CN109735439B

CN109735439B - 自驱动微流控检测芯片及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN109735439B
Application number: CN201910023763.0A
Authority: CN
Inventors: 曹志; 黄倢; 董宣; 万晓媛; 李晨
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2019-01-10
Filing date: 2019-01-10
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2039-01-10
Also published as: CN109735439A

Abstract

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种自驱动微流控检测芯片及其制备方法与应用。本发明公开的自驱动微流控检测芯片，包括顺次设置的芯片上层和芯片下层；芯片上层设置有进样池和排气孔，芯片上层设置有流体通道连通检测池和废液池，流体通道表面经过亲水材料改性，实现液体流动自驱动。本发明还公开了上述自驱动微流控检测芯片在对虾病原体检测方面的应用。本发明芯片的自动化程度高，操作人员只需单次加样即能够实现对多目的核酸的快速、灵敏、微量化检测，并且大幅减少检测试剂的用量，节约了生产成本。

Description

自驱动微流控检测芯片及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及自驱动微流控检测芯片及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，对虾养殖的发展主要表现在规模的大幅扩大，模式的不断创新和速度的迅猛增长，这些都给整个社会带来了极大的经济效益，但与此同时，由于缺乏健康可持续养殖的生物安保理念，新的病原体与流行病的变异株频频涌现，药物滥用导致微生物耐药性增加、生态多样性破坏、食品安全问题日趋严重。因此，以生物安保为指导调整我国对虾养殖业的健康发展是必然趋势。针对生物安保的需求，开发快速、高通量、高灵敏、低成本的新型病原检测技术势在必行。目前对对虾病原进行扩增和检测的标准方法是基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，该技术耗时费力，需要训练有素的操作人员，并依赖于成本昂贵的检测仪器等，难以满足当前对对虾病原快速检测与鉴定的需求。

核酸恒温扩增技术(Nucleic acid isothermal amplification technology,NAIAT)因其反应温度的单一性、检测程序简单快速、摆脱了高精密的仪器等优势，代表着核酸扩增技术未来发展的新趋势。本课题组近年来致力于对虾病原快速检测技术的研究，将NAIAT应用于对虾病原检测中，目前已成功建立了对虾病原核酸恒温扩增技术和现场快速检测试剂盒。但在实际应用中，存在一定不足：(1)气溶胶污染、检测特异性和灵敏性等问题突出；(2)基于复杂的引物设计，很难实现多重目标基因的检测；(3)一次样本检测量教少，检测成本过高。这些问题的解答是当前基于NAIAT检测中需要解决的关键科学问题。

微流控技术是在微米尺度结构中操控微升至纳升级体积流体的技术，可以将分析装备微型化、芯片化、集成化和高通量化。利用微流控芯片技术可以解决上述NAIAT的不足之处，二者相结合对于开发低成本、便携快速的核酸(RNA和DNA)检测技术具有非常重大的意义。基于微流控芯片的核酸研究平台，如，Stilla Technologies公司开发的全球首款具有独特的3色检测通道的Naica crystal微滴数字PCR系统、Bio-Rad推出的QX100和QX200微滴式数字PCR系统以及博奥晶典针对食源性致病微生物分子诊断开发的晶芯RTisochip-B恒温扩增微流控芯片核酸分析平台；这些检测平台一般都需要高精密的仪器设备，整个系统售价均接近200万元，检测成本昂贵，限制了其在临床快速检测，尤其是动物病原检测中的应用。此外，基于核酸等温扩增技术的微流控芯片技术吸引了国内外学者加入到对该技术的原理研究与应用研究中来；然而，从国内外公开文献来看，这些微流控芯片技术只停留在实验室层面，只是针对特定病原的快速检测、样本通量低以及流体需要借助离心、注射泵或一些特殊材料制作的高精密流体通道才能驱动，无法真正实现低成本、高通量、现场及时检测。中国专利CN107988046A公开了一种基于LAMP的自吸式多通道病原菌检测微流控芯片，利用PDMS材料高气溶性的特质，实现了不借助仪器的自动进样。但是其微流控芯片须保持流体通道中负压环境，使用时刺破封闭膜，增加了芯片的制备、储存和使用难度。

发明内容

为克服现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种检测微升乃至纳升级体积样本的自驱动微流控检测芯片及其制备方法。本发明还提供了该检测芯片在对虾病原快速检测与鉴定中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种自驱动微流控检测芯片，包括若干检测单元，每个检测单元均包括顺次设置的芯片上层和芯片下层：

