.87(m,2H),7.82(d,J＝7.7Hz,1H),7.75(d,J＝7.8Hz,1H),7.69–7.62(m,3H),7.59(t,J＝7.7Hz,1H),7.52(d,J＝8.3Hz,2H),4.91(s,2H),4.16(d,J＝13.5Hz,1H),4.09–4.00(m,2H),4.00–3.88(m,2H),3.24(dd,J＝17.3,5.8Hz,1H),3.11(dd,J＝17.3,6.1Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₁H₂₂Br₃ClN₄O₆S[M-H]^-852.8382,found:852.8365.

实施例15.(S)-6,8-二溴-7-((4-溴苄基)氧基)-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(3-甲氧基苄基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B15)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率42％，mp:102-104℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.41(d,J＝1.5Hz,1H),8.04(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,1H),7.72(s,1H),7.64(d,J＝8.3Hz,2H),7.52(d,J＝8.3Hz,2H),7.32(t,J＝7.9Hz,1H),7.06(s,1H),7.03–6.90(m,2H),4.92(s,2H),4.27(d,J＝12.7Hz,1H),4.22–4.06(m,3H),4.06–3.98(m,1H),3.76(s,3H),3.31(dd,J＝17.5,5.3Hz,1H),3.18(dd,J＝17.5,8.1Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₁H₂₅Br₃ClN₃O₇S[M-H]^-857.8535,found:857.8526.

实施例16.(S)-2-苄基-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-7-((4-氰基苄基)氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B16)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率48％，mp:201-202℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.72(s,1H),8.41(d,J＝1.4Hz,1H),8.04(dd,J＝8.4,1.4Hz,1H),7.92(d,J＝8.1Hz,2H),7.89(d,J＝8.4Hz,1H),7.76(d,J＝8.3Hz,2H),7.74(s,1H),7.42(s,5H),5.05(s,2H),4.29(d,J＝12.7Hz,1H),4.20–4.07(m,3H),4.07–3.93(m,1H),3.32(dd,J＝17.5,5.2Hz,1H),3.19(dd,J＝17.4,8.0Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd forC₃₁H₂₃Br₂ClN₄O₆S[M-H]^-772.9296,found:772.9282.

实施例17.(S)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-7-((4-氰基苄基)氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B17)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率45％，mp:153-155℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.76(s,1H),8.45(s,1H),8.09(d,J＝8.4Hz,1H),7.94(d,J＝8.6Hz,1H),7.92(d,J＝8.1Hz,2H),7.86(d,J＝8.1Hz,2H),7.75(d,J＝8.1Hz,2H),7.65(s,1H),7.59(d,J＝8.1Hz,2H),5.03(s,2H),4.11(d,J＝13.8Hz,1H),4.02(d,J＝13.9Hz,1H),3.98–3.91(m,1H),3.86(d,J＝18.1Hz,2H),3.21(dd,J＝17.2,5.6Hz,1H),3.08(dd,J＝17.3,5.6Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₂H₂₂Br₂ClN₅O₆S[M-H]^-797.9249,found:797.9230.

实施例18.(S)-2-苄基-6,8-二溴-7-((4-氰基苄基)氧基)-N-((3-硝基-4-((2-苯氧乙基)胺基)苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B18)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率50％，mp:95-96℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.00(s,1H),8.77(s,1H),8.53(s,1H),8.05–7.80(m,3H),7.73(d,J＝7.7Hz,2H),7.55(s,1H),7.45–7.09(m,8H),6.93(d,J＝7.8Hz,3H),5.00(s,2H),4.22(s,2H),4.08–3.78(m,3H),3.78–3.60(m,4H),3.19–3.03(m,1H),3.03–2.86(m,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₉H₃₃Br₂N₅O₇S[M-H]^-874.0373,found:874.0370.

