CN109738401A

CN109738401A - 一种新型病毒分子印迹荧光传感器的制备及应用

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Publication number: CN109738401A
Application number: CN201811607134.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡昌群; 罗谅晖; 冯文宝; 陈小明
Original assignee: Xiangtan University
Current assignee: Xiangtan University
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109738401B

Abstract

本发明将金属有机骨架作为传感器的载体材料，金属螯合剂为功能单体，通过金属螯合作用在模板分子与功能单体之间形成六元环，制备了一种用于检测病毒的分子印迹荧光传感器，并通过钝化作用提高了传感器对模板病毒的特异性识别能力。金属有机骨架具有较大的比表面积，可提供更多的印迹位点，从而提高传感器的响应灵敏度；通过钝化作用可降低非特异性吸附，因此提高了传感器对模板分子的选择性；金属配位作用既能减少共价键力对模板洗脱时的妨碍，同时相对于非共价键力，其能更有效地固定模板分子；荧光分析法具有高灵敏度、选择性较强、操作方便等优点。因此，综合以上几点优势，相较于其它的分析方法或传感器而言，本发明构建的分子印迹荧光传感器对模板分子的选择性好，检测灵敏度高，在生物传感及病毒的检测与预防方面有着重要的实际应用价值及意义。

Description

一种新型病毒分子印迹荧光传感器的制备及应用

技术领域

本发明属于分析化学检测技术领域，具体涉及一种新型病毒分子印迹荧光传感器的制备及应用。

背景技术

非特异性结合是分离和检测领域中经常遇到的问题，该现象的存在不利于目标分子的特异性识别与检测。多年来研究人员发展了多种策略解决该问题并取得了一定的成功。这些成功的案例包括有双功能链和自组装单层策略(SAM) [Mrksich M.,Chem.Soc.Rev.,2000,29,267-273；Ostuni E.,Chapman R.G., Holmlin R.E.,TakayamaS.,Whitesides G.M.,Langmuir,2001,17,5605-5620.]、聚乙二醇化策略[Kannan B.,Castelino K.,Chen,F.F.,MajumdarA.,Biosens.Bioelectron., 2006,21,1960-1967.]或钝化策略(即通过强附着性蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，吐温20，聚乙二醇(PEG)，酪蛋白，乳蛋白等进行预吸附饱和[Gast M.,Kahner S., Sobek H.,Walther P.,MizaikoffB.,Analytical Chemistry,2018,9.]等。在钝化策略中，由于封闭剂BSA价格便宜，空间位阻小，得到了广泛的使用。然而，其应用于荧光分析法检测目标物时，虽能起到一定的抗非特异性吸附效果，但BSA本身的荧光会对最终的结果造成一定的干扰，导致结果不准确。PEG比BSA更加经济易得，且其本身不具有荧光，可避免上述干扰问题。因此，本发明以PEG为封闭剂，在印迹粒子表面预吸附饱和，从而提高了粒子对模板分子的选择性，同时又避免了钝化剂对荧光检测的干扰。

另外，对于传统的分子印迹技术而言，模板和功能单体之间的作用力主要有共价键作用力和非共价键作用力两种形式。共价键作用力太强，从而使得模板分子的洗脱变得困难；而非共价键作用力较弱，对模板分子的吸附作用不强，因此对高效率形成印迹位点的贡献有限。金属配位作用是一种较强的分子间作用力，其能有效的固定模板分子，同时对洗脱模板分子的妨碍作用较小。综合考虑作用力强度，特异性和方向性三方面的因素，以金属配位作用为模板分子与功能单体之间的作用力形式将有望对印迹效果产生积极的影响，该策略在病毒分子印迹技术方面的应用尚未见报道。

最后，考虑到病毒等大分子物质具有较大的分子粒径，采用一般的载体时 (如常见的有SiO₂，Fe₃O₄等)能留下的印迹位点很少，因此印迹效果并不是很理想。相对于上述载体，金属有机骨架(MOFs)具有更大的比表面积，以其作为印迹载体，有助于提高印迹因子和灵敏度，这对于大分子物质的定量检测而言具有重要的意义。因此，本发明采用MOFs为病毒分子印迹的载体材料，获得了理想的结果。

