CN109758616A - 一种新型促进骨再生材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型LDH纳米片材料和AL/LDH材料及其两种材料的制备方法及其在制备治疗股骨头坏死、骨缺损和/或骨质疏松的骨再生材料中的应用。本发明制备的LDH成分为Mg‑Al‑Yb单层氢氧化物，通过亲水基团的相互作用，阿仑膦酸钠负载于LDH表面上。LDH和AL/LDH用于加速骨坏死区域的骨再生，在加速材料植入部位的骨质再生的同时，AL/LDH还可以促进坏死区域以外骨质密度的增加。目前临床上治疗早期股骨头坏死的主要方法是：髓心减压联合骨移植，AL/LDH和LDH可以用作髓心减压术后的骨移植材料，并且，对于伴有全身骨质疏松的患者，使用AL/LDH作为坏死区域的材料填充有助于改善全身骨密度。

Description

一种新型促进骨再生材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术和生物医学工程领域，具体涉及一种新型促进骨再生材料及其制备方法。
背景技术
随着人类寿命的延长和出行方式的改变，临界性骨缺损(机体无法自发修复的骨质缺损)的发生率越来越高，临界性骨缺损的病因包括但不局限于肿瘤、股骨头坏死和外伤，在美国，每年因为肿瘤和外伤发生临界性骨缺损的患者高达60万。此外，每年约2-3万人被诊断为股骨头坏死，非创伤性股骨头坏死的发生率为1.91/10万*年。如果股骨头坏死患者早期未得到有效的干预，股骨头会依次按照骨坏死、股骨头塌陷、骨关节炎的病程发展，患者将不可避免的接受全髋关节置换手术。在美国，每年全髋关节和全膝关节置换术的手术数量超过100万，直接经济负担超过250亿美金。
目前针对于临界性骨缺损患者的主要治疗方法为以下三种，1)自体骨移植；2)同种异体骨移植；3)异种骨移植。自体骨移植作为临床金标准，优点如下：1)不会被受体免疫排斥；2)更好的骨诱导性、骨引导性和促进成骨作用，但是自体骨移植的来源不足、需要二次手术、手术时间长、术中出血多和治疗费用增加等不足限制了自体骨移植的应用。因此，促进骨再生的组织工程学应用而生，目前用于促进骨再生的主流材料为钙基材料、有机材料和镁基材料。
从钙基材料的仿生学角度，研究者设计了模拟天然羟基磷灰石的人工合成羟基磷灰石、磷酸三钙及其混合物，模拟I型胶原蛋白的蚕丝蛋白、壳聚糖和明胶等。人工合成的羟基磷灰石虽然可以良好的模拟天然骨的无机结构，但是羟基磷灰石在生物体内的降解时间过长，可达数年之久，不利于骨生成。此外，磷酸三钙在体内的降解速度过快，无法长期、有效地促进骨再生。将磷酸三钙和羟基磷灰石制作为复合物后，虽然一定程度上改善了复合物的生物体内降解速度，但是通过现有的方法难以相对精确的控制材料在生物体内的降解速度。蚕丝蛋白和壳聚糖等生物材料虽然可以在一定的程度上促进骨再生，但是促进骨再生的程度有限，且不能满足机体骨修复的速度要求，此外，有机物材料无法在X线下显像，使得术后通过X线观察骨坏死区域材料的填充充分和到位与否难以实现。镁基材料以高纯镁为代表，在体内的降解速度过快，并且在镁金属的降解过程中产生一定量的氢气，在植入物局部和皮下产生气肿，尽管近些年来镁合金的研究如火如荼，但是无论是钙基材料还是镁基材料，都很少有研究者研究其在骨坏死区域中促进骨再生的性能，且以上促进骨再生功能的材料都没有促进材料植入部位以外的骨质密度增加的作用。尽管近些年来的研究表明，一定浓度范围内的镁离子具有明确的促骨再生作用，但是目前针对于镁基材料的研究都是非可注射性的，这在一定程度上降低了其可操作性，不利于该材料在日后在临床应用中的大力推广。
天然骨的主要成分分为以I型胶原蛋白为主的有机相和羟基磷灰石为主要成分的无机相。据文献报道，局部的碱性微环境有利于促进细胞成骨分化，所以，为了使得新型的骨再生材料具备较上述材料更强的生物学作用，并且同时具备一些X线显像性能等，本发明的发明人设计了一种促进新型骨再生材料，该材料不仅可以加速骨坏死区域的骨再生速度，还可以增加骨坏死区域以外的骨密度，此外，还具备X线下的显像性能等。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种具有强烈骨再生促进作用、可生物降解、生物相容性良好、可X线成像性能的骨再生修复材料-LDH和AL/LDH及其材料的制备方法，并提供了LDH和AL/LDH材料在制备治疗骨质疏松和/或股骨头坏死的骨再生材料中的应用。