实施例19.(S)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-7-((4-硝基苄基)氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B19)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率24％，mp:168-170℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.46(s,1H),8.30(d,J＝8.4Hz,2H),8.09(d,J＝8.3Hz,1H),7.95(d,J＝8.5Hz,1H),7.91–7.78(m,4H),7.65(s,1H),7.59(d,J＝7.9Hz,2H),5.09(s,2H),4.11(d,J＝13.7Hz,1H),4.02(d,J＝13.9Hz,1H),3.98–3.92(m,1H),3.89(s,2H),3.22(dd,J＝17.1,5.3Hz,1H),3.09(dd,J＝17.2,5.2Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd forC₃₁H₂₂Br₂ClN₅O₈S[M-H]^-817.9147,found:817.9143.

实施例20.(S)-2-([1,1'-联苯]-4-基甲基)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-7-((4-硝基苄基)氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B20)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率52％，mp:125-126℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.45(s,1H),8.31(d,J＝8.5Hz,2H),8.07(d,J＝8.4Hz,1H),7.86(d,J＝8.5Hz,2H),7.83(s,1H),7.78–7.69(m,4H),7.57–7.44(m,4H),7.40(t,J＝7.4Hz,1H),5.11(s,2H),4.32(d,J＝12.8Hz,1H),4.25–4.09(m,3H),4.09–3.99(m,1H),3.34(dd,J＝17.6,5.3Hz,1H),3.21(dd,J＝17.5,7.8Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd forC₃₆H₂₇Br₂ClN₄O₈S[M-H]^-868.9508,found:868.9512.

实施例21.(S)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-7-((3-氰基苄基)氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B21)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率40％，mp:148-150℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.72(s,1H),8.45(d,J＝1.9Hz,1H),8.09(dd,J＝8.5,1.9Hz,1H),7.98(s,1H),7.94(d,J＝8.5Hz,1H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),7.89–7.82(m,3H),7.68(d,J＝7.8Hz,1H),7.65(s,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,2H),5.00(s,2H),4.12(d,J＝13.8Hz,1H),4.03(d,J＝13.8Hz,1H),3.99–3.92(m,1H),3.89(s,2H),3.21(dd,J＝17.3,5.7Hz,1H),3.08(dd,J＝17.4,5.8Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₂H₂₂Br₂ClN₅O₆S[M-H]^-797.9249,found:797.9237.

实施例22.(S)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(3-氰基苄基)-7-((3-氰基苄基)氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B22)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率37％，mp:116-118℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.39(s,1H),8.42(d,J＝1.8Hz,1H),8.06(dd,J＝8.5,1.8Hz,1H),7.98(s,1H),7.94–7.86(m,3H),7.83(d,J＝7.8Hz,1H),7.75(d,J＝7.7Hz,1H),7.71–7.63(m,2H),7.63–7.56(m,1H),5.00(s,2H),4.16(d,J＝13.5Hz,1H),4.10–3.99(m,2H),3.99–3.84(m,2H),3.25(dd,J＝17.1,5.7Hz,1H),3.11(dd,J＝17.2,6.3Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₂H₂₂Br₂ClN₅O₆S[M-H]^-797.9246,found:797.9237.

实施例23.(S)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(3-氰基苄基)-7-((3-甲氧基苄基)氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B23)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率29％，mp:173-175℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.42(s,1H),8.42(s,1H),8.05(d,J＝7.8Hz,1H),7.92(d,J＝8.5Hz,2H),7.83(d,J＝7.2Hz,1H),7.75(d,J＝7.2Hz,1H),7.66(s,1H),7.59(t,J＝7.4Hz,1H),7.35(t,J＝7.7Hz,1H),7.13(s,2H),6.96(d,J＝7.3Hz,1H),4.90(s,2H),4.17(d,J＝13.3Hz,1H),4.13–4.00(m,2H),3.95(s,2H),3.78(s,3H),3.37–3.18(m,1H),3.18–3.01(m,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₂H₂₅Br₂ClN₄O₇S[M-H]^-802.9402,found:802.9377.

