CN109750059A - 水稻β-淀粉酶BA2及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水稻β‑淀粉酶BA2及其编码基因与应用。本发明的水稻β‑淀粉酶BA2的氨基酸酸序列如SEQ ID No.6所示或在此序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列，其基因编码的核苷酸序列如SEQ ID No.1或与该序列80％同源性的序列所示。本发明的水稻β‑淀粉酶在花粉特异性启动子驱动下在花粉发育期表达可提前降解淀粉，无法为花粉萌发提供能量，使得花粉萌发被遏制，导致花粉败育。本发明的水稻β‑淀粉酶BA2可有效防止转基因花粉逃逸，也可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态，同时在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，在作物种质资源改良、遗传育种方面具有广阔的应用前景。

Description

水稻β-淀粉酶BA2及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及花粉特异性表达β-淀粉酶BA2，其可导致花粉败育，并且利用现代生物技术，应用于杂交种子生产技术体系，保证制种质量，提高制种效率，也可应用于防止转基因扩散。

背景技术

植物杂种优势利用是最为经济有效的提高粮食产量的途径之一，虽然几乎所有的农作物都尽可能利用杂种优势，但仍存在一些限制因素，例如选育优良组合难度较大，杂交制种成本高、风险高等特点，导致杂交作物所占的比重仍较小，主要农作物中尤以水稻为甚，其杂种优势商业化应用主要通过上世纪研发的“三系法”到“两系法”育制种路线，尽管“两系法”克服了“三系法”的种质资源利用率低、不育系培育难度大时间长、病害风险高等缺陷，提高了配组自由度，提高了水稻杂种优势利用效率，但“两系法”的温敏不育系易受温度影响，从而易造成大面积制种失败，损失严重，至今不能完全替代“三系法”。“三系法”和“两系法”的上述缺陷仍然是制约水稻杂种优势利用的关键环节，因此研究人员努力开发新方法提高农作物的杂种优势利用效率，其中创制优良不育系是核心。

植物雄性不育主要体现在花粉败育，它涉及到花器官中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等众多环节或因素，其中花粉发育涉及到众多基因的表达调控，弄清其全过程和分子机理是研究植物雄性不育的基础和关键所在。上世纪90年代初，Mariani等人利用来自烟草的花药绒毡层的特异启动子(TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)重组表达盒转化烟草和油菜，并成功获得雄性不育系，开创了人工制备雄性不育系的新途径(Denis M,Delourme R,Gourret J P,et al.Expression ofengineered nuclear male sterility in Brassica napus(genetics,morphology,cytology,and sensitivity to temperature)[J].Plant Physiology,1993,101(4):1295-1304.)。表明利用其他功能基因通过基因工程方法创制转基因雄性不育植株具备可行性。

在花粉发育后期会在花粉粒中合成淀粉，为花粉萌发和花粉管延伸储备能量。因此，若花粉粒中的淀粉提前被降解，瓦解其能量来源，从而阻碍花粉正常发育及遏制花粉管的萌发与伸长，使其无法完成受精过程，将会导致植物雄性不育。淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，在动植物、细菌和真菌中普遍存在。研究人员通过利用基因工程技术，获得了各种淀粉酶基因的cDNA序列(崔锦,马向东(2009)淀粉酶基因的多样性.郑州牧业工程高等专科学校学报,29(2):21-23)。对其多样性研究表明，除来源多样性外，其基因结构和功能方面皆呈现多样性。根据其对淀粉的作用方式不同分为α-淀粉酶，β-淀粉酶，γ-淀粉酶和异淀粉酶等。其中β-淀粉酶属于外切型淀粉酶，可从淀粉分子的内部随机切割α-1，4线性糖苷键的非还原末端，使淀粉水解成麦芽糖和极限糊精，释放能量(Maarel,M.J.E.C.V.D.,Veen,B.V.D.,Uitdehaag,J.C.M.,Leemhuis,H.,&Dijkhuizen,L.Properties andapplications of starch-converting enzymes of the-amylase family.Journal ofBiotechnology,2002,94(2).DOI:10.1016/S0168-1656(01)00407-2)。在成熟花粉中，适量的淀粉酶可水解淀粉，为花粉的正常发育和花粉管的萌发、生长提供能量。相反，若在花粉形成过程中淀粉酶过表达和沉默表达，都会降低花粉能量代谢水平，导致淀粉积累量不足，产生败育花粉。

因此，本发明通过基因工程手段，特异性地调控淀粉酶的时空表达，获得转基因花粉败育植株，实现非转基因不育系的繁育及非转基因杂交种的生产，特别是在控制育性和转基因漂移等方面提供了新的选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻β-淀粉酶BA2在导致花粉败育及制备转基因花粉败育植株中的应用。

为了达到以上目的，本发明提供的水稻β-淀粉酶BA2，其氨基酸序列为：

a)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；或

b)SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供了编码水稻β-淀粉酶BA2的基因，是如下：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有80％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本领域技术人员根据相同目的能够容易地鉴定并利用与植物花粉败育基因β-淀粉酶BA2核苷酸序列互补的DNA分子，因此，具有启动子活性并在严格条件下与本发明败育基因β-淀粉酶BA2序列或其片段杂交的分离序列包括在本发明中。其中，所述核苷酸序列互补，是指在严格条件下能与β-淀粉酶BA2杂交。严格条件是指探针将与其靶序列杂交至可探测程度超过与其它序列杂交(如至少2倍于背景)的条件。严格条件具有序列依赖性，且因环境的不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选择地，可以调节严格条件以允许一些序列错配，使得探测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针长度短于大约1000个核苷酸，优选地短于500个核苷酸。

典型地，严格条件是在pH值7.0-8.3下盐浓度低于大约1.5M Na离子，典型地大约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，温度对短探针(如10-50个核苷酸)至少大约30℃，对长探针(如超过50个核苷酸)至少大约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可获得严格条件。低严格条件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液中37℃杂交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。中度严格条件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗涤。高度严格条件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS的缓冲溶液中37℃杂交，在0.1×SSC中60-65℃洗涤。非必要地，洗涤缓冲液可含有大约0.1％-1％的SDS。杂交时间一般少于大约24小时，通常大约4-12小时。

特别典型地是杂交后洗涤的函数，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比，L是杂交体在碱基对中的长度。Tm是50％互补靶序列与完全配对探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。每1％的错配需Tm降低大约l℃；因此，Tm杂交和/或洗涤条件可被调节以与所需同一性的序列杂交。例如，如果探寻的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，选择的严格条件是低于特定序列的热解链温度(Tm)大约5℃，且其在规定的离子强度和pH下互补。但是，高度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低度严格条件可以应用低于热解链温度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。应用此方程、杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域普通技术人员会理解杂交和/或洗涤溶液的条件随严格度的变化而变化。如果所需的错配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度以能够使用较高的温度。核酸杂交的指南见于Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术应用核酸探针杂交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人编辑(1995)分子生物学现代方法第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience,New York)。见Sambrook等人(1989)分子克隆:实验室手册(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。所述严格条件优选为在6×SSC(柠檬酸钠)、0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