为实现上述目的，本发明首先提供了一种新型LDH纳米片材料，所述LDH纳米片材料由二价金属离子、三价金属离子和稀有金属镧系三价金属离子组成的单层LDH结构的纳米片，其中二价金属离子包括Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+和/或Ca2+，三价金属离子包括Al3+或Fe3+；所述稀有金属镧系三价金属离子包括Yb3+或Gd3+；所述二价金属离子与三价金属离子和稀有金属镧系三价金属离子的摩尔比为1-4:0.4-2:0.1-0.5。
优选的，本发明可调整二价金属离子与三价金属离子和稀有金属镧系三价金属离子的摩尔比例制备不同类型及不同比例的单层LDH纳米片。
优选的，所述LDH纳米片材料由三种金属离子Mg2+、Al3+、Yb3+组成。
优选的，所述Mg2+：Al3+：Yb3+金属离子的摩尔比为1:0.4:1。
本发明通过实验首次验证了LDH和AL/LDH材料在骨坏死区域中，镁基材料促进骨再生的作用，其次在材料中添加了一定量的具有生物相容性的显像剂镱，最后该材料还负载了一种可抑制破骨细胞破骨活性的药物，并且随着材料的不断降解，缓释出来的药物可以在全身缓慢的起作用。
在本发明的一些实施方案中，所述LDH纳米片材料可以由Zn2+、Fe3+、Gd3+金属离子组成。
在本发明的一些实施方案中，所述LDH纳米片材料可以由Cu2+、Fe3+、Yb3+金属离子组成。
在本发明的一些实施方案中，所述LDH纳米片材料可以由Co2+、Al3+、Yb3+金属离子组成。
本发明所述的LDH纳米片材料也可以由其他的二价金属离子、三价金属离子和稀有金属镧系三价金属离子组成，均属于本发明的保护范围。
优选的，所述金属离子以金属盐的形式存在；所述金属盐的存在形式包括硝酸盐、硫酸盐或氯化盐中的一种。
进一步地，本发明提供了上述新型LDH纳米片材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照比例关系称取二价金属离子与三价金属离子和稀有金属镧系三价金属离子，并溶于去离子水中，在氮气保护下，利用机械搅拌使上述三者完全溶解，形成稳定均匀金属离子混合溶液，所述金属离子混合溶液浓度为0.15～0.65mmol/ml；
(2)配制1～1.5mM的NaOH溶液，将NaOH充分溶解备用；
(3)配制质量3％～5％的NaNO3溶液，按照NaNO3和甲酰胺体积3：7的比例配置成NaNO3混合溶液；
(4)将上述步骤(1)中获得的金属离子混合溶液与步骤(2)NaOH溶液同时逐滴加入至步骤(3)NaNO3混合溶液中，保持pH为9～10，在油浴80℃～90℃条件下，进行机械搅拌10～15分钟；所述步骤(1)金属离子混合溶液与步骤(2)NaOH溶液和步骤(3)NaNO3混合溶液的体积比为1:1:1；
(5)反应完成待溶液冷却后，取出溶液离心，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次，获得单层LDHs纳米片。
优选的，所述金属离子以金属盐的形式存在；所述金属盐的存在形式包括硝酸盐、硫酸盐或氯化盐中的一种。
优选的，所述Mg2+金属盐包括Mg(NO3)26H2O、氯化镁、硫酸镁；所述Al3+金属盐包括Al(NO3)29H2O、氯化铝、硫酸铝；所述Yb3+金属盐包括Yb(NO3)3·5H2O。
优选的，本发明获得的单层LDH具备的负载AL的能力。
更进一步地，本发明提供了一种AL/LDH材料，该材料是由所述的LDH纳米片经负载阿仑膦酸钠制成的材料，所述阿仑膦酸钠与LDH的质量比为0.25-4:1。
优选的，所述阿仑膦酸钠与LDH的质量比例为1-2:1。
更进一步地，本发明还提供了一种AL/LDH材料的制备方法，将阿仑膦酸钠溶于去离子水，搅拌至形成稳定溶液，所述阿仑膦酸钠溶液浓度为1-5mg/mL，按照质量比0.25-4:1的比例与所述的LDH纳米片混合，进行机械搅拌，控制搅拌速度为200-400r/min，在避光室温条件下反应10-12小时。取出反应液，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗2-3次，再使用去离子水清洗离心1次，获得AL/LDH材料。
优选的，所述阿仑膦酸钠溶液浓度为2mg/mL。
再进一步地，本发明提供了所述的LDH纳米片材料及其制备方法或所述AL/LDH材料及其制备方法在制备治疗股骨头坏死、骨缺损和/或骨质疏松的骨再生材料中的应用。
优选的，所述AL/LDH和LDH纳米片材料能促进骨坏死区域的骨质再生，促进细胞成骨分化并形成骨组织，改善全身的骨质密度。
本发明人根据AL/LDH和LDH纳米片材料的特殊性能提供了AL/LDH和LDH纳米片材料在促进骨质再生、骨分化、以及改善全身性骨质密度的产品中应用。
有益效果