所述芯片上层设置有进样池和排气孔，进样池采用倒锥形设计，进样池和排气孔均贯穿芯片上层；所述芯片下层设置有流体通道、检测池和废液池；流体通道分别连接废液池和检测池，组合后的芯片上层与所述芯片下层，进样池通过流体通道与检测池、废液池相连，废液池与排气孔连通，所述流体通道表面设置有实现液体流动自驱动的亲水材料。

上述芯片上层与所述芯片下层组合后，液体从进样池进入所述芯片，通过流体通道分流进入检测池，多余液体汇集进入废液池，废液池与排气孔连通，使液体充满各检测池；

上述流体通道表面经过亲水材料改性后，可以实现液体流动自驱动。

进一步地，上述亲水材料为超亲水纳米自洁液或体积浓度2％氢氟酸溶液。

进一步地，上述芯片设置有多组检测单元，每检测单元有1个进样池，12个检测池，各检测池对称分布成两列，每3个相邻检测池与1个废液池连通，进样池的相对侧设置1个经流体通道连接的废液池。

进一步地，上述进样池和排气孔在检测时均设置封堵件，封堵件具体为硅胶贴或石蜡油。

进一步地，上述芯片的尺寸为25×75mm；芯片上、下层的厚度均为2.0mm；所有流体通道的宽度为0.1mm，深度为0.1mm；检测池直径为1.0mm，深度为1.0mm；废液池直径为2.0mm，深度为1.0mm；所述进样池上缘直径为3.0mm，下缘直径为2.0mm。

进一步地，向检测池内预包埋检测试剂。

本发明还提供了一种上述自驱动微流控检测芯片的制备方法，具体步骤包括：根据芯片结构图设计、加工、组配模具，浇注聚甲基丙烯酸甲酯，固化后清洁芯片；对流体通道进行亲水改性；利用冻干工艺向检测池内预包埋检测试剂；芯片上层、下层通过低温键合或粘合方式组装。

具体的，检测池中包埋的检测试剂包括用于核酸恒温扩增常规试剂、特异性引物和冻干保护剂；上述冻干保护剂包括海藻糖和牛血清白蛋白，冻干前检测试剂中海藻糖的质量浓度为0.1～0.15g/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为0.01～0.02g/mL。

本发明还提供了基于上述自驱动微流控检测芯片的应用，用于对虾样本中病原体的检测。

其中，对虾10种病原包括对虾5种DNA病毒为对虾白斑综合症病毒(White spotsyndrome virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus，IHHNV)、虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyteiridescent virus,SHIV)、急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreas necrosisdisease,AHPND)、对虾肠孢子虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)；

对虾5种RNA病毒为黄头病毒(Yellow head virus,YHV)1型、YHV-8、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、传染性肌坏死病毒(Infectious myonecrosis virus,IMNV)、偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus,CMNV)。

本发明取得的有益效果是：

1)本发明的技术方案中选择批量加工最成熟的PMMA材质；将用于玻璃、陶瓷等物体表面以发挥持久自清洁、防雾、防紫外的超亲水纳米自洁液，首次应用于对芯片流体通道作亲水改性；通过流体通道的对称性设计，实现流体的自驱动，彻底摆脱了如离心机、注射泵或研发和生产成本昂贵的精密流体通道。

2)本发明将NAIAT技术与自驱动微流控芯片结合，实现了样本核酸扩增、检测设备的一体化，对多目标基因的快速、灵敏、微量化检测，简化了操作流程，有效防止了外界污染和核酸交叉污染，为生物安保体系的实施提供技术保障。本发明的芯片采用3个检测池对1个废液池的设计，一方面用对称设计，保证液体从进样池进入后对称流入到各检测池中，避免远离进样池的检测池无法充满的情况；另一方面可以避免各检测空间的气溶胶污染。检测区全满所需要的最小样本体积为25μL。

3)市售的对虾病原核酸恒温现场快速检测试剂盒(如，虾白斑病病毒、对虾桃拉病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒现场快速高灵敏检测试剂盒)中每个样本扩增体系为35μL，检测管预装检测试剂34μL。本发明微流控芯片扩增池充满时的总体积为1.413μL，预包被检测试剂为1.0μL，检测试剂的用量仅为市售试剂盒的1/34，极大降低了检测芯片的生产成本。

