CN109776353A - 一种小分子探针h4l及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小分子探针H₄L及其制备方法和应用，该探针母体为水杨醛和3,3'‑二氨基联苯胺基团，该小分子探针可实现紫外和荧光精确检测镓离子，可以用于检测溶液、活细胞以及斑马鱼中外源性的镓离子，本发明合成方法简单，操作方便，不需要苛刻的条件，而且合成产率和纯度都很高，因此在镓离子检测方面具有良好的应用前景。

Description

一种小分子探针H4L及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光成像分子探针领域，尤其是涉及一种利用荧光成像技术检 测镓离子的探针，具体涉及一种分子探针的制备方法和应用。

背景技术

在目前为止所设计的分析方法中，荧光成像是检测离子的重要方法。然而，这种方法对样品的要求和工作环境上都有一定的局限性。此外，大多数探针的选择性和灵敏度都存在一定的限制，开发一种高选择性和灵敏性的探针是一种技术的挑战。为了深入了解深层荧光成像的相关信息，开发金属荧光成像成为了一种选择。但是，由于荧光强度大小存在差异，使得荧光成像的最大成像效果不是很理想，这种成像效果难以满足对生物体内进行观察的效果。例如，过量的金属离子也可能导致一些副作用，在少量的金属离子存在下，通过荧光成像难以检测到金属离子。因此，开发高灵敏度和高选择性的小分子探针来检测金属离子仍然是一个艰巨的挑战。

目前，基于荧光探针的金属离子检测技术正在成为一种重要研究方法。近几年报道了很多小分子探针对不同的金属离子选择性识别，尤其是锌离子、铜离子、铁离子以及汞离子等，尽管如此多的金属离子探针被报道，但是目前对于镓离子识别的探针报道很少，而且该类探针对镓离子识别能力和选择性都不是很理想，鉴于此，探究一种新的镓离子识别的探针具有深远的意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种高选择性和高灵敏度的镓离子识别荧光探针。

为实现上述目的，本发明提供一种小分子探针H₄L，所述分子探针分子式为C₄₀H₃₀N₄O₄，其结构式为：

本发明还提供上述小分子探针H₄L的制备方法，具体包括如下步骤：

1)制备小分子探针H₄L：将水杨醛和3,3'-二氨基联苯胺溶解在乙醇溶液中，并在室温下搅拌，得到淡黄色透明液体的混合液一；

2)小分子探针粗产物的制备：将上述混合液一加热至353K回流反应，冷却过滤，干燥得到橙色固体粉末；

3)小分子探针H₄L的纯化：上述橙色固体粉末溶解在DMF中，然后加热搅拌过滤，滤液缓慢挥发数天后得到红色晶体。

作为本发明的进一步改进，所述水杨醛和3,3'-二氨基联苯胺的摩尔比为 2-6：1。

作为本发明的进一步改进，所述乙醇与水杨醛和3,3'-二氨基联苯胺混合物的质量比为5-10：1。

作为本发明的进一步改进，所述步骤三中的橙色固体粉与DMF的质量比为 1:10-20。

本发明还提供上述小分子探针H4L检测、识别环境中或生物样品中镓离子的应用。

作为本发明的一种应用方式,用紫外分光光度法，通过紫外分光光度法，在 225-550nm的波长范围内测定镓离子溶液的吸光度；在365nm的最大吸收波长下识别环境中或生物样品中镓离子。

作为本发明的一种应用方式，通过荧光分光光度法，以350nm为激发波长，在400-650nm的波长范围内测定镓离子溶液的吸光度；在500nm的最大吸收波长下识别环境中或生物样品中镓离子。

作为本发明的一种应用范围,所述小分子探针H₄L利用荧光成像检测正常细胞和癌细胞中外源性的镓离子的应用。

作为本发明的一种应用范围,所述小分子探针H₄L利用荧光成像检测斑马鱼体内外源性的镓离子的应用。

本发明另一方面在于提供小分子探针H₄L检测离子的方法，其具体步骤如下：

a)制备小分子探针母液：将纯化后的小分子探针溶解在1mL二甲亚砜中，得到探针母液；

b)紫外分光光度法：将探针母液稀释得到20μM的探针工作液，滴加1mM 含金属离子检测液，紫外比色皿为500μL，在225-550nm的波长范围下测定含金属离子检测液的吸光度，得到紫外光谱图。

c)荧光分光光度法：将探针母液稀释得到2μM的探针工作液，滴加1mM 含金属离子检测液，荧光比色皿为500μL，在400-650nm的波长范围下测定含金属离子检测液的吸光度，得到荧光光谱图。

本发明具有如下优点：本发明的小分子探针以水杨醛和3,3'-二氨基联苯胺为原料，缩合形成的的母体结构是席夫碱构型，具有很强共轭π电子，水杨醛和3,3'-二氨基联苯胺缩合形成两个金属离子螯合位点，小分子探针结合金属离子后能发射很强的荧光，小分子探针在镓离子的存在下结构中酚羟基的氢发生去质子化，使得其荧光从无到有，紫外吸收峰红移，实现荧光技术精确检测镓离子，并且可以检测活细胞和斑马鱼体内外源性的镓离子。因此在镓离子检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。