本发明旨在制作一种具有强烈骨再生促进作用、可生物降解、生物相容性良好、可X线成像性能的骨再生修复材料。
本发明人提供的一种独创的基于水热反应共沉淀法制备AL/LDH和LDH，在材料的生产制作方面，无需过多的实验仪器、复杂的实验步骤、昂贵的实验原材料，该材料仅通过简单的水热反应和廉价的原材料即可制备成功，可在短时间内大量的生产。
相对于既往的促进骨再生的生物材料，本材料的可注射性能远远优于以往的任何材料，极大的简便了手术的操作步骤，缩短了手术时间，减少了患者的出血等；其次本材料不仅对植入局部的骨质再生有强烈的促进作用，亦可改善全身的骨质密度，尤其适用于伴有全身性骨质疏松的早期股骨头坏死患者；相对于既往的磷酸钙或磷酸镁体系，本材料是一个全新的设计，在概念上突破了既往的固化模式。
1.LDH的成分：本发明制备的LDH成分为Mg-Al-Yb单层氢氧化物，通过亲水基团的相互作用，阿仑膦酸钠负载于LDH表面上。首次验证骨坏死区域中，镁离子是一种强烈促进骨再生的离子，其次在材料中添加了一定量的具有生物相容性的显像剂，铝离子可以改善LDH的力学性能，而阿仑膦酸钠通过抑制破骨细胞的活性，减少骨吸收。总体上，促进骨形成，并且减少骨吸收，最终增加骨质骨密度。
2.LDH的特殊性能如下：1)LDH可以大量的负载阿仑膦酸钠，负载量高达100％；2)LDH为直径50nm左右的纳米材料，在生物体内具有大的表面积体积比，活性强，可以有效的促进更多的干细胞成骨分化并形成骨组织；3)LDH可以缓释阿仑膦酸钠，进入血液中的阿仑膦酸钠可长期有效的促进全身的骨形成；4)LDH可以在X线下具有良好的显像性能，使得在临床应用中，术后即刻判断材料填充骨坏死区域的充分与否成为可能；5)LDH为碱性，在其体内外的降解过程中，局部微环境呈现碱性，局部微碱性微环境利于细胞的成骨分化和骨质形成；6)LDH的降解过程不产生生物毒性产物和气体等，并且降解产物可加速骨质再生；7)纳米颗粒的降解速度适中，并且在纳米颗粒之间的间隙可以形成骨质，进一步放大LDH的促成骨作用(增加骨形成局部微环境中的镁离子浓度和提高了成骨分化相关细胞与LDH的有效接触面积)；8)AL/LDH可以通过缓释作用，降低阿仑膦酸钠的生物毒性；9)以往的研究集中于研究生物材料对健康骨质缺损的修复作用，本实验发现，LDH和AL/LDH不但可以促进骨坏死区域的骨质再生，还可以改善骨坏死区域以外的全身骨质密度。
3.LDH和AL/LDH的应用：LDH和AL/LDH用于加速骨坏死区域的骨再生，在加速材料植入部位的骨质再生的同时，AL/LDH还可以促进坏死区域以外骨质密度的增加。目前临床上治疗早期股骨头坏死的主要方法是：髓心减压联合骨移植，AL/LDH和LDH可以用作髓心减压术后的骨移植材料，并且，对于伴有全身骨质疏松的患者，使用AL/LDH作为坏死区域的材料填充有助于改善全身骨密度。
附图说明
图1材料制备的工业学表征。其中，高分辨率透射电镜图显示(图1a)，合成的LDH具有水滑石的六方片结构，并且粒径在50nm左右；LDH的电子能谱分析显示，LDH由镁、铝、镱三种元素组成，并且三种元素在纳米片上均匀分散(图1b)；XPS谱图(图1c)，进一步说明了LDH的元素组成，以及各个元素所处的电子能级；Yb的4d电子轨道XPS谱图(图1d)；AFM(原子力显微镜)结果(图1e)；对e图中选取的3个纳米片进行具体测量，纵轴是厚度，横轴是粒径(图1f)；对1.25-20mg/mL Yb浓度的LDH进行CT测试(图1g)；(图1h)将AL负载于LDH，后测定实际负载量(LC)与负载效率(EE)；红外谱图(图1i)，证明AL成功与LDH进行结合。
图2AL/LDH、LDH和AL的细胞相容性和促进细胞成骨分化的能力；CCK-8(图2i),Q-PCR(图2j，空白对照组的表达量作为1，将图中四组的表达量除以空白对照组后，得出的商，即为图中柱状图显示的数值),茜素红(图2a-d)和鬼笔环肽染色(图2e-h)结果。
图3AL/LDH、LDH和AL的生物体内安全性，血清离子浓度(图3m-n)和主要脏器H&E染色(图3a-l)。注意，图3为脊髓的HE染色，其中b图中，箭头为示意箭头，白色箭头示意是脊髓中央管，黑色剪头示意是神经元。其中，LDH组(8mg/ml)，AL/LDH组(8mg：8mg/ml)，positivegroup组(自体髂骨移植)，negative group组(未填充任何材料)。
图4材料的X线下成像能力。其中，组别设置如下：blank control(空白对照组)，natural corticalbone(阳性对照组)，4、2、1mm depth(LDH或AL-LDH胶体溶液的深度为4、2、1mm)。