4)本发明提供的自驱动微流控检测芯片能够对6组样本、对虾10种重要病原进行快速、灵敏、同步即时检测，检测灵敏度对对虾10种病原均可达10²拷贝，可以用于开展引起对虾致病的主要病原快速检测研究。

附图说明

图1是实施例1中的微流控芯片上层基片的结构示意图；上层基片依次设置有进样池和排气孔，其中采用倒锥形设计的进样池，上缘直径为3.0mm，下缘直径为2.0mm；废液池上方排气孔，直径为0.5mm，贯穿上层基片；

图2是实施例1中的微流控芯片下层基片的结构示意图；下层基片依次设置有流体通道、检测池以及废液池；检测池直径为1.0mm，深度为1.0mm；废液池直径为2.0mm，深度为1.0mm；流体通道宽度为0.1mm，深度为0.1mm；

图3是实施例1中的微流控芯片的结构示意图；上、下层基片组装，上层基片的进样池与流体通道末端连通，排气孔与废液池连通；

图中各标记如下：1进样池、2排气孔、3废液池、4流体通道、5检测池。

图4是实施例2中自驱动微流控检测芯片对目标基因检测的特异性分析；上排左起分别为阳性对照样本，感染5种DNA病毒的对虾组织提取DNA的三组平行样本；下排左起分别为阴性对照样本，感染5种RNA病毒的对虾组织提取RNA的三组平行样本。

图5是图4荧光检测结果图的亮度调整图，显示使用状态下微流控芯片的部分结构。

图6是实施例2中自驱动微流控检测芯片对目标基因检测的灵敏度分析；上排左起分别为阳性对照样本，含有10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL的各病原核酸样本；下排左起分别为阴性对照样本，含有10¹copies/μL、10²copies/μL、10³copies/μL的各病原核酸样本。

图7是图6荧光检测结果图的亮度调整图，显示使用状态下微流控芯片的部分结构。

图8是实施例3中自驱动微流控检测芯片对样本检测的结果图；上排左起分别为阳性对照样本，对虾样本1、2、3；下排左起分别为阴性对照样本，对虾样本4、5、6。

图9是图8荧光检测结果图的亮度调整图，显示使用状态下微流控芯片的部分结构。

具体实施方式

下面结合实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步描述。

以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，均采用分析纯试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得。所采用溶液均为灭菌、失活降解酶的去离子水配置。

芯片注塑工艺用的设备住友SE180DU-C360，购自Sumitomo HeavyIndustries.Ltd.,JAPAN。

芯片扫描分析仪晶芯LUXSCAN 10K-A，购自博奥生物集团有限公司。

LY0-0.5型东富龙冷冻干燥机，购置上海东富龙科技有限公司。

超亲水ZXL-CQS纳米自洁液，购自莱阳子西莱环保科技有限公司。

卡夫特K-303无影胶透明亚克力粘合剂，购自广东恒大新材料科技有限公司。

WSSV、IHHNV、SHIV、AHPND、EHP、YHV-1、YHV-8、IMNV、TSV、CMNV阳性及无特定病原(Special pathogen free,SPF)的凡纳滨对虾组织，均由中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海水养殖病害防治重点实验室保存并提供。

10种对虾DNA病原、RNA病原的阳性质粒构建为选取GenBack所报道的相关序列片段采用人工基因合成的方法制备(Takara，大连)。将上述10种对虾DNA或RNA病原的特异性核酸片段克隆到pMD18-T载体上，分别构建pMD18-WSSV、pMD18-IHHNV、pMD18-SHIV、pMD18-AHPND、pMD18-EHP、pMD18-YHV-1、pMD18-YHV-8、pMD18-IMNV、pMD18-TSV和pMD18-CMNV共10种重组质粒，所构建质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序确定为阳性克隆。

Bst 2.0

DNA聚合酶及配套10×Bst buffer和100mM MgSO₄(#M0538L)，购自NEB。

RTx反转录酶(#M0380L)，购自NEB。

5M Betaine(非盐酸盐)：购买甜菜碱(C₅H₁₁NO₂，分子量117.15)，分析纯试剂。称取甜菜碱117.15g，用100mL无RNase水溶解后，在专用pH计上用1M HCl调pH至8.0±0.2，加无RNase水定容至200mL。分装冻存于-20℃。

350mM MnCl₂：购买无水氯化锰(MnCl₂,MW 125.91)或者四水氯化锰(MnCl₂·4H₂O,MW197.91)，分析纯。称取4.407g无水氯化锰或者6.927g四水氯化锰，溶解于80mL无RNase水中，定容至100mL，分装为2mL/支，冻存于-20℃。