实施例24.(S)-7-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-2-苄基-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B24)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率49％，mp:167-169℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.68(s,1H),8.41(d,J＝1.3Hz,1H),8.04(dd,J＝8.4,1.3Hz,1H),7.89(d,J＝8.4Hz,1H),7.79–7.72(m,3H),7.70(d,J＝7.8Hz,2H),7.66(d,J＝8.1Hz,2H),7.49(t,J＝7.6Hz,2H),7.45–7.34(m,6H),4.98(s,2H),4.30(d,J＝12.8Hz,1H),4.23–4.07(m,3H),4.07–3.97(m,1H),3.33(dd,J＝17.5,5.3Hz,1H),3.20(dd,J＝17.5,8.1Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₂₇H₂₃Br₂ClN₄O₆S[M-H]^-724.9295,found:724.9283.

实施例25.(S)-7-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B25)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率70％，mp:117-119℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.72(s,1H),8.45(d,J＝2.1Hz,1H),8.09(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.94(d,J＝8.5Hz,1H),7.86(d,J＝8.2Hz,2H),7.73(d,J＝8.2Hz,2H),7.69(d,J＝7.3Hz,2H),7.67–7.63(m,3H),7.60(d,J＝8.2Hz,2H),7.49(t,J＝7.6Hz,2H),7.39(t,J＝7.3Hz,1H),4.97(s,2H),4.13(d,J＝13.8Hz,1H),4.04(d,J＝13.8Hz,1H),3.99–3.93(m,1H),3.91(s,2H),3.22(dd,J＝17.3,5.7Hz,1H),3.09(dd,J＝17.3,5.9Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/zCalcd for C₃₇H₂₇Br₂ClN₄O₆S[M-H]^-848.9610,found:848.9597.

实施例26.(S)-7-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-硝基苄基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B26)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率56％，mp:118-119℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.91(s,1H),8.47(d,J＝2.0Hz,1H),8.23(d,J＝8.7Hz,2H),8.10(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.94(d,J＝8.5Hz,1H),7.73(d,J＝8.2Hz,2H),7.71–7.67(m,3H),7.67–7.57(m,4H),7.48(t,J＝7.6Hz,2H),7.38(t,J＝7.3Hz,1H),4.96(s,2H),4.14(d,J＝14.1Hz,1H),4.06(d,J＝14.1Hz,1H),3.99–3.93(m,1H),3.90(s,2H),3.22(dd,J＝17.2,5.7Hz,1H),3.09(dd,J＝17.3,5.4Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₆H₂₇Br₂ClN₄O₈S[M-H]^-868.9508,found:868.9497.

实施例27.(S)-7-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-6,8-二溴-N-((4-(环戊胺基)-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-硝基苄基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B27)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率63％，mp:115-116℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.33(s,1H),8.52(d,J＝2.2Hz,1H),8.30(d,J＝6.6Hz,1H),8.19(d,J＝8.6Hz,2H),7.85(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H),7.71(d,J＝8.2Hz,2H),7.68(d,J＝7.4Hz,2H),7.63(d,J＝8.2Hz,2H),7.58(d,J＝8.6Hz,2H),7.53(s,1H),7.47(t,J＝7.6Hz,2H),7.38(t,J＝7.3Hz,1H),7.19(d,J＝9.4Hz,1H),4.92(s,2H),4.12–3.97(m,1H),3.95–3.77(m,3H),3.67(q,J＝16.9Hz,2H),3.09(dd,J＝17.0,5.6Hz,1H),2.98(dd,J＝17.1,4.0Hz,1H),2.17–1.96(m,2H),1.77–1.66(m,2H),1.63–1.45(m,4H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd forC₄₁H₃₇Br₂N₅O₈S[M-H]^-918.0635,found:918.0636.