图5micro-CT代表性截图(图5a-h)和骨定量分析(图5i-j)。
图6AL/LDH、LDH、阳性对照组和阴性对照组的H&E染色(图6a-d)和骨膜蛋白染色(图6e-h)结果，以及H&E染色中胶原蛋白定量分析的结果(图6i)。
图7材料(8mg/ml)可以通过直径为0.5mm的注射器针头注射。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本实验旨在制作一种具有强烈骨再生促进作用、可生物降解、生物相容性良好、可X线成像性能的骨再生修复材料-LDH和AL/LDH及其制备方法。
发明人通过体外细胞实验所述材料在生物体内外的安全性；进一步，克氏针制作骨缺损后，通过反复液氮冷冻股骨头下骨质，再通过micro-CT和免疫组织化学染色结果确定，是否成功地建立了新西兰兔股骨头坏死动物模型，相对于传统的健康骨质缺损动物模型，股骨头坏死模型对材料促骨再生的性能要求更高；在验证材料促骨再生性能的动物模型上，该动物模型较健康骨质缺损的模型具有显著的优越性。
以往的实验研究都将注意力集中于单纯材料的开发，未将临床上非常有效的抗骨质疏松药物-阿仑膦酸钠应用起来。为了治疗伴有全身性骨质疏松的早期股骨头坏死患者，促进骨坏死局部的骨质再生和增加全身的骨密度是对材料的两大要求，但是，材料的生物有效性必须建立在生物安全性的基础上。发明人将65只新西兰大白兔随机分为13组，其中3组为阳性对照组，3组为阴性对照组，3组为LDH组，3组为AL/LDH组，1组为空白对照组。成功制作股骨头坏死的动物模型后，通过注射器，将材料充分注射至骨坏死区，或将自体移植的髂骨充分填充至骨坏死区域。术后2、4、8W分别取相应组实验动物的外周血、脊髓、肝脏、肾脏进行生物安全性的评价，分别取出整段股骨进行目标区域的Micro-CT扫描和免疫组织化学染色，通过定量和半定量的分析，结果表明：该材料的具有良好的生物相容性；与临床治疗早期股骨头坏死的金标准相比较(股骨头髓心减压术+自体髂骨移植)，AL/LDH和LDH术后4W的植入部位的骨再生量与金标准相比较没有显著的统计学差异，术后8W的骨再生量优于金标准组，并且具有显著的统计学差异；在股骨干骨坏死区域的骨再生量上，AL/LDH和LDH在各个时间点上没有显著的统计学差异，但是AL/LDH组骨坏死区域以外的骨质密度上显著增加。
传统的羟基磷灰石和磷酸三钙材料的制作通常需要高达1000度以上的高温等苛刻条件，对试验设备的要求高，并且对于孔径和孔隙率的控制性较差；而以蚕丝蛋白和壳聚糖等有机物作为基础制作促再生材料的方法工艺过于复杂，经常需要几十步的反应和多种试剂，耗时达数天，并且材料的来源相对单一和昂贵。本实验通过独创的共沉淀法制备AL/LDH和LDH，在原材料的来源方面，我国是世界上少数几个现代盐湖发育的国家之一，盐湖矿物盐资源十分丰富，本世纪初，我国加大了对盐湖资源的开发力度，针对其中的钾、镁等资源进行提取和加工利用，但是各种盐湖矿物资源处于共生状态，以青海察尔汗盐湖为例，含有氯化镁储存量超过30亿t，每生产1t氯化钾往往产生10t氯化镁老卤，如果不加以有效的利用，不仅会造成镁资源的浪费，对盐湖的生态环境造成破坏并形成“镁害”。本实验中的重点之一是将废弃镁资源转化为高附加值生物医用材料，一方面防止了“镁害”的发生，另一方面产出了高附加值的医用产品。
实施例1骨再生材料1制备
将Mg(NO3)2·6H2O(Sigma-Aldrich 63084-500G-F)，Al(NO3)3·9H2O(Sigma-Aldrich 229415-100G),Yb(NO3)3·5H2O(Sigma-Aldrich209147-10G)按照摩尔1mmol:1.5mmol:0.4mmol称量，并溶于去离子水中，在氮气保护下，利用机械搅拌使上述三者完全溶解，形成稳定均匀溶液10mL。配制1mM的NaOH溶液10mL，充分溶解备用；配制3％的NaNO3，并且按照3：7的比例与甲酰胺配置成10mL混合溶液。将上述Mg(NO3)2·6H2O，Al(NO3)3·9H2O,Yb(NO3)3·5H2O溶液与NaOH溶液同时逐滴加入至NaNO3甲酰胺混合溶液中，保持pH为9～10，在油浴80℃～90℃条件下，进行机械搅拌10～15分钟。反应完成待溶液冷却后，取出溶液离心，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次，获得单层LDHs纳米片材料。
实施例2骨再生材料2制备