荧光分析法是一种高灵敏度、高选择性的分析方法，因此，本发明采用MOFs 材料为印迹载体、金属配位作用为模板病毒分子与功能单体之间的作用力形式，并在洗脱模板分子之后，加入PEG为钝化剂对印迹粒子表面预吸附饱和，得到了表面钝化的具有特异性识别位点的病毒分子印迹材料，并将其构建为用于特异性识别模板病毒的分子印迹荧光传感器。结果表明，本发明构建的传感器具有高选择性、高灵敏度、低检测限等优点，对于病毒的特异性识别与分析检测具有重要的意义和实际应用价值，且这一理念也可推广至其它物质的检测，具有潜在的广泛应用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的病毒分子印迹荧光传感器的制备方法，并将所述传感器应用于病毒分子的特异性识别与检测。

本发明的目的通过如下技术方案实现。

一种新型的病毒分子印迹荧光传感器的制备及应用，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：

(1)基于金属有机骨架和金属配位作用的病毒分子印迹聚合物的制备：合成 MIL-101后，在其表面接枝C＝C以连接丙烯酸锌，并通过金属配位作用在丙烯酸锌与病毒之间形成含锌的六元环配位结构，聚合完成后洗脱模板分子；

(2)通过钝化作用降低非特异性结合作用：洗脱模板后，加入封闭剂PEG吸附饱和，由于其对非印迹位点的钝化作用，从而提高了印迹粒子对模板分子的特异性识别能力；

(3)病毒分子印迹荧光传感器的制备及应用：将模板分子与印迹聚合物在优化的实验条件下吸附一段时间后，取其混合物于比色皿中，在激发波长为290nm，发射波长为340nm，狭缝为3.0nm-5.0nm下，采用RF-5301PC荧光分光光度计测其荧光强度，构建一种新型的用于检测病毒的分子印迹荧光传感器。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)以PEG为封闭剂，可提高印迹粒子对模板分子的特异性识别能力；

(2)以金属有机骨架材料作为病毒分子印迹的载体材料。金属有机骨架材料表面易于修饰，比表面积大，可提供更多的结合位点；且其热稳定性能良好，有利于长期保存使用。

(3)以丙烯酸锌为功能单体，通过金属螯合作用与病毒分子之间形成六元环，既能有利于模板分子的固定，又不妨碍模板分子的洗脱；

(4)实验结果表明，所述病毒分子印迹荧光传感器对目标分子具有高的选择性和灵敏度，印迹效果令人满意；

(5)所述传感器具有应用于其它分子检测的潜在可能性，且检测过程对操作人员的专业要求不高，具有重要的实际应用价值。

附图说明

[图1]所述病毒分子印迹荧光传感器的制备流程图(A)及金属配位作用的示意图(B)。

[图2]MIL-101@SiO₂(a)，MIL-101@SiO₂C＝C(b)，JVIPs(c)及NIPs(d)粒子的红外光谱图。

[图3]MIL-101(a)，MIL-101@SiO₂(b)MIL-101@SiO₂C＝C(c)及JVIPs(d) 粒子的X-射线衍射图。

[图4]MIL-101(a)，MIL-101@SiO₂(b)，JVIPs(c)及NIPs(d)粒子的SEM 图。

[图5]病毒分子印迹荧光传感器对不同浓度JEV的响应图：

[图6]病毒分子印迹荧光传感器对不同病毒的检测图：(a)加入钝化剂 PEG；(b)未加钝化剂。

[图7]病毒分子印迹荧光传感器用于加标回收JEV。

具体实施方案

在此，将结合附图及实施例，对本发明的具体实施方案作进一步的详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的应用范围及扩展。

实施例1：一种新型的病毒分子印迹荧光传感器的制备方法

(1)金属有机骨架MIL-101的制备：将Cr(NO₃)₃·9H₂O(2.00g)，对苯二甲酸 (TPA，0.82g)与乙酸钠溶液混合，磁力搅拌30min后，将溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中并置于200℃的恒温鼓风干燥炉中。12h后，将样品用超纯水充分洗涤并过滤，然后于50℃的恒温干燥箱中干燥6h。最后，通过热水浴和热乙醇纯化获得MIL-101，随后加入30mMNH₄F并继续在60℃加热3h。最后通过离心收集样品并在50℃下干燥12h。