本发明提供了含有编码上述水稻β-淀粉酶BA2基因的生物材料，其为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。

本发明提供的上述生物材料还含有转导肽和雄性配子优先型启动子。

进一步地，本发明提供的表达盒含有SEQ ID No.1-3，或1，2，4或1，2，5所示的DNA片段。

其中，SEQ ID No.1所示的序列长度为1659bp的是水稻花粉败育基因β-淀粉酶BA2正向DNA片段；SEQ ID No.2所示的序列长度为174bp的转导肽；SEQ ID No.3所示的序列长度为2737bp的雄性配子优先型启动子PG47,SEQ ID No.4所示的序列长度为2038bp的雄性配子优先型启动子PC32,SEQ ID No.5所示的序列长度为1960bp的雄性配子优先型启动子PCHF15。

本发明含有上述水稻β-淀粉酶BA2重组表达载体可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物学方法转化植物细胞或组织获得独立的转基因细胞或组织，获得含转基因成分的花粉败育的转基因株系。

本发明提供了上述水稻β-淀粉酶BA2或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在降解植物花粉中淀粉或扰乱植物花粉发育中的应用。

本发明提供了上述水稻β-淀粉酶BA2或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在诱导植物雄性不育中的应用。

本发明提供了上述水稻β-淀粉酶BA2或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在制备花粉败育转基因植株中的应用。

所述转基因植物为外源基因在花粉中特异表达的转基因植物，优选为授粉/受精能力增强/削弱的转基因植物，更优选为雄性不育转基因植物。

本发明提供了上述水稻β-淀粉酶BA2或其编码基因或含有其编码基因的生物材料在作物育种中的应用。

本发明提供了一种降解植物花粉中淀粉，从而阻止外源基因扩散的方法，将含有水稻β-淀粉酶BA2基因的表达盒导入植物中获得转基因花粉败育的转基因植株，使转基因植株花粉无法正常授粉，从而阻止植物花粉中外源基因扩散。

本发明提供了一种利用含有水稻β-淀粉酶BA2基因的转基因植株生产非转基因种子的方法，是将含有水稻β-淀粉酶BA2基因的转基因植株作为杂交作物中保持系授粉给植物雄性不育系，不育系结实收获种子，该种子为非转基因种子，实现不育系繁育或杂交种制种。

所述的水稻β-淀粉酶BA2基因的核苷酸序列为：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述的植物为禾本科、豆科、锦葵科、十字花科植物。所述植物包括而不限于水稻、玉米、高梁、高粱、燕麦、小麦、粟、甘蔗、大豆、芸苔属物种、棉花、红花、烟草、苜蓿和向日葵。

本发明的有益效果在于：(1)花粉败育基因β-淀粉酶BA2分离自水稻，对水稻、玉米、小麦等基因工程十分有利，同时作为水稻的内源基因，对水稻的基因工程更是影响巨大。(2)水稻β-淀粉酶BA2花粉粒碘染实验表明，β-淀粉酶BA2能在启动子PG47驱动下，能精确地作用于花粉粒，使得可育花粉和败育花粉的比例符合为1:1。(3)本发明植物β-淀粉酶BA2基因表达调控精确，可控制转基因扩散；可用于雄性不育系的保持和繁殖，同时在杂交制种过程中省去人工去雄步骤，应用前景广阔。

附图说明

图1是实施例2中花粉败育基因水稻β-淀粉酶BA2的重组表达载体DX2182-BA2构建流程图。

图2是实施例4中水稻花粉碘染照片。WT：野生型水稻中花11花粉碘染；BA2败育基因：转水稻β-淀粉酶BA2水稻株系花粉碘染。

图3实施例5中DX2182-BA2转基因水稻自交种子潮霉素筛选结果。ZH11：非转基因对照；16-2(T1),17-2(T1)：均为转水稻β-淀粉酶BA2水稻株系T1代；1/2MS：生根培养基；1/2MS+Hn：生根培养基中添加筛选剂潮霉素。

图4是实施例6中DX2182-BA2转基因水稻杂交种子潮霉素筛选28d结果。ZH11：非转基因对照；16-2(T2),17-2(T2)：均为转水稻β-淀粉酶BA2水稻株系T2代；1907×16-2，1907×17-2：转水稻β-淀粉酶BA2水稻株系T1代16-2、17-2授粉给非转基因水稻材料1907所获杂交种；1/2MS：生根培养基；1/2MS+Hn：生根培养基中添加筛选剂潮霉素。

图5是实施例6中DX2182-BA2转基因水稻株系授粉获得杂交种转基因成分PCR检测电泳图。CK-：非转基因对照中花11；CK+：DX2182-BA2载体；1-7：随机挑选杂交种幼苗。Hn：潮霉素引物(SEQ ID NO:11-12)，P1：跨pG47启动子与BA2引物(SEQ ID NO:13-14)，P2：跨BA2和终止子引物(SEQ ID NO:15-16)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。

实施例1水稻β-淀粉酶BA2获取

1、水稻RNA的提取利用Biozol Reagent方法提取水稻RNA：称取0.1g水稻新鲜幼穗组织，加1ml Biozol Reagent混匀，室温静置5min；按每1ml Biozol Reagent加0.2ml氯仿，用力震荡15s，待溶液充分乳化后，再室温静置5min，12000rpm，4℃离心15min；从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中；向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10min,12000rpm，4℃离心10min；弃上清，管壁可现白色沉淀，加0.5ml 75％乙醇(用RNase-free水配置)洗涤，颠倒混匀，10000rpm，4℃离心5min；重复一次，低温干燥，使乙醇挥发；加50μl的RNase-free水溶解沉淀，加入DNase I消化基因组DNA，重复氯仿抽提、异丙醇沉淀至加水溶解过程(步骤同前)，置于-80℃保存。

2、水稻cDNA合成以水稻RNA为模板，利用逆转录酶M-MLV逆转录，具体方法如下：(1)冰上配置RNA 5-10μl，Olig(dT)2μl，RNase-free H₂O至14.5μl混匀。(2)70℃，5分钟，立刻置于冰上，打开二级结构。(3)加入反转录酶等：5×M-MLV buffer5μl，RNaseinhibitor0.5μl，10mM dNTP 4μl，M-MLV(Promega)1μl混匀。(4)42℃，延伸90分钟。70℃，15分钟。获得水稻的cDNA，分装保存于-40℃。注：所有实验用品均为RNase-free。