将Mg(NO3)2·6H2O，Al(NO3)3·9H2O,Yb(NO3)3·5H2O按照摩尔4mmol:0.4mmol:0.5mmol称量，并溶于去离子水中，在氮气保护下，利用机械搅拌使上述三者完全溶解，形成稳定均匀溶液10mL。配制1～1.5mM的NaOH溶液10mL，充分溶解备用；配制3％～5％的NaNO3，并且按照3：7的比例与甲酰胺配置成10mL混合溶液。将上述Mg(NO3)2·6H2O，Al(NO3)3·9H2O,Yb(NO3)3·5H2O溶液与NaOH溶液同时逐滴加入至NaNO3甲酰胺混合溶液中，保持pH为9～10，在油浴80℃～90℃条件下，进行机械搅拌10～15分钟。反应完成待溶液冷却后，取出溶液离心，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次，获得单层LDHs纳米片材料。
实施例3骨再生材料3制备
将Mg(NO3)2·6H2O，Al(NO3)3·9H2O,Yb(NO3)3·5H2O按照摩尔2mmol:0.8mmol:0.2mmol称量，并溶于去离子水中，在氮气保护下，利用机械搅拌使上述三者完全溶解，形成稳定均匀溶液10mL。配制1～1.5mM的NaOH溶液10mL，充分溶解备用；配制质量3％～5％的NaNO3，并且按照3：7的比例与甲酰胺配置成10mL混合溶液。将上述Mg(NO3)2·6H2O，Al(NO3)3·9H2O,Yb(NO3)3·5H2O溶液与NaOH溶液同时逐滴加入至NaNO3甲酰胺混合溶液中，保持pH为9～10，在油浴80℃～90℃条件下，进行机械搅拌10～15分钟。反应完成待溶液冷却后，取出溶液离心，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次，获得单层LDHs纳米片材料。
高分辨率透射电镜图显示，合成的LDH具有水滑石的六方片结构，并且粒径在50nm左右(图1a)；LDH的电子能谱分析显示，LDH由镁、铝、镱三种元素组成，并且三种元素在纳米片上均匀分散(图1b)；XPS谱图，进一步说明了LDH的元素组成，以及各个元素所处的电子能级(图1c)；Yb的4d电子轨道XPS谱图，即c图中Yb 4d的放大，说明LDH中含有Yb元素(图1d)；AFM(原子力显微镜)结果说明，LDH纳米片的厚度在0.9nm左右，即图中所标的数值，属于单层LDH结构，同时也可说明LDH具有水滑石六方片结构，以及粒径(图1e)；对e图中选取的3个纳米片进行具体测量，纵轴是厚度，横轴是粒径(图1f)。
将阿仑膦酸钠(AL)溶于去离子水，搅拌至形成稳定溶液，配置2mg/ml的阿仑膦酸钠溶液；并按照质量比0.25-4:1的比例与上述制得的LDHs纳米片混合，进行机械搅拌，控制搅拌速度为200-400r/min，在避光室温条件下反应10-12小时。取出反应液，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗2-3次，再使用去离子水清洗离心1次，获得AL/LDH材料。所述阿仑膦酸钠溶液浓度可以配置成1-5mg/ml。
调整二价金属与三价金属的比例制备不同类型及不同比例的单层LDHs纳米片。调整阿仑膦酸钠与LDHs的比例，制得不同比例的超分子纳米药物，并测试其最终性能。
所述Mg(NO3)26H2O的可溶性无机盐可替换为氯化镁、硫酸镁；所述Al(NO3)29H2O的可溶性无机盐可替换为为氯化铝、硫酸铝。
为了验证该材料的成像性能，按照Yb3+的浓度(1.25-20mg/mL)(Sigma-Aldrich209147-10G)将其溶解于去离子水中，配置Yb-LDH溶液，对每一个Yb浓度的LDH进行CT测试，每一个浓度对应一个CT值，拟合成一条直线，斜率即为CT值，LDH的CT值是65.5.高于现在商用造影剂Iobitridol(图1g)。
为了进一步的优化LDH的性能，发明人将AL负载于LDH上，通过调整AL与LDH的投料质量比例，从0.25:1到4:1，反应后测定实际负载量(LC)与负载效率(EE)，2:1的时候可以做到负载效率接近200％，4:1的时候负载效率只有不到50％，说明投料比为2:1的时候可以达到AL在LDH上的负载饱和(图1h)；红外谱图显示，在最终AL/LDH的谱图上能同时找到AL和LDH各自的特征峰，说明AL成功与LDH进行结合(图1i)。
上述的实验结果，表明镁铝镱LDH合成成功，合成的LDH为单层结构，并且单层的LDH具备的负载AL的能力。
LDHs负载AL的最大量为200％(即AL：LDH为2:1)，但是考虑到过量的AL具有引起颌骨坏死的风险，因此，以下实验最终采用的AL-LDH为质量比为1:1进行的。
实施例4生物体内外安全性