实施例28.(S)-7-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-6,8-二溴-2-(4-氰基苄基)-N-((4-(环戊胺基)-3-硝基苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B28)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率67％，mp:123-125℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.26(s,1H),8.50(s,1H),8.37–8.24(m,1H),7.93–7.76(m,3H),7.76–7.65(m,4H),7.63(d,J＝7.6Hz,2H),7.57–7.42(m,5H),7.42–7.31(m,1H),7.19(d,J＝9.1Hz,1H),4.92(s,2H),4.16–3.98(m,1H),3.78(s,3H),3.71–3.54(m,2H),3.13–3.01(m,1H),3.01–2.85(m,1H),2.16–1.96(m,2H),1.76–1.65(m,2H),1.63–1.43(m,4H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₄₂H₃₇Br₂N₅O₆S[M-H]^-898.0737,found:898.0736.

实施例29.(S)-7-([1,1'-联苯]-4-基甲氧基)-6,8-二溴-2-(4-氰基苄基)-N-((3-硝基-4-((2-苯氧乙基)胺基)苯基)磺酰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B29)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率69％，mp:108-110℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.25(s,1H),8.79(s,1H),8.51(s,1H),7.86(d,J＝8.6Hz,1H),7.79(d,J＝7.9Hz,2H),7.74–7.66(m,4H),7.63(d,J＝7.8Hz,2H),7.55–7.43(m,4H),7.43–7.31(m,2H),7.31–7.20(m,2H),7.03–6.80(m,3H),4.92(s,2H),4.37–4.12(m,2H),3.92–3.72(m,5H),3.72–3.51(m,2H),3.17–3.01(m,1H),3.01–2.86(m,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcdfor C₄₅H₃₇Br₂N₅O₇S[M-H]^-950.0687,found:950.0693.

实施例30.(S)-6,8-二溴-N-((4-氯-3-硝基苯基)磺酰基)-2-(4-氰基苄基)-7-((4'-甲氧基-[1,1'-联苯]-4-基)甲氧基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酰胺(B30)的合成

中间体和目标化合物制备方法如实施例6。收率66％，mp:116-118℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.73(s,1H),8.46(d,J＝2.0Hz,1H),8.09(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),7.94(d,J＝8.5Hz,1H),7.86(d,J＝8.2Hz,2H),7.74–7.64(m,4H),7.64–7.54(m,5H),7.04(d,J＝8.7Hz,2H),4.94(s,2H),4.13(d,J＝13.8Hz,1H),4.04(d,J＝13.8Hz,1H),4.00–3.94(m,1H),3.91(s,2H),3.80(s,3H),3.22(dd,J＝17.3,5.5Hz,1H),3.09(dd,J＝17.3,5.9Hz,1H).HRMS(AP-ESI)m/z Calcd for C₃₈H₂₉Br₂ClN₄O₇S[M-H]^-878.9716,found:878.9707.

目标化合物活性评价实验

实验例1.目标化合物对Bcl-2蛋白抑制试验(In vitro)

实验试剂：

5-FAM-QEDIIRNIARHLAQVGDSMDRSIPPG(N端用5-FAM荧光标记的Bid-BH3多肽)，溶于1×PBS；

测试缓冲液：1×PBS；

校正溶液：1nM fluorescein，10mM氢氧化钠溶液。

实验仪器：TECAN Infinite M1000PRO多功能酶标仪。

实验步骤：

(1)将一定浓度的蛋白和待测化合物加入测试缓冲液中混匀，室温避光孵育30min。加入5-FAM荧光标记的Bid-BH3多肽，调整溶液的总体积为200μL，混匀，室温避光孵育20min。

(2)各取60μL上述溶液及校正溶液至黑色384孔板中(平行三组)，以485nm为激发波长，535nm为发射波长，立即进行荧光偏振的检测，将校正溶液的荧光偏振值定为20mP。