3.水稻β-淀粉酶BA2扩增

通过NCBI数据库获得水稻的β-淀粉酶BA2BA2(Os10g0465700)基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)，其氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO:6所示)。根据序列设计引物(如序列表中SEQ ID NO:7-8)，引物设计使用Gibson Assembly方法，其中上下游引物5’端均有15个左右核苷酸序列与载体相应连接位置重复，以便Gibson Assembly连接。以水稻水稻cDNA为模板通过PCR扩增获得，扩增体系：2*PCR buffer for KOD FX 25μ1，dNTPs(2mM)10μ1，正/反向引物:(10μM)1.25μl/1.25μl，模板1μl，KOD FX聚合酶0.5μ1，ddH₂O至50μl。PCR程序:预变性94℃3min，变性94℃30s，退火55-65℃40s，延伸68℃1min20s，35个循环，延伸68℃10min。

实施例2花粉败育基因植物双元表达载体DX2182-BA2构建

构建流程见图1，将实施例1扩增产物，即引物SEQ ID NO:7-8扩增PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳回收1700bp左右产物，插入DX2182(已公开于中国专利CN106434673A，发明名称：一种植物花药特异性启动子PCHF15及其应用)经MluI和SacI的线性酶切载体中。其中DX2182载体已包含了pG47优化型启动子和终止子，并分别位于MluI和SacI酶切位点的两侧，因此MluI和SacI酶切载体DX2182，回收线性酶切载体，与实施例1扩增的PCR产物按一定的比例连接，最终构建获得包含BA2的花粉特异性的表达盒的双元载体。2X连接试剂盒连接败育基因到DX2182，10μl体系如下：β-淀粉酶BA2PCR产物(50ng)2.5μ1,酶切载体(100ng)2.5μ1,Ligation Mix 5μ1。连接程序：50℃60分钟。转化：取上述连接产物2μ1电击转化大肠杆菌感受态细胞，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，挑选阳性克隆测序，测序正确的重组载体命名为DX2182-BA2，其序列如SEQ ID NO:9所示。

实施例3 BA2转基因水稻创制

取-70℃保存的农杆菌EHA105于含Rif(25μg/ml)+链霉素(50μg/ml)的YEP平板划线，28℃培养。挑取单菌落接种于含上述抗生素的50ml YEP液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16h。取2ml菌液转接于100ml(含上述抗生素)YEP液体培养基中，28℃220rpm振荡培养至OD₆₀₀＝0.5。冰上预冷10分钟，5000rpm 10min(冷冻离心机预冷到4℃)。无菌去离子水洗2次(每次10ml)，10％甘油洗1次溶于3ml 10％甘油中。取100μl感受态细胞加1μl实施例2中得到的DX2182-BA2质粒，2.5KV电击转化。在含有卡那霉素、利福平和链霉素的YEP培养板上培养，挑选阳性克隆，用DX2182-BA2载体特异性引物SEQ ID NO:11-12PCR验证。

验证正确的克隆，通过农杆菌介导的遗传转化法侵染水稻中花11(Hiei Y OhtaS,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal 6:271-282)。经共培养、筛选、分化、生根等环节获取T0代转基因幼苗，提取DNA，经PCR验证的转基因阳性植株，自交结实获得T1代，取T1植株进行后续分析。其中DX2182-BA2载体含有潮霉素抗性基因，其序列如SEQ ID NO:10所示，可用潮霉素筛选转基因，获得抗性植株；同时还可筛选转基因后代种子，获得其中抗性植株。

实施例4 BA2转基因水稻花粉育性分析

配制碘化钾染色液(取2g KI溶于5-10mL蒸馏水中，然后加入1g I₂(用适量的无水乙醇溶解)，待全部溶解后，再加蒸馏水定容至300mL。贮于棕色瓶中备用，使用时按碘化钾：去离子水＝1:1的比例稀释成碘染工作液)。对BA2水稻转基因植株的成熟花粉进行染色镜检分析花粉粒育性，具体步骤如下：1、花粉采集：取充分成熟将要散粉的花药，剥除颖壳，取出花药，置于载玻片上。2、镜检：取约70μl的碘染工作液滴于花药上，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。凡被染成蓝黑色的花粉粒为可育花粉粒，呈浅黄色的为败育的花粉粒。

转基因植株的花粉粒经碘化钾染色分析表明可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，即约50％花粉可染成蓝黑色，表现为正常育性；约50％花粉不能染成蓝黑色，表现为败育花粉(如图2.BA2败育基因所示)。而野生型花粉均可染成蓝黑色，是完全可育的(如图2.WT所示)。表明水稻β-淀粉酶BA2能使水稻花粉粒中淀粉降解，使其在发育过程中能量供给不足，导致花粉败育。

实施例5 BA2转基因水稻自交种子分离筛选

根据遗传规律，若可育花粉：败育花粉符合1:1的分离比例，自交结实种子即是一半为非转基因种子，一半为转基因种子，因此利用潮霉素对BA2转基因水稻株系16-2、17-2的T1代种子进行筛选验证，方案如下：

取野生型对照中花11(ZH11)、转基因株系16-2和17-2(T1)种子，经次氯酸钠消毒后分别铺种于生根培养基(1/2MS培养基)和添加40mg/L潮霉素(Sigma)的生根培养基中进行筛选，14d后观察并统计存活率(如图3)。统计结果显示：在生根培养基中ZH11能正常生根发芽，存活率为96.50％，16-2和17-2虽能正常生根发芽，存活率比ZH11低；在潮霉素筛选下ZH11完全被抑制，而16-2株系自交种子部分可以正常生根发芽，存活率为40.50％，16-2株系与17-2株系类似，存活率为41.50％，分离比符合1:1(见表1)。

表1 BA2转基因水稻自交种子筛选分离比

实施例6转基因花粉逃逸率检测

为检测BA2导致的花粉败育效率，检测其转基因花粉是否逃逸，本实例通过BA2转基因水稻株系授粉给非转基因水稻材料，收获杂交种子，经潮霉素筛选检测(方法同实施例5)是否有杂交种子具备潮霉素抗性，若是，则有转基因花粉逃逸；若无，则表明BA2工作效率良好，可防止转基因逃逸。

转基因株系授粉给不育系1907(1907×16-2和1907×17-2)，分别获得59、48粒杂交种子，用潮霉素筛选杂交种子，14d后观察发现，杂交种子发芽势较强，有一部分长成苗，但继续筛选培养至28天左右时，幼苗逐渐枯黄死亡，但16-2和17-2自交种子中具备抗性的植株可存活并长成植株(如图4)。因此28d统计存活率显示：在生根培养基中ZH11能正常生根发芽，存活率96.50％，16-2和17-2也能正常生根发芽，存活率分别为84.50％、86.00％,1907×16-2和1907×17-2的杂交种子因杂交优势，发芽率(存活率)也较高；在潮霉素筛选下ZH11完全被抑制，而16-2自交种子存活率41.50％，17-2的存活率41.50％，基本分离比符合1:1(见表2)，而1907×16-2和1907×17-2的杂交种子均被抑制，无法存活。