3.5mM Caclein：购买钙黄绿素(C₃₀H₂₆N₂O₁₃,MW 622.55)或钙黄绿素钠(Na₂C₃₀H₂₆N₂O₁₃,MW 666.5)，分析纯。称取43.58mg钙黄绿素，加到6mL DMSO，溶解后，加约14mL无RNase水定容到20mL或者称取46.66mg钙黄绿素钠，溶解到20mL无RNase水中。所配溶液分装为0.5mL/支，冻存于-20℃。

10种对虾DNA病原、RNA病原的特异性引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。

上述10种病原的特异性引物序列具体如表1所示：

表1.对虾病原特异性引物序列

一、自驱动微流控检测芯片的制备

实施例1

如图1、2所示，为本实施例的自驱动微流控检测芯片，包括若干检测单元，每个检测单元均包括顺次设置的芯片上层和芯片下层：

所述芯片上层设置有进样池1和排气孔2，进样池1采用倒锥形设计，进样池1和排气孔2均贯穿芯片上层；所述芯片下层设置有流体通道4、检测池5和废液池3；流体通道4分别连接废液池3和检测池5，组合后的芯片上层与所述芯片下层，进样池1通过流体通道4与检测池5、废液池3相连，废液池3与排气孔2连通，所述流体通道4表面设置有实现液体流动自驱动的亲水材料。

本实施例的自驱动微流控检测芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、微流控芯片模具的设计与加工：

使用开模注塑技术，依据经计算机数控(computer numerical control,CNC)加工验证合格的芯片3D模型文件和2D图工程图，出模具分体部件加工图；加工模具，检测模具，组配模具。将模具安装到注塑成型机上试制，注塑聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，待芯片固化后，利用等离子机清洗上、下层基片。

微流控芯片的尺寸为25×75mm；上、下层基片的厚度均为2.0mm；所有流体通道的宽度为0.1mm，深度为0.1mm；检测池直径为1.0mm，深度为1.0mm；废液池直径为2.0mm，深度为1.0mm；进样池采用倒锥形设计，上缘直径为3.0mm，下缘直径为2.0mm。

各检测池的体积均：V＝3.14×0.5×0.9＝1.413μL。

步骤2、微流控芯片流体通道亲水改性：

将超亲水ZXL-CQS纳米自洁液均匀喷涂或涂抹于下层基片流体通道内，固化干燥后即可。

步骤3、微流控芯片检测池预包埋检测试剂：

如图1、2所示，微流控芯片的下层基片设置8组相同的检测单元，其中，6组为样本检测单元，剩余2组分别为阴、阳性对照检测单元；每组检测单元共有12个检测池，各自检测不同的病原体核酸。位于左侧的5个检测池中分别包埋了用于检测WSSV、IHHNV、SHIV、AHPND和EHP等5种DNA病原的试剂(1.0μL体系)。位于右侧5个检测池中分别包埋了用于检测YHV-1、YHV-8、TSV、IMNV和CMNV等5种RNA病原的试剂(1.02μL体系)。

冻干保护剂为海藻糖和牛血清白蛋白(BSA)，质量浓度分别为0.1～0.15g/mL和0.01～0.02g/mL。按照表2所示，将检测试剂、特异性引物以及冻干保护剂混合均匀后加入相应的检测池中，置于LY0-0.5型东富龙冷冻干燥机进行冻干处理，具体冻干工艺如下：①预冻1小时(前箱两个探头为-40℃以下，后箱-45℃以下)；②对前后箱进行抽真空，当前箱真空度显示达到所需真空度0.08～0.10mbar即可；调整界面手动加热温度-5℃，当制品温度逐渐接近导油温度，真空度曲线有明显弯曲后，一次升华结束；③一次升华结束，对产品进行加热提温。前箱温度升至-10℃时，开始提温；调整界面手动加热温度-5℃，当制品温度升至-5℃时，保温计时1.5小时。

表2.检测池预包埋试剂表

步骤4、微流控芯片的组装：

将卡夫特K-303无影胶透明亚克力粘合剂精细涂抹于芯片各个粘接处，涂均匀薄层后芯片剩下层基片粘接在一起，使用紫外线灯光照射1min后键合完成，成品包装，置于-20℃以下保存。