本发明采用了使用率较高的MC3T3-E1(小鼠胚胎成骨细胞前体细胞)(国家实验细胞资源共享服务平台，3111C0001CCC000012)作为受试细胞进行了体外生物相容性的测试。实验分为四组，LDH(镁铝水滑石)、AL-LDH(阿仑膦酸钠/镁铝水滑石)、AL(阿仑膦酸钠)和blank control(空白对照组)，按照国家相关标准<Biological evaluation ofmedicaldevices-Part 5:In vitro cytotoxicity test,GB/T 16886.5-2017>.，将100、50、25、10、5mg/ml的AL-LDH及LDH制作浸提液，使用浸提液培养MC3T3-E1，主要实验结果如下：
MC3T3-E1增殖实验(CCK-8)评估了材料的细胞毒性，根据图2i的结果，可以看到，LDH的生物相容性良好，AL/LDH的生物相容性次之，AL可能因为严重改变了培养基的PH和离子浓度，进而不支持细胞的生长，上述结果表明，AL/LDH和LDH是一种细胞相容性良好的生物材料。
材料浸提液培养MC3T3-E17天后，提取总RNA后，使用Q-PCR对成骨分化相关基因的表达进行检测，将空白对照组的BMP-2、ALP、RUNX-2、Collagen I、Osteocalcin的基因转录量定为1，其他各组的结果如图2j所示：上述成骨分化指标在各组的表达量均大于空白对照组，尤其是Collagen I的表达量，可高达对照组的数千倍，结果表明：AL/LDH和LDH可以上调与成骨分化相关基因的表达。
将100、50、25、10、5mg/ml的LDH、AL/LDH、AL作为实验组，空白组作为对照组，相应组别的材料浸提液培养MC3T3-E112天后进行茜素红染色，结果表明：LDH、AL/LDH两组有明显的钙盐沉积，尤其是100μg/ml组；在AL组未观察到细胞；空白对照组可以观察到满视野的细胞，但是未观察到任何钙盐沉积(图2a-d)。上述结果表明：AL/LDH、LDH可以促进MC3T3-E1细胞成骨分化并促进细胞外基质矿化，且具有剂量依赖效应，但是AL浸提液并不允许MC3T3-E1在其中生长。
采取与茜素红相同的分组方法和培养时间，将各组培养7天后的细胞消化离心后重新接种，按照鬼笔环肽染色试剂(Solarbio，CA1620)的说明书进行逐步染色后，行荧光共聚焦显微镜观察，结果显示：LDH组的细胞形态呈现扁椭圆形或多突起星形、AL/LDH组的细胞形态为矮柱状或立方状；在AL组未观察到细胞；空白对照组的细胞为梭形(图2e-h)，而MC3T3-E1在成骨分化的过程中会由梭形变为矮柱状或立方状，再延伸为扁椭圆形或多突起星形。鬼笔环肽染色的结论与茜素红染色结果一致：AL/LDH、LDH可以显著的促进MC3T3-E1成骨分化。
实施例5生物体内安全性评价
股骨头下骨质钻孔后，通过反复液氮冷冻法成功建立了新西兰大白兔的股骨头坏死模型，具体参照Wang,Y.et al.Self-healing and injectable hybrid hydrogel forbone regeneration offemoral head necrosis and defect.Biochemical andbiophysical research communications,doi:10.1016/j.bbrc.2018.11.097(2018)。
将一定量的材料溶解于PBS后形成AL/LDH(8mg：8mg/ml)、LDH(8mg/ml)胶体溶液，新西兰大白兔骨坏死区域的骨质被移除后形成骨缺损，反复液氮冷冻后，再通过针头直径为0.5mm的注射器把上述胶体材料中的一种注入到骨缺损部位，使用骨蜡(Sanyou,China)封堵皮质骨上的孔。实验分组：LDH组，AL/LDH组，positive group组(自体髂骨移植)，negative group组(未填充任何材料)。术后的第2、4、8周，分别通过耳缘静脉采集静脉全血5ml，置于黄帽采血管中，充分混匀后室温静置5min，离心机3000rpm*10min，转移上层血清至EP管中，-20℃保存。使用电感耦合等离子体质谱仪检测血清中的镁离子、铝离子浓度。主要的实验结果如下(图3m-n)：
LDH在被动化学溶解和破骨细胞主动重吸收的双重作用下迅速地发生降解，并释放出大量的镁离子进入内环境中，直接导致术后第2周LDH组兔子血清镁离子的含量最高；AL/LDH中缓释的AL抑制了破骨细胞的活性，主要在被动化学溶解下发生了较LDH相对缓慢的生物降解，致使术后第2周的血清镁离子含量低于LDH组，但是由于AL/LDH及LDH在生物降解的过程中不断的释放镁离子进入血液，所以镁离子含量高于阴性对照组、阳性对照组和空白对照组。随着机体不断的进行调节，骨骼和肌肉释放镁离子进入血液，再加上LDH的缓慢降解，血清中的镁离子在术后第4、8周时的浓度最高；血清铝离子的浓度随着术后时间的延长在不断的下降，术后第8周时，各组的铝离子含量基本恢复到术前的水平。