表2转基因花粉逃逸率检测

为进一步检测杂交种子发芽幼苗为非转基因幼苗，随机选取部分杂交种幼苗，提取基因组DNA，利用3对特异性引物,进行PCR扩增鉴定是否存在转基因元件，结果表明杂交种子幼苗未能扩出转基因区段条带，与阴性对照一致(如图5)，进一步表明没有转基因元件逃逸。由此证明本发明的水稻β-淀粉酶BA2基因能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉败育，可有效阻止转基因作物通过花粉将转基因元件传播给其他作物品种。

综上所述，本发明中影响植物雄性生育力β-淀粉酶BA2来自水稻，为首次克隆，并且能够降解花粉粒中的淀粉，造成水稻转基因花粉不育，准确性高，效率好，有效阻止转基因作物花粉逃逸；可用于保持雄性不育植株的纯合隐性状态；同时省去了杂交制种过程中人工去雄的步骤，具备较高的实用价值。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 水稻β-淀粉酶BA2及其编码基因与应用

<130> KHP181115623.8

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1659

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccttga acttggctca gagcgccgcg gcggcagcgt gcttcgcgac cgccggtgat 60

gcgcggcgag ctgcttcggt ggtcgccatg ccgtcgtcgt cgtcgtcggc cacgacgagc 120

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gtggcggcgg cggcggcgag cagcaggagg aacggcgtgc cggtgttcgt gatgatgccg 240

ctggacacgg tgagcaagtg cgggagcgcg ctgaaccgga ggaaggcggt ggcggcgagc 300

ctggcggcgc tgaagagcgc cggcgtggag gggatcatgg tggacgtgtg gtggggcatc 360

gtggagagcg agggccccgg ccggtacaac ttcgacggct acgtggagct catggagatg 420

gcccgcaaga ccggcctcaa ggtccaggcc gtcatgtcct tccaccagtg cggcggcaac 480

gtcggcgact ccgtcaacat cccgctcccg aggtgggtgg tggaggagat ggagaaggac 540

aacgacctcg cctacaccga ccaatgggga cgccgcaact tcgagtacat ctccctcggc 600

tgcgacgcca tgcccgtctt caagggccgc acgcccgtcg agtgctacac cgacttcatg 660

cgcgccttcc gcgaccactt cgcctccttc ctcggcgaca ccatcgtcga aatccaagtc 720

ggcatgggcc ccgccggcga gcttcggtac ccgtcctacc cggagagcaa cggcacctgg 780

aggttccccg gcatcggcgc cttccaatgc aacgacaggt acatgcgtag cagcctgaag 840

gcggcggcgg aggcgagggg caagccggag tggggccacg gcgggccgac ggacgccggc 900

ggctacaaca actggccgga agacacggtg ttcttccgcg gcgactgcgg cgggtggagc 960

accgagtacg gcgagttctt cctgtcgtgg tattcgcaga tgctgctgga gcacggcgag 1020

cgcgtgctgt cgggcgcgac gtccgtgttc ggcgacggcg ccggcgccaa gatctcggtc 1080

aaggtggccg gcatccactg gcactacggc acgcggtcgc acgcgccgga gctcacggcg 1140

gggtactaca acacgcggca ccgcgacggc tacctcccga tcgcgcgcat gctggcgcgc 1200

cacggcgccg tgctcaactt cacctgcgtg gagatgcgcg accacgagca gccgcaggag 1260

gcgcagtgca tgcccgaggc gctcgtcagg caggtggccg ccgcggcgcg cgcggcgggc 1320

gtcgggctcg ccggggagaa cgcgctgccg cggtacgacg gcacggcgca cgaccaggtg 1380

gtcgccgccg ccgccgaccg cgcggcggag gaccggatgg tcgccttcac ctacctccgg 1440

atggggcccg acctcttcca cccggacaac tggcgccggt tcgtcgcctt cgtccgccgc 1500

atgtccgagt ctggctcgcc gcgggaggcc gccgagagcg ccgcgcacgg cgtcgcgcag 1560

gccaccggct cgctcgtgca cgaggccgcg gtcgcgctcc ggagctagca cggtcagacg 1620

ctcatataca ccgtcgcctc gaggtcggat tccgatgtg 1659

<210> 2

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctgtgtc tcacctcctc ttcctcctcc gcgcccgctc cgctccttcc ctctctcgct 60

gatcgaccga gcccgggaat cgcgggcggg ggtggcaatg ttcgcctgag cgtggtttct 120

tcgccgcgcc ggtcgtggcc tggaaaggtc aagaccaatt tctcagttcc tgcg 174

<210> 3

<211> 2737

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaccggaca ctgtctggtg gcataccaga cagtccggtg tgccagatca gggcaccctt 60