二、自驱动微流控检测芯片对目标基因检测的特异性和灵敏度分析

实施例2

步骤1、对目标基因检测的特异性分析

选取经实验室保存的感染WSSV、IHHNV、SHIV、AHPND、EHP、IMNV、CMNV、TSV、YHV-1以及YHV-8的对虾组织作为待检样本，经核酸定向释放剂(体积比为异硫氰酸胍盐:聚丙烯酰胺:BSA:明胶＝6:2:1:1)快速提取样本核酸作为检测模板，按照使用说明书进行操作。

取实施例1中制备而成的自驱动微流控芯片，6组样本检测单元依次加入：含等比例混合的感染WSSV、IHHNV、SHIV、AHPND、EHP对虾组织的DNA(终浓度为10ng/μL)；含等比例混合的感染IMNV、CMNV、TSV、YHV-1、YHV-8对虾组织的RNA(终浓度为10ng/μL)；均重复3次。取SPF凡纳滨对虾组织核酸(终浓度为10ng/μL)加入阴性对照检测单元，等比例混合对虾10种病原阳性质粒(终浓度为10ng/μL)加入阳性对照检测单元。

然后，用硅胶贴或石蜡油封堵上层基片的各个进样池及样本废液池上方排气孔；将封堵后的芯片置于65℃反应45min。待反应结束后，将芯片置于芯片扫描分析仪中进行检测。基于本实施例中使用的荧光染料性质，反应结果在波长532nm的绿光激发下判读，检测结果如图4、图5所示。未见假阳性和假阴性结果，说明所述检测方法特异性强。

步骤2、对目标基因检测的灵敏度分析

采用世界动物卫生组织(OIE)《Manual of Diagnostic Tests for AquaticAnimals》检测WSSV、IHHNV、AHPND、YHV(YHV-1和YHV-8)、IMNV、TSV的Tag Man探针实时荧光定量PCR法对已知浓度的各病原核酸进行检测(具体方法详见http://www.oie.int/en/animal-health-in-the-world/information-on-aquatic-and-terrestrial-animal-diseases/)，根据标准曲线计算每微升样本核酸的拷贝数。剩余3种病原核酸的拷贝数根据相应参考文献《Detection and quantification of shrimp hemocyte iridescent virus byTaqMan probe based real-time PCR》、《虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)实时荧光定量PCR检测方法的建立及对虾样品的检测》、《Development of a TaqMan real-time RT-PCR assay for detection of covert mortality nodavirus(CMNV)in penaeidshrimp》建立的检测SHIV、EHP、CMNV的Tag Man探针实时荧光定量PCR法进行计算。

分别将10⁶copies/μL的各病原核酸进行10倍梯度稀释至10¹copies/μL，各取1.5μL等比例混合作为模板加入至6组样本检测单元；取等量灭菌水加入阴性对照检测单元，等比例混合对虾10种病原阳性质粒加入阳性对照检测单元。

然后，用硅胶贴或石蜡油封堵上层基片的各个进样池及样本废液池上方排气孔；将封堵后的芯片置于65℃反应45min。待反应结束后，将芯片置于芯片扫描仪中进行检测。检测结果如图6、图7所示。该系统的检测灵敏度对对虾10种病原均可达10²拷贝。

实施例3

步骤1、样本核酸的提取：

1)由中国水产科学研究院黄海水产研究所海水养殖生物疾病控制与分子病理学实验室从全国范围采集不同地区的发病对虾样本6份，对虾组织切取0.5×0.5cm²大小组织块，放入相应编号的1.5mL EP管中，冰上保存。样本管中加入150μL水，浸没组织样本，匀浆1-3min，至无任何组织块残留，室温静置5min。

2)配制核酸定向释放剂，体积比为异硫氰酸胍盐:聚丙烯酰胺:BSA:明胶＝6:2:1:1。

0.2mL PCR管中加入5μL核酸定向释放剂，加入20μL上述组织研磨上清液混匀；置于金属浴中，99℃保温10min；取出后再室温静置2-3min，快速离心，上清即为样本核酸。

采用异硫氰酸胍盐及表面活性剂等联合在碱性环境裂解样本材料(包括全血或组织研磨上清液)，BSA和明胶保护稳定核酸的同时进一步加热条件使蛋白及抑制物凝聚沉淀，完全释放DNA和RNA到溶液中，离心所得上清即为样本核酸。