(2)乙烯基化MIL-101(MIL-101@C＝C)的制备：将75mL无水乙醇，15mL 超纯水和0.1g MIL-101充分混合20min，然后在搅拌下加入2mL氨水和4mL TEOS，混合物在室温下反应8h.最后，通过离心收集样品并用水和乙醇冲洗，然后在60℃下真空干燥过夜即得MIL-101@SiO₂。

将0.1g MIL-101@SiO₂分散在75mL无水乙醇中，并在搅拌下滴加6mL MPS。然后在室温下进行反应24h。最后，通过离心收集所获得MIL-101@C＝C 样品，用甲醇洗涤并收集，然后置于60℃的真空烘箱中过夜。

(3)MIL-101@MIPs(JVIPs)粒子的制备：将0.1g MIL-101@C＝C,0.046g丙烯酸锌和0.02g模板(JEV)溶解在5mL DMF中,并在65℃下搅拌40min进行预组装。之后加入100μLEGDMA并通20min氮气。然后加入5mL含有30mg AIBN的DMF以引发聚合。在氮气保护下聚合5h后，用甲醇和乙酸(v/v＝9:1)洗脱模板至检测不到模板的存在。根据相同的方法制备非印迹聚合物(NIP)，但不添加模板。

(4)钝化作用及所述病毒分子印迹荧光传感器(JVIPs传感器)的制备：将 JVIPs粒子分散在PBS稀释液中至终浓度为19μg/mL。随后，加入77μgPEG，待吸附饱和后，再加入JEV混合，并用PBS缓冲液将溶液体积调节至1000μL，并在恒温下振荡一段时间。然后取一定量反应液于比色皿中，采用RF-5301PC 荧光分光光度计测其荧光，构建成一种检测病毒的分子印迹荧光传感器。检测条件为：激发波长：290nm，发射波长：340nm，激发狭缝：3.0nm，发射狭缝： 5.0nm。

实施例2：所述JVIPs荧光传感器及中间产物的性能、形貌和结构表征。

利用傅里叶变换红外光谱仪、X-射线衍射仪、扫描电镜对制备的所有材料进行了结构和形貌的表征。图2为MIL-101@SiO₂(a)，MIL-101@SiO₂C＝C(b)， JVIPs(c)及NIPs(d)粒子的红外光谱图。500cm^-1处的吸收峰归因于MIL-101的 Cr-O，在3400cm^-1处的吸收是由材料吸附的水产生的。在1090cm^-1和800cm^-1处的吸收峰归因于Si-O-Si的不对称伸缩振动和Si-O的伸缩振动。丙烯酸锌中的 C＝O和C-H(-CH₃)的吸收峰分别出现在1716cm^-1和2980cm^-1处。对比(c)和 (d),可以观察到印迹聚合物(洗脱模板之后)和非印迹聚合物的吸收带几乎相同，表明印迹过程对颗粒的组成几乎没有影响。

通过X-射线衍射(图3)进一步分析MIL-101和JVIPs粒子。如图3a所示， MIL-101的主要特征峰出现在2θ2°～20°。图3b中，MIL-101的特征峰强度显著减弱，这是由于在其表面包覆了SiO₂，图3c与图3b的情况基本相同，这是因为图3c只是在MIL-101@SiO₂外面接枝了双键，其厚度并不足以造成两者之间很大的差距。而图3d中MIL-101的特征峰消失，这是因为在MIL-101@SiO₂表面包覆了一层印迹层，再次将MIL-101包覆在里面，因此其表面的晶体结构基本被完全包住。

图4为MIL-101(a)，MIL-101@SiO₂(b)，JVIPs(c)及NIPs(d)粒子的SEM 图。从图4a中可以看出，MIL-101为粒径约200nm的四面体，且其表面光滑。包覆SiO₂后(图4b)，颗粒尺寸约为250nm，且仍呈八面体形态，但粘附性很严重。从图4c中可以看出，在MIL-101@SiO₂表面印迹之后(在除去模板之前)，对粒子的形状几乎没有影响，仍然显示出四面体结构，而粒径增大至约为300nm，印迹层厚度约为25nm。

实施例3：所述JVIPs荧光传感器的应用

本实施例的实验条件为：JVIP的用量为19μg/mL，pH为7.5，吸附时间为 20min,温度为37℃。具体实施方案为：取特定浓度的JEV和19μg/mL的JVIP 于PB缓冲液，将整个体系的pH调节为7.5，在37℃下振荡吸附20min后，测其荧光强度。