cggttccttt gctcctttgc ttttgaaccc taactttgat cgtttattgg tttgtgttga 120

acctttatgc acctgtggaa tatataatct agaacaaact agttagtcca atcatttgtg 180

ttgggcattc aaccaccaaa attatttata ggaaaaggtt aaaccttatt tccctttcaa 240

tctccccctt tttggtgatt gatgccaaca caaaccaaag aaaatatata agtgcagaat 300

tgaactagtt tgcataaggt aagtgcatag gttacttaga attaaatcaa tttatacttt 360

tacttgatat gcatggttgc tttcttttat tttaacattt tggaccacat ttgcaccact 420

tgttttgttt tttgcaaatc tttttggaaa ttctttttca aagtcttttg caaatagtca 480

aaggtatatg aataagattg taagaagcat tttcaagatt tgaaatttct ccccctgttt 540

caaatgcttt tcctttgact aaacaaaact ccccctgaat aaaattctcc tcttagcttt 600

caagagggtt ttaaatagat atcaattgga aatatattta gatgctaatt ttgaaaatat 660

accaattgaa aatcaacata ccaatttgaa attaaacata ccaatttaaa aaatttcaaa 720

aagtggtggt gcggtccttt tgctttgggc ttaatatttc tccccctttg gcattaatcg 780

ccaaaaacgg agactttgtg agccatttat actttctccc cattggtaaa tgaaatatga 840

gtgaaagatt ataccaaatt tggacagtga tgcggagtga cggcgaagga taaacgatac 900

cgttagagtg gagtggaagc cttgtcttcg ccgaagactc catttccctt tcaatctacg 960

acttagcata gaaatacact tgaaaacaca ttagtcgtag ccacgaaaga gatatgatca 1020

aaggtataca aatgagctat gtgtgtaatg tttcaatcaa agtttcgaga atcaagaata 1080

tttagctcat tcctaagttt gctaaaggtt ttatcatcta atggtttggt aaagatatcg 1140

actaattgtt ctttggtgct aacataagca atctcgatat cacccctttg ttggtgatcc 1200

ctcaaaaagt gataccgaat gtctatgtgc ttagtgcggc tgtgttcaac gggattatcc 1260

gccatgcaga tagcactctc attgtcacat aggagaggga ctttgctcaa tttgtagcca 1320

tagtccctaa ggttttgcct catccaaagt aattgcacac aacaatgtcc tgcggcaata 1380

tacttggctt cggcggtaga aagagctatt gagttttgtt tctttgaagt ccaagacacc 1440

agggatctcc ctagaaactg acaagtccct gatgtgctct tcctatcaat tttacaccct 1500

gcccaatcgg catctgaata tcctattaaa tcaaaggtgg atcccttggg gtaccaaaga 1560

ccaaatttag gagtgtaaac taaatatctc atgattcttt tcacggccct aaggtgaact 1620

tccttaggat cggcttggaa tcttgcacac atgcatatag aaagcatact atctggtcga 1680

gatgcacata aatagagtaa agatcctatc atcgaccggt ataccttttg gtctacggat 1740

ttacctcccg tgtcgaggtc gagatgccca ttagttccca tgggtgtcct gatgggcttg 1800

gcatccttca ttccaaactt gttgagtatg tcttgaatgt actttgtttg gctgatgaag 1860

gtgccatctt ggagttgctt gacttgaaat cctagaaaat atttcaactt ccccatcata 1920

gacatctcga atttcggaat catgatccta ctaaactctt cacaagtaga tttgttagta 1980

gacccaaata taatatcatc aacataaatt tggcatacaa acaaaacttt tgaaatggtt 2040

ttagtaaaga gagtaggatc ggctttactg actctgaagc cattagtgat aagaaaatct 2100

cttaggcatt cataccatgc tgttggggct tgcttgagcc cataaagcgc ctttgagagt 2160

ttataaacat ggttagggta ctcactatct tcaaagccga gaggttgctc aacatagacc 2220

tattcacccc atttgatcac ttttttggtc cttcaggatc taatagttat gtataattta 2280

gagtctcttg tttaatggcc agatatttct aattaatcta agaatttatg atatttttta 2340

attttttatc atgtctgatg agaattaaca taaaggctca attgggtcct gaattaataa 2400

tagagtgaaa attaatccag aggctctatt agaaccttca attagtaata ccaagatata 2460

tataagatag tagagtatag tttaaatgtt ggcattgttc attctttctt ttgttattta 2520

atttatgctt tccacggtgg ttagtggtta cttctgaagg gtccaaataa tgcatgaaga 2580

gtttgaggac aagaagtctg ccctaaaaat agcgatgcaa aggcatggtg tccaagccat 2640

acatatagcg cactaatttt atcagcagaa caatggtatt tataggtcct agtgcccagg 2700

caacaagaga cacgaataaa gcatcgatca cgacaag 2737

<210> 4

<211> 2038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gataatgaca gcctaggcgg aggtgcggta aagcttgccg aaaacatgca gaagagcaac 60

gacggcaatg aacccaatgc tcatgatgag gactgagttc ggggacatct tgcgcccagc 120

agcctcatcg gtgtagaact ggagcattgt gctggcaccg cctccaccag tgccactgct 180

ggtggttcta cgcctgcgca agcttgcagc agctgctgca ctccctctag ccggggcatc 240

tccattggcc accatcttgc tttatccctc tgcatgataa tatgagtttc aaatgtaagg 300

tttgcagcac taatattaca gaaaaccaac agaacaacag agtttcatcc aaagtcgtat 360

tgcatataca taggaagtgt taaaatatgt ctatcatttt ggaagatacg gtttatgctg 420

tcacacagca ttttggaagt gactatttta taagcacaga agtttcttca atgtggaata 480

tgtcaaaagg caaaataaga agcacagaag tttcttcaat gtggaatatg tcagaaggca 540

gaataaggta cacatcttgg aagtgtatga tagtactaca ccaataccag tgaagtttta 600

gttgtcacat ttgagtgcta ataaaaatat aaaaaagaaa tggttgctgt tgctcatgcc 660

tatatacatt cataatctat caaactaact gctcctggat gctgcataac tataactaaa 720

caagcttaag ttaaatttac cacagaaaaa gaaaaaatga caactagtcc cagaattctg 780

ctgaaaaatt ttggggctgt cctgggcttg gccaaacacc cattgacatg atgctgccca 840

agtgtaagaa ctgtaaaaca agtatagtgt ctgtgtatgt acagggatgg cagcatattc 900

attgctgcaa cacaagctac gctacatgaa accaatttct tacgctggaa tatgaacaaa 960

caacatggag gagagatttc gtaatagaat tttgagcaaa tatgttggta cggacaaaat 1020

gatcccccac aaaaatccgc agagaagatc atgagtgaca cgcgatatat gaggtaacac 1080

acgaacatct tatcaagaat tcagatccat tcccagatcc tgacaaagca ctagaactac 1140

aacagaaata cttcgataaa acaattcgat ttcccttcat gacacatcct aacatcacat 1200

caaacccccc gcagccaatc tgaattctga acagcaagat ctggaacaga agcggtaccc 1260

atcccagaat tctaaatcgg ccaaaccaaa caagcccgat ctaagacatc gattcaacat 1320

gaacgcgtac ggaatcaaag caggctaatc ggagagatgg cgaaaagagg atgattttcg 1380

cgcgcacctg atgaatctgc cctgcgccaa tcgctcgtgc tcccgtccca acttggtcac 1440

tcgtcttctc gcccgaaaat ctgagtgcgg aattcagaat tctctccgcg tctgaacccg 1500

cgcgctgata tctacccaac tggctggatt aacgggttcc gttcaagatc cgatatcaag 1560

tgacgtggtc ggcgcgatct gattggccgg agcgcgtctc cgcgcgtcga tctgagccgt 1620

ccgattcgtt gccgggtccc gatcgcgcgg cctggtgtga aacgggtggc gtcaccgcgt 1680

gcggcgtggc actgtgacgt ggcaacggtt atgcggttat gcacagtcat gggctggacc 1740

ttttggccca acatctgtgg actcgtggac cgggtttcgg cccttttatc cgctctacgg 1800

acgcagtcca cgtcagccga cgtgggtccc accacgaagg gcgtgcctcc ctctaaaaat 1860

tgccaatgac gataagagca aagacggacg ggaggggagg ggtccaaatt aaaactccaa 1920

aatccattcg aacagcgaag gaaatttgtt ggaaaatttt gagatttgga tttttgttct 1980

aggagagggg aaggttagaa gaagttgaga tcggtggaga actggagatc gaggggag 2038

<210> 5

<211> 1960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgtacgacg aggatgatat cctaacctct tcaaaataac aaagccttag aatttgatta 60