步骤2、病原体核酸的检测：

1)取适量步骤1所得样本核酸经无RNase水10倍稀释后，分别加入到样本检测单元的进样池，核酸样本将自驱动至各个检测池并将其填满。取等量水加入阴性对照检测单元，等比例混合对虾10种病原阳性质粒(终浓度为10ng/μL)加入阳性对照检测单元。然后，用硅胶贴或石蜡油封堵上层基片的各个进样池及样本废液池上方排气孔。

2)将封堵后的芯片置于65℃反应45min。

3)待反应结束后，将芯片置于实施例2制备的核酸扩增检测的成像设备中进行检测。检测池呈现荧光为阳性结果，无色为阴性结果。检测结果如表3、图8、图9所示。

表3.对虾病原体核酸的荧光检测结果

样本

WSSV

IHHNV

SHIV

AHPND

EHP

YHV-1

YHV-8

TSV

IMNV

CMNV

1

－

+

－

2

+

－

+

3

+

－

+

4

+

－

+

－

5

+

－

6

+

－

注：“－”代表阴性结果；“+”代表阳性结果。

由表3和图6的检测结果所示，本发明所述芯片可以实现对对虾组织中的10种病原体的同时检测，成像清晰，结果准确。

当然，上述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定对本发明的实施例范围。本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围内。

Claims

1.一种自驱动微流控检测芯片，其特征在于，包括若干检测单元，每个检测单元均包括顺次设置的芯片上层和芯片下层：

所述芯片上层设置有进样池（1）和排气孔（2），进样池（1）采用倒锥形设计，进样池（1）和排气孔（2）均贯穿芯片上层；所述芯片下层设置有流体通道（4）、检测池（5）和废液池（3）；流体通道（4）分别连接废液池（3）和检测池（5），组合后的芯片上层与所述芯片下层，进样池（1）通过流体通道（4）与检测池（5）、废液池（3）相连，废液池（3）与排气孔（2）连通，所述流体通道（4）表面设置有实现液体流动自驱动的亲水材料；

每个所述检测单元均有1个进样池（1），12个检测池（5），各检测池（5）对称分布成两列，每3个相邻检测池（5）与1个废液池（3）连通，进样池（1）的相对侧设置1个经流体通道（4）连接的废液池（3）；

所述进样池（1）和排气孔（2）在检测时均设置封堵件，所述封堵件为硅胶贴或石蜡油。

2.根据权利要求1所述的自驱动微流控检测芯片，其特征在于，所述亲水材料为超亲水纳米自洁液或体积浓度2%氢氟酸溶液。

3.根据权利要求1所述的自驱动微流控检测芯片，其特征在于，所述芯片的尺寸为25×75 mm；芯片上、下层的厚度均为2.0 mm；所有流体通道（4）的宽度为0.1 mm，深度为0.1 mm；检测池（5）直径为1.0 mm，深度为1.0 mm；废液池（3）直径为2.0 mm，深度为1.0 mm；所述进样池（1）上缘直径为3.0 mm，下缘直径为2.0 mm。

4.根据权利要求1所述的自驱动微流控检测芯片，其特征在于，向检测池（5）内预包埋检测试剂。

5.根据权利要求4所述的自驱动微流控检测芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：根据芯片结构设计、加工、组配模具，浇注聚甲基丙烯酸甲酯，固化后清洁芯片；对流体通道（4）进行亲水改性；利用冻干工艺向检测池（5）内预包埋检测试剂；芯片上层、下层通过低温键合或粘合方式组装。

6.根据权利要求5所述的自驱动微流控检测芯片的制备方法，其特征在于，所述检测池（5）中包埋的检测试剂包括用于核酸恒温扩增常规试剂、特异性引物和冻干保护剂；所述冻干保护剂包括海藻糖和牛血清白蛋白，冻干前检测试剂中海藻糖的质量浓度为0.1~0.15g/mL，牛血清白蛋白的质量浓度为0.01~0.02g/mL。

7.一种基于权利要求1-4任一项所述的自驱动微流控检测芯片在虾样本中病原体的检测的应用。

8.根据权利要求7所述的自驱动微流控检测芯片的应用，其特征在于，所述病原体包括对虾白斑综合症病毒WSSV、传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV、黄头病毒1型YHV-1、黄头病毒8型YHV-8、桃拉综合征病毒TSV、传染性肌坏死病毒IMNV、偷死野田村病毒CMNV、虾血细胞虹彩病毒SHIV、急性肝胰腺坏死病AHPND、对虾肠孢子虫EHP。