上述结果表明：AL/LDH和LDH植入生物体内后，并未长时间、较大程度地影响动物内环境的稳态。
术后第2、4、8周处死相应组别的动物后，分别取材肝、肾、脊髓等重要脏器进行H&E染色，观察组织形态学是否发生了显著的改变，主要结果如下(图3a-l)：
肝脏的基本功能单位肝小叶在LDH、AL/LDH、阳性对照组及阴性对照组之间未发生显著的形态学变化；肾脏的基本功能单位肾小球、肾小囊和肾小管在各组之间未观察到显著的差异性改变；鉴于LDH或AL/LDH中的铝离子具有一定的神经毒性，发明人重点观察了脊髓切片中的神经元数量和神经元形态，在4组之间并未发现肉眼可见的数量和形态结构的差异。
上述结果综合表明：LDH和AL/LDH植入新西兰大白兔体内后，未对大白兔的主要脏器造成显著的形态学改变，在一定程度上证明了该材料的生物相容性。
实施例6成像能力
临床应用中，为了便于术者术后即刻判断生物材料的填充到位与否，发明人在材料中添加了一定量的成像剂(镱，Yb)(Sigma-Aldrich 209147-10G)，分别设置如下组：blank control(空白对照组)，natural cortical bone(阳性对照组)，检测X线下的材料成像性能(图4)。结果表明：4mm厚度的LDH胶体溶液的成像亮度类似天然皮质骨的成像亮度，随着材料深度的增加，成像性能愈佳(图4)。本实验，骨缺损的直径为3mm，按照图4的结果，直径3mm的材料填充区域，在X线下应有清晰的显影，AL/LDH的LDH成像性能可以辅助术者在术后即刻进行判断。
实施例7骨质再生
本实验设计的AL/LDH、LDH旨在促进骨坏死区域的骨质再生，将至少0.2ml的AL/LDH(8mg:8mg/ml)、LDH(8mg/ml)胶体溶液或自体髂骨完全填充满骨坏死区域后，术后第2周、4周、8周分别取出完整的术侧股骨，并行micro-CT扫描(Germany,Siemens)，各组股骨干和股骨头骨形成概况的代表性矢状位截图如图5a-h所示。与临床金标准-自体骨移植(阳性对照组)相比，术后第4周，LDH或AL/LDH组的骨再生量与阳性对照组相同；在第8周，LDH和AL/LDH组中再生骨的量分别是阳性对照组的1.41倍和1.23倍。与阴性对照组相比，术后第4周时，LDH或AL/LDH组的骨再生量大于阴性对照组；在术后第8周时，LDH和AL/LDH组的骨再生总量分别是阴性对照组的2.77倍和2.41倍(图5i)。此外，正如发明人假设的那样，随着AL/LDH的降解，股骨头的骨质密度也缓慢增加，这与血清中镁离子的浓度一致。在术后第8周时，LDH和AL/LDH组的股骨头骨量分别是阳性对照组的1.13和1.52倍；LDH和AL/LDH组股骨头骨量分别为阴性对照组的1.17和1.57倍(图5j)。
对股骨头的指定区域进行骨定量分析后，通过AL/LDH组股骨头骨密度的增加，说明AL的缓慢和连续释放可能会增加全身骨骼的骨密度。对于伴有骨质疏松症的ONFH(股骨头坏死)患者，AL/LDH可能是一种性能优异的促进骨再生材料。
Micro-CT仅定量分析了再生骨组织中的矿物质成分，需要通过免疫组织化学染色进一步评估骨组织中有机成分的再生量，骨组织中的有机成分主要为I型胶原蛋白。
免疫组织化学染色由H&E染色和抗骨膜蛋白染色组成。具体H&E染色步骤如下：将所有股骨样本浸泡于EDTA脱钙液中(Solarbio，E1171)一个月，每隔三天完全更换一次脱钙液，完全脱钙后进行石蜡包埋，再使用旋转切片机(Germany，Leica，RM2255)将组织切为厚度为50um的组织切片，苏木精及伊红一次染色后，酒精脱水、二甲苯透明切片，使用显微镜进行观察。具体的抗骨膜蛋白染色如下：二甲苯和酒精依次作用切片后使用EDTA抗原修复液(Solarbio，C1038)修复待染色的骨膜蛋白，先使用兔抗骨膜蛋白/HRP(China，Bioss bs-4994R-HRP),再使用HRP-羊抗兔IgG抗体(U.S.KPL,074-15-6)依次染色后行显微镜观察。
结果如图6a-d，i所示，术后第2周和第4周，LDH和AL/LDH组I型胶原蛋白的再生量与阳性对照组无显着统计学差异；术后第8周，LDH和AL/LDH组I型胶原蛋白的再生量几乎是阳性对照组的2倍，并且差异有统计学意义；术后第2、4、8周，阴性对照组中的I型胶原蛋白的再生量小于其他组中的胶原蛋白量。此外，在骨陷窝中可以观察到骨细胞(图6)。另外，在术后第4周和第8周，特别是在8周时，可以在LDH和AL/LDH组中检测到血管样组织和血细胞。在H&E染色后，与LDH或AL/LDH组相比，阴性对照组的切片在任何时间点均显示较少的血管样组织。