(3)所有化合物首先进行三浓度初筛(1μM、10μM和50μM)，每个化合物平行3个复孔，结果取平均。根据阴性对照、阳性对照以及受测化合物的测定结果推算抑制率。阳性化合物采用棉酚或ABT-263。如果化合物在50μM浓度时抑制率大于50％，且三个浓度的抑制率表现出剂量依赖关系，则认为该化合物与靶蛋白具有特异性结合，进一步测定其准确的IC₅₀值。

(4)测定化合物IC₅₀时，选取7个不同浓度(1nM,10nM,100nM,1μM,10μM,50μM,100μM)进行结合曲线的测定。每个化合物平行3个复孔，结果取平均。处理数据和做图，计算该化合物的IC₅₀值。

(5)根据所用的蛋白终浓度、荧光多肽的终度、蛋白-多肽复合物的解离常数以及实验所得的IC₅₀值，使用文献报道的计算方法计算待测化合物的竞争性抑制常数K_i。(Nikolovska-Coleska,Z.；et al.Development and optimization of a binding assayfor the XIAP BIR3domain using fluorescence polarization.Anal Biochem.2004,332,261-273).

实验结果见表2。

表2.目标化合物对Bcl-2蛋白体外抑制实验结果

^a表中数值为三次试验结果的平均值。

从表2中可以看出，式(I)所示的化合物具有用于功能上抑制抗细胞凋亡Bcl-2蛋白的效用，对Bcl-2蛋白亲和力较大，优于棉酚。

实验例2.目标化合物对Bcl-X_L和Mcl-1蛋白抑制试验(In vitro)

实验试剂、实验仪器及实验步骤同实验例1，实验结果见表3和表4。

表3.代表化合物对Mcl-1蛋白体外抑制实验结果

^a表中数值为三次试验结果的平均值。

从表3中可以看出，式I所示的化合物对Mcl-1蛋白也具有良好的亲和力，优于阳性对照棉酚。

表4.代表化合物对Bcl-X_L蛋白体外抑制实验结果

^b N.A.代表化合物对此蛋白没有抑制活性。

从表4中可以看出，式I所示的化合物与Bcl-X_L蛋白亲和力较差，表明式I所示的化合物选择性较好。

实验例3.目标化合物抑制细胞增殖的活性试验(In vitro)

术语说明：

Jurkat人急性T淋巴细胞白血病细胞株；

RS4；11人急性淋巴白血病细胞株；

HL-60人早幼粒急性白血病细胞株；

KG1人急性髓系白血病细胞株；

Molt-4人急性淋巴母细胞白血病细胞株。

IC₅₀：半数抑制浓度。

[实验材料]Jurkat，RS4；11，HL-60和Molt-4细胞株，四甲基偶氮唑蓝MTT，10％胎牛血清，96孔板。

[实验方法]

(1)37℃ 5％CO₂条件下，用含10％Fetal Bovine Serum和1％Penicillin-Streptomycin Solution的RPMI 1640培养细胞。

(2)收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，96孔板铺板，每孔加入100μL，使每孔含Jurkat、Molt-4、HL-60和KG1细胞4000个，RS4；11细胞30000个，37℃ 5％CO₂孵育8小时。

(3)加入浓度梯度的药物，每孔100μL，设3个复孔，37℃ 5％CO₂孵育72小时。设置阴性对照组和空白对照组，阴性对照组只加细胞悬液和培养基，空白对照组只加培养基。

(4)终止培养，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，继续培养4小时，离心后弃去培养液。

(5)每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上37℃低速振荡10分钟，充分溶解结晶物。酶标仪570nm处测量各孔的吸光值OD，换算成相应抑制率，然后结合相应化合物浓度计算IC₅₀值。

细胞生长抑制率按下式计算：

实验结果见表5。

表5代表性化合物抗肿瘤细胞增殖实验结果

^a表中数值为三次试验的平均值。

从表5的测试数据表明，式I所示的化合物对肿瘤细胞均表现出一定的抗细胞增殖活性。