附图说明

图1为实施例1中合成小分子探针的路线及探针对镓离子的结合模式图；

图2为实施例2中小分子探针对镓离子识别的紫外和荧光光谱图；

图3为实施例3中验证小分子探针对镓离子选择性和竞争性图；

图4为实施例4中小分子探针在癌细胞中检测外源性的镓离子；

图5为实施例5中小分子探针在正常细胞中检测外源性的镓离子；

图6为实施例6中小分子探针在斑马鱼中检测外源性的镓离子；

图7为实施例1中合成小分子探针的核磁氢谱；

图8为实施例1中合成小分子探针的核磁碳谱；

图9为实施例1中合成小分子探针以及添加镓离子的质谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。

实施例1合成小分子探针

将水杨醛(3.05g,25mmol)和3,3'-二氨基联苯胺(1.07g,5mmol)置于 100mL圆底烧瓶中加入50mL无水乙醇，并在室温下搅拌20分钟，使得所有固体全部溶解，并得到淡黄色透明液体，再将上述透明溶液加热至353K回流反应8小时在反应过程中溶液颜色由淡黄色逐渐变成深红色，并且有橙色固体粉末析出，冷却过滤，真空干燥得到橙色固体粉末2.520g，产率80％，再称取 1.0g上述橙色固体粉末溶解在15mL的DMF中，然后加热80℃搅拌10分钟趁热过滤，滤液放置在烧杯中，用滤纸进行部分封口，使其缓慢挥发2天后得到红色晶体，通过质谱、核磁以及单晶衍射可以确定该产物即为目标小分子探针。

探针核磁氢谱：

1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝12.97(s,4H,OH),9.06(s,2H,CH＝N),9.00(s, 2H,CH＝N),7.89(dd,J1＝16.0Hz,J2＝12.0Hz,4H,ArH),7.68(d,J＝4.0Hz,4H, ArH),7.59(d,J＝8.0Hz,2H,ArH),7.42(dd,J1＝4.0Hz,J2＝8.0Hz,4H,ArH), 6.98(d,J＝8.0Hz,8H,ArH).

探针核磁碳谱：

13C NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝166.6(CH＝N),165.5,162.3,144.9,143.3,140.3,135.4,134.4,134.3,127.6,121.9,121.4,121.3,120.9,119.8,118.5(all ArC)ppm.

合成小分子探针的路线图和对镓离子结合模式图如图1所示，图1表示合成小分子探针的路线图，其中EtOH为乙醇。

实施例2小分子探针对镓离子响应的紫外和荧光光谱

制备1mL小分子探针(2.0×10^-6mol/L)的DMSO/H₂O(v/v＝9:1)溶液。同浓度的镓离子溶液滴加到探针溶液中，

如图2(a)所示，在探针溶液中加入镓离子后，在275nm和350nm处的吸收带逐渐减少，350nm～450nm处有一个新的吸收峰，并在410nm处出现最大吸收峰，其吸光强度随镓离子浓度增加并逐渐增加，最终两者化学计量比为1:2。

在荧光滴定实验中，制备1mL小分子探针(2.0×10^-5mol/L)的DMSO/H₂O (v/v＝9:1)溶液。同浓度的镓离子溶液滴加到探针溶液中，以350nm为激发波长测量探针从400nm到650nm的荧光值，实验结果见图2(b)。可观察到探针的荧光强度随镓离子浓度增加而增强，当两者浓度比例为1:2时，荧光强度达到饱和。

实施例3验证小分子探针对镓离子选择性和竞争性

制备5mL分子探针(2.0×10^-6mol/L)的DMSO/H₂O(v/v＝9:1)溶液。通过将相应的盐溶于去离子水制备各种阴离子溶液(Ga³⁺,Cr³⁺,Al³⁺,Fe³⁺,Ca²⁺,Cd²⁺, Co²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺,Fe²⁺,Cu²⁺,Ag⁺,K⁺,Li⁺和Na⁺，1.0×10^-3mol/L)。随后，将同等当量的金属离子溶液加入到探针溶液中。

通过荧光光谱进行检测，实验结果见图3(a)。取荧光最大吸收波长进行对比，如图3(b)所示，离子包括Ga³⁺,Cr³⁺,Al³⁺,Fe³⁺,Ca²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Mn²⁺,Ni²⁺,Zn²⁺, Fe²⁺,Cu²⁺,Ag⁺,K⁺,Li⁺和Na⁺。除Ga³⁺外，这些金属离子对探针的荧光都没有产生明显变化。在Ga³⁺的加入后，荧光在500nm处产生很强的发射，而且在探针结合镓离子后，加入其他金属离子对体系的荧光强度没有影响，可以判定探针和镓离子具有很强的结合能力。同时，肉眼可观察到探针溶液发生明显的颜色变化：从无色变为黄色。在365nm紫外灯下呈现出很强的绿光。结果表明探针对镓离子具有高选择性。图3(c)、(d)分别表示探针对不同离子响应的荧光可视化图和其他金属离子的竞争。