aacatacctt tgtatatgct tggtgtattt ccatgtttgt tttgtgcttc acaaaacagc 120

gaacatattt tattcacggg atataaaata tctacttgag tgtagtgata cattaatatc 180

ttaaaagaaa caaactttac aaacaactta ggacagttgt ctaagcaatt taagattttt 240

tttgacaaat cctattttta gaaacataaa gcaaataatc ataaaaaaca atccaataga 300

ttaattacaa aatcacataa gaccttattg gtttggagaa gattaaaaag gattggaggg 360

aattgatgga aaataattta acacaataat aagtgtaaat aaattgcttc caatccctcc 420

tttacgggga ttaactgaac atggtctaac tgaattgtca ctacagtcga ttggtattat 480

gagatgaaaa actgaacaat tgttgacacg tgcaatggca atatctctcc gagcatgatc 540

cgaatcccct gcagtttgaa ttgctaatgc tacagtcttt ctcggtagca cttgagcact 600

tagattaaaa acgaaacggt tcagatcagc aagtattgta gcatcaatat tttatttttt 660

agcttgtact atcacgttaa taccgtagag gttggttata gccctagaat tatgaataga 720

aggtgcagat ttctcctaat ttaatttact gtagcacctc tccatttcat actctaatgc 780

agaggatccc aatccgagca atacatgctt gatgaaacat gctggataca acacaaatag 840

gattgtgata tgattacgaa aagtggtatg gatttcgtga tgattgttgc aaagtaccac 900

tgccgaccat gtacgcaagg aagcgcgaga tgacgagggg caaaatgggg aaaccacact 960

ggaaactggc tgcgcggcgt agcccgagac caaagagcat ccatctccat ctccgagccc 1020

gacctcgcga acagcccaca cgtacgttac tgacgccata acgtccgagc cacccaccaa 1080

ctaaccaacc gacatgtggg ccacagccgt tgagccccac actccagtgt ccgtttacgt 1140

atcgcgtcca gggaggagag cacggatcgc aacggaaagt gcggcgtgca caaaaaactc 1200

cgtatccagc aactggcatg tgggccccac aggatggagg ccccacatgt cagttttttt 1260

ggggggtgtc tccgtctttt ctctatggtt tgaatgttct tgggcgtacg gctgtcacgt 1320

gtttccggcg gacgagtctt ttttcagcgg taggggtagt acggctgcca tgtgggaccc 1380

accaccgaaa accgtagtga ctctctctct ctctctctct ctccatgcaa aagaaaggaa 1440

agagaacagc tttcgcgatg ggacggttga ttctcctgct tgtctcgctc gaccgccgac 1500

gacgaagata cattgtactc ccgtctcact gccaggtggg cccggacgtc gtgtgcggtt 1560

ggcgcaacgc gcaacgattt gggcaacacg actaccacgc cggtttcgag gtttttgttg 1620

tagacgcagt ccatggaccg acgcgatcag tagccgtcca ttctgggcct ctaagattct 1680

cgaagcggtc gatcctgtgg actgggtcta cgctgaatct acggaaccaa ccgactaacg 1740

aggtaaccaa ctgtttactg gtctccatca agtttataac cgctcgcgtc gcgcccatct 1800

ccaccaatcc accaccgcca cgccacttca cccttgtttt ttttttcccc ttctcgcaaa 1860

gttcaaaccc cctcttcttc cctccctcct ctcctctcct cgcttccggg ttccgccgcg 1920

gcttcatccg atcgcccgcg ccaagaactc gatcctcatg 1960

<210> 6

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ala Leu Asn Leu Ala Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Cys Phe Ala

1 5 10 15

Thr Ala Gly Asp Ala Arg Arg Ala Ala Ser Val Val Ala Met Pro Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Ala Thr Thr Ser Leu Arg Met Lys Arg Gln Ala Ala

35 40 45

Cys Glu Pro Val Ala Cys Arg Ala Val Ala Arg His Val Ala Ala Ala

50 55 60

Ala Ala Ser Ser Arg Arg Asn Gly Val Pro Val Phe Val Met Met Pro

65 70 75 80

Leu Asp Thr Val Ser Lys Cys Gly Ser Ala Leu Asn Arg Arg Lys Ala

85 90 95

Val Ala Ala Ser Leu Ala Ala Leu Lys Ser Ala Gly Val Glu Gly Ile

100 105 110

Met Val Asp Val Trp Trp Gly Ile Val Glu Ser Glu Gly Pro Gly Arg

115 120 125

Tyr Asn Phe Asp Gly Tyr Val Glu Leu Met Glu Met Ala Arg Lys Thr

130 135 140

Gly Leu Lys Val Gln Ala Val Met Ser Phe His Gln Cys Gly Gly Asn

145 150 155 160

Val Gly Asp Ser Val Asn Ile Pro Leu Pro Arg Trp Val Val Glu Glu

165 170 175

Met Glu Lys Asp Asn Asp Leu Ala Tyr Thr Asp Gln Trp Gly Arg Arg

180 185 190

Asn Phe Glu Tyr Ile Ser Leu Gly Cys Asp Ala Met Pro Val Phe Lys

195 200 205

Gly Arg Thr Pro Val Glu Cys Tyr Thr Asp Phe Met Arg Ala Phe Arg

210 215 220

Asp His Phe Ala Ser Phe Leu Gly Asp Thr Ile Val Glu Ile Gln Val

225 230 235 240

Gly Met Gly Pro Ala Gly Glu Leu Arg Tyr Pro Ser Tyr Pro Glu Ser

245 250 255

Asn Gly Thr Trp Arg Phe Pro Gly Ile Gly Ala Phe Gln Cys Asn Asp

260 265 270

Arg Tyr Met Arg Ser Ser Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Arg Gly Lys

275 280 285

Pro Glu Trp Gly His Gly Gly Pro Thr Asp Ala Gly Gly Tyr Asn Asn

290 295 300

Trp Pro Glu Asp Thr Val Phe Phe Arg Gly Asp Cys Gly Gly Trp Ser

305 310 315 320

Thr Glu Tyr Gly Glu Phe Phe Leu Ser Trp Tyr Ser Gln Met Leu Leu

325 330 335

Glu His Gly Glu Arg Val Leu Ser Gly Ala Thr Ser Val Phe Gly Asp

340 345 350

Gly Ala Gly Ala Lys Ile Ser Val Lys Val Ala Gly Ile His Trp His

355 360 365

Tyr Gly Thr Arg Ser His Ala Pro Glu Leu Thr Ala Gly Tyr Tyr Asn

370 375 380

Thr Arg His Arg Asp Gly Tyr Leu Pro Ile Ala Arg Met Leu Ala Arg

385 390 395 400

His Gly Ala Val Leu Asn Phe Thr Cys Val Glu Met Arg Asp His Glu

405 410 415

Gln Pro Gln Glu Ala Gln Cys Met Pro Glu Ala Leu Val Arg Gln Val

420 425 430

Ala Ala Ala Ala Arg Ala Ala Gly Val Gly Leu Ala Gly Glu Asn Ala

435 440 445

Leu Pro Arg Tyr Asp Gly Thr Ala His Asp Gln Val Val Ala Ala Ala

450 455 460

Ala Asp Arg Ala Ala Glu Asp Arg Met Val Ala Phe Thr Tyr Leu Arg

465 470 475 480

Met Gly Pro Asp Leu Phe His Pro Asp Asn Trp Arg Arg Phe Val Ala

485 490 495

Phe Val Arg Arg Met Ser Glu Ser Gly Ser Pro Arg Glu Ala Ala Glu

500 505 510

Ser Ala Ala His Gly Val Ala Gln Ala Thr Gly Ser Leu Val His Glu

515 520 525

Ala Ala Val Ala Leu Arg Ser

530 535

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atttctcagt tcctgcgatg gccttgaact tggctcagag c 41