(1)JVIPs荧光传感器对不同浓度JEV的检测分析

按上述实验步骤，以本发明所述的JVIPs传感器对不同浓度的JEV进行检测分析，结果如图5所示，所制备的传感器对JEV的分析浓度范围为0.05～1.4nM，检测限为0.1pM，结果显示线性范围较宽，检测限较低，总体效果良好。

(2)JVIPs荧光传感器对JEV的选择性吸附

本实施例选择了浓度均为1.0nM的JEV，HAV，RV和LV作为目标物来考察JVIPs荧光传感器对JEV的吸附与检测能力。实验按上述步骤进行，重复三次，取平均值。实验结果如图6所示。可以看出，本发明所述的JVIPs荧光传感器对JEV的吸附能力明显优于对其它病毒的吸附能力，另外，使用PEG为钝化剂(图6a)之后，传感器对JEV的选择性更高，且印迹因子从1.5提高到了4.3，这证明本发明所述的分子印迹荧光传感器对目标物的选择性效果理想。

(3)JVIPs荧光传感器对JEV的加标回收

采用了加标回收的方法来评估前面所述的方法对实际样品的分析能力。取三份用磷酸盐缓冲溶液稀释的人血清样品(20mM，pH＝7.5)，分别向其中加入浓度为0.08nM，0.5nM，1.2nM的JEV，用本发明制备的JVIPs荧光传感器进行检测分析。实验结果如图7所示，加标回收率为92.52％～114.35％之间。

Claims

1.一种新型的病毒分子印迹荧光传感器的制备及应用,其特征在于：采用MIL-101为印迹时的载体材料，金属螯合剂为功能单体，通过金属配位作用在模板分子与功能单体之间形成六元环。洗脱模板后，加入钝化剂可降低印迹粒子的非特异性结合，并将其构建为一种新型的荧光传感器用于目标病毒的检测。具体包括以下几点：

1)以金属有机骨架为载体、金属螯合剂为功能单体的印迹聚合物的制备。

2)通过钝化作用提高印迹聚合物对模板分子的特异性识别能力。

3)所述病毒分子印迹荧光传感器的制备。

4)所述病毒分子印迹荧光传感器的应用。

2.根据权利要求1所述的印迹聚合物的制备，其特征在于，包括以下步骤：

1)首先合成MIL-101，并将其作为印迹时的载体材料；

2)将1)所得的MIL-101乙烯基化；

3)在2)的基础上，加入功能单体、交联剂及模板病毒JEV，聚合完成后洗脱模板，得到JEV印迹的聚合物。

3.根据权利要求1所述的病毒分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于功能单体、引发剂分别为：丙烯酸锌、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)。

4.根据权利要求1第2)点所述，其特征在于，所用的钝化剂为聚乙二醇(PEG)。

5.根据权利要求1第2)点所述，其特征在于，具体步骤为，在2的基础上，将印迹颗粒分散在PBS稀释液中，加入一定量的钝化剂，并将混合液置于恒温震荡仪中震荡吸附。

6.根据权利要求1第3)点所述的分子印迹荧光传感器的制备，其特征在于：取适量钝化后的印迹聚合物于缓冲溶液中，加入适量的病毒，在优化的吸附条件下震荡吸附。然后，取一定量上述混合物于比色皿中，采用RF-5301PC荧光分光光度计测其荧光强度，构建成一种新型的病毒分子印迹荧光传感器。检测条件为：激发波长为290nm,发射波长为340nm,激发和发射的狭缝宽分别为3.0nm和5.0nm。

7.根据权利要求1第4)点所述的病毒分子印迹荧光传感器的应用，其特征在于：将上述病毒分子印迹荧光传感器对不同浓度的JEV进行分析，用以评估其对模板病毒的检测范围与检测限；用上述病毒分子印迹荧光传感器检测相同浓度的不同病毒分子，用以评估所制备的分子印迹传感器对模板分子的选择性识别与检测能力；将上述智能型病毒分子印迹荧光传感器应用于人血清中JEV的加标回收，用以评估所述的分子印迹传感器对模板分子的实际分析能力。