实施例4小分子探针的在癌细胞中成像效果

在癌细胞成像体系中，设立对照组(单独探针处理细胞)和实验组(探针处理后再加入不同浓度的镓离子处理)，最后通过荧光成像系统中的蓝色通道 (blue channel)进行拍照记录。实验结果见图4。

如图4所示，在有镓离子和没有镓离子存在情况下，探针单独处理的癌细胞中并没有发现荧光出现，而随着镓离子浓度增加，探针逐渐可以在细胞中出现荧光，而且强度也是逐步增加，在人肺癌细胞(A549)、人表皮癌细胞(Hela)和人肝癌细胞(HepG2)细胞中都观察到了同样的现象，说明探针可以检测癌细胞体内外源性的镓离子。

实施例5小分子探针的在正常细胞中成像效果

在正常细胞成像体系中，设立对照组(单独探针处理细胞)和实验组(探针处理后再加入不同浓度的镓离子处理)，最后通过荧光成像系统中的蓝色通道 (blue channel)进行拍照记录。实验结果见图5。

如图5所示，在有镓离子和没有镓离子存在情况下，探针单独处理的正常细胞中并没有发现荧光出现，而随着镓离子浓度增加，探针逐渐可以在细胞中出现荧光，而且强度也是逐步增加，在人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)和人正常肝细胞(LO2)细胞中都观察到了同样的现象，说明探针可以检测正常细胞体内外源性的镓离子。

实施例6小分子探针的在斑马鱼中成像效果

在斑马鱼成像体系中，设立对照组(单独探针处理细胞)和实验组(探针处理后再加入不同浓度的镓离子处理)，最后通过荧光成像系统中的蓝色通道 (blue channel)进行拍照记录。实验结果见图6。

如图6所示，在有镓离子和没有镓离子存在情况下，探针和磷酸盐缓冲液单独处理的斑马鱼中并没有发现荧光出现，而随着镓离子的加入，探针逐渐可以在斑马鱼中出现荧光，而且强度也是逐步增加，说明探针可以检测斑马鱼体内外源性的镓离子。

本发明所述的小分子探针可通过荧光光谱技术检测溶液中的镓离子。

该小分子探针在镓离子存在下，紫外吸收峰发生红移(约60nm)，同时荧光迅速从无到有，并产生很强的荧光信号。

本发明具有如下优点：通过本发明所述制备方法合成小分子探针，还可以实现紫外和荧光光谱法精确传感镓离子，并且可以快速、准确的检测癌细胞、正常细胞以及斑马鱼体内中外源性的镓离子。因此在镓离子检测方面具有良好的应用前景。同时，本发明的合成方法简单、操作方便，不需要苛刻的条件。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种小分子探针H₄L，其特征在于：所述分子探针分子式为C₄₀H₃₀N₄O₄，其结构式为：

2.权利要求1所述的小分子探针H₄L的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

1)制备小分子探针H₄L：将水杨醛和3,3'-二氨基联苯胺溶解在乙醇溶液中，并在室温下搅拌，得到淡黄色透明液体的混合液一；

2)小分子探针粗产物的制备：将上述混合液一加热至353K回流反应，冷却过滤，干燥得到橙色固体粉末；

3)小分子探针H₄L的纯化：上述橙色固体粉末溶解在DMF中，然后加热搅拌过滤，滤液缓慢挥发数天后得到红色晶体。

3.权利要求2所述的小分子探针H₄L的制备方法，其特征在于：所述水杨醛和3,3'-二氨基联苯胺的摩尔比为2-6：1。

4.权利要求2或3所述的小分子探针H₄L的制备方法，其特征在于：所述乙醇与水杨醛和3,3'-二氨基联苯胺混合物的质量比为5-20：1。

5.权利要求2或3所述的小分子探针H₄L的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的橙色固体粉与DMF的质量比为1：10-20。

6.根据权利要求1-5任一项所述的小分子探针H4L检测、识别环境中或生物样品中镓离子的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：通过紫外分光光度法，在225-550nm的波长范围内测定镓离子溶液的吸光度；在最大吸收波长365nm下识别环境中或生物样品中镓离子。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：通过荧光分光光度法，以350nm为激发波长，在400-650nm的波长范围内测定镓离子溶液的吸光度；在最大吸收波长510nm下识别环境中或生物样品中镓离子。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述小分子探针H₄L利用荧光成像检测正常细胞和癌细胞中外源性的镓离子的应用。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述小分子探针H₄L利用荧光成像检测斑马鱼体内外源性的镓离子的应用。