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggagagttg ttgagctcac atcggaatcc gacctcgag 39

<210> 9

<211> 15738

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacatcggaa tccgacctcg aggcgacggt gtatatgagc gtctgaccgt gctagctccg 60

gagcgcgacc gcggcctcgt gcacgagcga gccggtggcc tgcgcgacgc cgtgcgcggc 120

gctctcggcg gcctcccgcg gcgagccaga ctcggacatg cggcggacga aggcgacgaa 180

ccggcgccag ttgtccgggt ggaagaggtc gggccccatc cggaggtagg tgaaggcgac 240

catccggtcc tccgccgcgc ggtcggcggc ggcggcgacc acctggtcgt gcgccgtgcc 300

gtcgtaccgc ggcagcgcgt tctccccggc gagcccgacg cccgccgcgc gcgccgcggc 360

ggccacctgc ctgacgagcg cctcgggcat gcactgcgcc tcctgcggct gctcgtggtc 420

gcgcatctcc acgcaggtga agttgagcac ggcgccgtgg cgcgccagca tgcgcgcgat 480

cgggaggtag ccgtcgcggt gccgcgtgtt gtagtacccc gccgtgagct ccggcgcgtg 540

cgaccgcgtg ccgtagtgcc agtggatgcc ggccaccttg accgagatct tggcgccggc 600

gccgtcgccg aacacggacg tcgcgcccga cagcacgcgc tcgccgtgct ccagcagcat 660

ctgcgaatac cacgacagga agaactcgcc gtactcggtg ctccacccgc cgcagtcgcc 720

gcggaagaac accgtgtctt ccggccagtt gttgtagccg ccggcgtccg tcggcccgcc 780

gtggccccac tccggcttgc ccctcgcctc cgccgccgcc ttcaggctgc tacgcatgta 840

cctgtcgttg cattggaagg cgccgatgcc ggggaacctc caggtgccgt tgctctccgg 900

gtaggacggg taccgaagct cgccggcggg gcccatgccg acttggattt cgacgatggt 960

gtcgccgagg aaggaggcga agtggtcgcg gaaggcgcgc atgaagtcgg tgtagcactc 1020

gacgggcgtg cggcccttga agacgggcat ggcgtcgcag ccgagggaga tgtactcgaa 1080

gttgcggcgt ccccattggt cggtgtaggc gaggtcgttg tccttctcca tctcctccac 1140

cacccacctc gggagcggga tgttgacgga gtcgccgacg ttgccgccgc actggtggaa 1200

ggacatgacg gcctggacct tgaggccggt cttgcgggcc atctccatga gctccacgta 1260

gccgtcgaag ttgtaccggc cggggccctc gctctccacg atgccccacc acacgtccac 1320

catgatcccc tccacgccgg cgctcttcag cgccgccagg ctcgccgcca ccgccttcct 1380

ccggttcagc gcgctcccgc acttgctcac cgtgtccagc ggcatcatca cgaacaccgg 1440

cacgccgttc ctcctgctgc tcgccgccgc cgccgccacg tgcctggcca ccgcccggca 1500

cgccaccggc tcgcacgccg cctgcctctt catcctcagg ctcgtcgtgg ccgacgacga 1560

cgacgacggc atggcgacca ccgaagcagc tcgccgcgca tcaccggcgg tcgcgaagca 1620

cgctgccgcc gcggcgctct gagccaagtt caaggccatc gcaggaactg agaaattggt 1680

cttgaccttt ccaggccacg accggcgcgg cgaagaaacc acgctcaggc gaacattgcc 1740

acccccgccc gcgattcccg ggctcggtcg atcagcgaga gagggaagga gcggagcggg 1800

cgcggaggag gaagaggagg tgagacacag catcttgtcg tgatcgatgc tttattcgtg 1860

tctcttgttg cctgggcact aggacctata aataccattg ttctgctgat aaaattagtg 1920

cgctatatgt atggcttgga caccatgcct ttgcatcgct atttttaggg cagacttctt 1980

gtcctcaaac tcttcatgca ttatttggac ccttcagaag taaccactaa ccaccgtgga 2040

aagcataaat taaataacaa aagaaagaat gaacaatgcc aacatttaaa ctatactcta 2100

ctatcttata tatatcttgg tattactaat tgaaggttct aatagagcct ctggattaat 2160

tttcactcta ttattaattc aggacccaat tgagccttta tgttaattct catcagacat 2220

gataaaaaat taaaaaatat cataaattct tagattaatt agaaatatct ggccattaaa 2280

caagagactc taaattatac ataactatta gatcctgaag gaccaaaaaa gtgatcaaat 2340

ggggtgaata ggtctatgtt gagcaacctc tcggctttga agatagtgag taccctaacc 2400

atgtttataa actctcaaag gcgctttatg ggctcaagca agccccaaca gcatggtatg 2460

aatgcctaag agattttctt atcactaatg gcttcagagt cagtaaagcc gatcctactc 2520

tctttactaa aaccatttca aaagttttgt ttgtatgcca aatttatgtt gatgatatta 2580

tatttgggtc tactaacaaa tctacttgtg aagagtttag taggatcatg attccgaaat 2640

tcgagatgtc tatgatgggg aagttgaaat attttctagg atttcaagtc aagcaactcc 2700

aagatggcac cttcatcagc caaacaaagt acattcaaga catactcaac aagtttggaa 2760

tgaaggatgc caagcccatc aggacaccca tgggaactaa tgggcatctc gacctcgaca 2820

cgggaggtaa atccgtagac caaaaggtat accggtcgat gataggatct ttactctatt 2880

tatgtgcatc tcgaccagat agtatgcttt ctatatgcat gtgtgcaaga ttccaagccg 2940

atcctaagga agttcacctt agggccgtga aaagaatcat gagatattta gtttacactc 3000

ctaaatttgg tctttggtac cccaagggat ccacctttga tttaatagga tattcagatg 3060

ccgattgggc agggtgtaaa attgatagga agagcacatc agggacttgt cagtttctag 3120

ggagatccct ggtgtcttgg acttcaaaga aacaaaactc aatagctctt tctaccgccg 3180

aagccaagta tattgccgca ggacattgtt gtgtgcaatt actttggatg aggcaaaacc 3240

ttagggacta tggctacaaa ttgagcaaag tccctctcct atgtgacaat gagagtgcta 3300

tctgcatggc ggataatccc gttgaacaca gccgcactaa gcacatagac attcggtatc 3360

actttttgag ggatcaccaa caaaggggtg atatcgagat tgcttatgtt agcaccaaag 3420

aacaattagt cgatatcttt accaaaccat tagatgataa aacctttagc aaacttagga 3480

atgagctaaa tattcttgat tctcgaaact ttgattgaaa cattacacac atagctcatt 3540

tgtatacctt tgatcatatc tctttcgtgg ctacgactaa tgtgttttca agtgtatttc 3600

tatgctaagt cgtagattga aagggaaatg gagtcttcgg cgaagacaag gcttccactc 3660

cactctaacg gtatcgttta tccttcgccg tcactccgca tcactgtcca aatttggtat 3720

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accaccactt tttgaaattt tttaaattgg tatgtttaat ttcaaattgg tatgttgatt 3900