抗骨膜蛋白染色进一步的佐证了H&E的结论(图6e-h)。
总之，来自micro-CT和免疫组织化学分析的结果显示LDH和AL/LDH可以在无其他生物因子(例如BMP2)的情况下强烈地促进骨再生。再生骨的量可以归因于从LDH或AL/LDH释放的镁离子和AL。AL是临床上最有效的抗骨质疏松症的药物。特别是，可注射性良好的LDH或AL/LDH可以通过0.5mm针(图7)轻松地注入ONFH的不规则区域，这将大大减小手术对患者伤口周围软组织的损伤。
上述结果表示，AL/LDH和LDH是一种性能优于自体骨移植的生物材料，并且操作简单，便于术者进行材料填充。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种新型LDH纳米片材料，其特征在于，所述LDH纳米片材料由二价金属离子、三价金属离子和稀有金属镧系三价金属离子组成的单层LDH结构的纳米片，其中二价金属离子包括Mg2+、Zn2+、Cu2+、Co2+和/或Ca2+，三价金属离子包括Al3+或Fe3+；所述稀有金属镧系三价金属离子包括Yb3+或Gd3+；所述二价金属离子与三价金属离子和稀有金属镧系三价金属离子的摩尔比为1-4:0.4-2:0.1-0.5。
2.如权利要求1所述的LDH纳米片材料，其特征在于，所述LDH纳米片材料由三种金属离子Mg2+、Al3+、Yb3+组成。
3.如权利要求2所述的LDH纳米片材料，其特征在于，所述Mg2+：Al3+：Yb3+金属离子的摩尔比为1:0.4:1。
4.权利要求1～3新型LDH纳米片材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照比例关系称取二价金属离子与三价金属离子和稀有金属镧系三价金属离子，并溶于去离子水中，在氮气保护下，利用机械搅拌使上述三者完全溶解，形成稳定均匀金属离子混合溶液，所述金属离子混合溶液浓度为0.15～0.65mmol/ml；
(2)配制1～1.5mM的NaOH溶液，将NaOH充分溶解备用；
(3)配制质量3％～5％的NaNO3溶液，按照NaNO3和甲酰胺体积3：7的比例配置成NaNO3混合溶液；
(4)将上述步骤(1)中获得的金属离子混合溶液与步骤(2)NaOH溶液同时逐滴加入至步骤(3)NaNO3混合溶液中，保持pH为9～10，在油浴80℃～90℃条件下，进行机械搅拌10～15分钟；所述步骤(1)金属离子混合溶液与步骤(2)NaOH溶液和步骤(3)NaNO3混合溶液的体积比为1:1:1；
(5)反应完成待溶液冷却后，取出溶液离心，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗3次，再使用去离子水清洗离心1次，获得单层LDHs纳米片。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述金属离子以金属盐的形式存在；所述金属盐的存在形式包括硝酸盐、硫酸盐或氯化盐中的一种。
6.如权利要求5的制备方法，其特征在于，所述Mg2+金属盐包括Mg(NO3)26H2O、氯化镁、硫酸镁；所述Al3+金属盐包括Al(NO3)29H2O、氯化铝、硫酸铝；所述Yb3+金属盐包括Yb(NO3)3·5H2O。
7.一种AL/LDH材料，其特征在于，所述材料是由权利要求1所述的LDH纳米片经负载阿仑膦酸钠制成的材料，所述阿仑膦酸钠与LDH的质量比为0.25-4:1。
8.如权利要求7所述的材料，其特征在于，所述阿仑膦酸钠与LDH的质量比例为1-2:1。
9.一种AL/LDH材料的制备方法，其特征在于，将阿仑膦酸钠溶于去离子水，搅拌至形成稳定溶液，所述溶液浓度为1-5mg/ml；按照质量比0.25-4:1的比例与权利要求1制得的LDHs纳米片混合，进行机械搅拌，控制搅拌速度为200-400r/min，在避光室温条件下反应10-12小时。取出反应液，使用去离子水与乙醇的混合液离心清洗2-3次，再使用去离子水清洗离心1次，获得AL/LDH材料。
10.权利要求1～3任一项所述的LDH纳米片材料或权利要求4～6任一项所述的制备方法或权利要求7～8任一项所述AL/LDH材料或权利要求9所述的制备方法在制备治疗股骨头坏死、骨缺损和/或骨质疏松的骨再生材料中的应用。
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