ttcaattggt atattttcaa aattagcatc taaatatatt tccaattgat atctatttaa 3960

aaccctcttg aaagctaaga ggagaatttt attcaggggg agttttgttt agtcaaagga 4020

aaagcatttg aaacaggggg agaaatttca aatcttgaaa atgcttctta caatcttatt 4080

catatacctt tgactatttg caaaagactt tgaaaaagaa tttccaaaaa gatttgcaaa 4140

aaacaaaaca agtggtgcaa atgtggtcca aaatgttaaa ataaaagaaa gcaaccatgc 4200

atatcaagta aaagtataaa ttgatttaat tctaagtaac ctatgcactt accttatgca 4260

aactagttca attctgcact tatatatttt ctttggtttg tgttggcatc aatcaccaaa 4320

aagggggaga ttgaaaggga aataaggttt aaccttttcc tataaataat tttggtggtt 4380

gaatgcccaa cacaaatgat tggactaact agtttgttct agattatata ttccacaggt 4440

gcataaaggt tcaacacaaa ccaataaacg atcaaagtta gggttcaaaa gcaaaggagc 4500

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cagtgtgttc tcaatgagcc ttgaatgtta tcacccagga taagaaaccc ttaagcaatg 5040

aaacatgcaa gcgtttaatg tgcaaagttg gcattctcca cgacataatg caaaagaaga 5100

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gatgtgtaca taaaactaca gagctatatg tcatgttgcg aaaagaggag agcttataag 5340

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gatataatct ttaacatcat ccatgtcata ttgcaaaaga aagaaagaga gaacaataca 5640

aatgatgtgt caattacaca tccatcatta tccatccacc ttccgtgtac cacacttcat 5700

atatcatgag tcacttcatg tctggacatt aacaaactct atcttaacat tcaaatgcat 5760

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tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataacgga tatttaaaag 7020

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catggtgttg accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg 7680

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atcgcggccg ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa 8100

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aggttatcgc tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc 8340

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gcagtgcccg cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg 8460

accgcccgac gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg 8520

acggagcgcc ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc 8580

tgattccggt gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg 8640

ttaagcagcg cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg 8700

cgatcaaagg cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc 8760

ccattcttga gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca 8820

caaccgttct tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg 8880

ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac 8940

aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag 9000

cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac 9060

caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata 9120

catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg 9180

ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca 9240

tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca 9300

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gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc 9420

gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct 9480

gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag 9540

ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc 9600

cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga 9660

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gaatccatga accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca 9840

cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac 9900

ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag 9960

gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag 10020

atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg 10080

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aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat 10320

ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc 10380

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gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga 13320

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ttgatagaag tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca 13440

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caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc gctaaactcc ccaatgtcaa 14340

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cagcgtgtcc tctccaaatg aaatgaactt ccttatatag aggaaggtct tgcgaaggat 14700

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aagacgtggt tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt 14820

tgggaccact gtcggcagag gcatcttgaa cgatagcctt tcctttatcg caatgatggc 14880

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tgttatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga 15120

tgctcctcgt gggtgggggt ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttgaacga 15180

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ttttgatgaa gtgacagata gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccc gatattaccc 15300

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agtagacgag agtgtcgtgc tccaccatgt tgggcccggc gcgccgaatt cccgatctag 15420

taacatagat gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc 15480

tatcgcgtat taaatgtata attgcgggac tctaatcata aaaacccatc tcataaataa 15540

cgtcatgcat tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat 15600

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt 60

ctctctctac aaatctatct ctctcgagct ttcgcagatc cgggggggca atgagatatg 120

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ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt 300

tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg 360

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<211> 21

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<400> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

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<212> DNA

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<212> DNA

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggcatcatc acgaacacc 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tgctttccac ggtggttagt 20

Claims (10)

1.水稻β-淀粉酶BA2在导致植物花粉败育中的应用，所述水稻β-淀粉酶BA2的氨基酸序列为：

(a)由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO.6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.6衍生的且保持SEQ ID NO.6所示的蛋白功能的蛋白。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻β-淀粉酶BA2的基因具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

3.水稻β-淀粉酶BA2或其编码基因在制备花粉败育转基因植株中的应用，所述水稻β-淀粉酶BA2的氨基酸序列为：

(a)由SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO.6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.6衍生的且保持SEQ ID NO.6所示的蛋白功能的蛋白；

水稻β-淀粉酶BA2的编码基因具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

4.含有水稻β-淀粉酶BA2基因的生物材料在制备花粉败育转基因植株中的应用，所述水稻β-淀粉酶BA2基因具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

所述生物材料为重组表达载体、表达盒、重组菌或宿主细胞。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的生物材料含有转导肽和雄性配子优先型启动子。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述转导肽为SBE信号肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述雄性配子优先型启动子为PG47、PC32、PCHF15，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、4、5所示。

7.一种调控植物花粉发育的方法，其特征在于，使植物表达水稻β-淀粉酶BA2基因，该基因的核苷酸序列为：

1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的调控是降解植物花粉中淀粉或诱导植物雄性不育。

9.一种利用水稻β-淀粉酶BA2降解植物花粉中淀粉，从而阻止外源转基因成分扩散的方法，其特征在于，将含有水稻β-淀粉酶BA2基因的表达盒导入植物中获得转基因花粉败育的转基因植株，使植株中转基因花粉无法正常授粉，从而阻止植物花粉中外源基因扩散，

所述的水稻β-淀粉酶BA2基因的核苷酸序列为：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

10.利用含有水稻β-淀粉酶BA2基因的转基因植株生产非转基因种子的方法，其特征在于，将含有水稻β-淀粉酶BA2基因的转基因植株作为杂交作物中保持系授粉给植物雄性不育系，不育系结实收获种子，该种子为非转基因种子，实现不育系繁育或杂交种制种；

所述水稻β-淀粉酶BA2基因具有：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。