CN109734892B

CN109734892B - 一种聚双硒碳酸酯聚合物、制备方法及其用途

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Publication number: CN109734892B
Application number: CN201910006598.8A
Authority: CN
Inventors: 郎美东; 魏超
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2039-01-04
Also published as: CN109734892A

Abstract

本发明公开了一种聚双硒碳酸酯聚合物及其用途，聚合物具有以下重复单元：

其中，P为20～450的整数；m为1～40的整数；n为10～200的整数。本发明提供的聚双硒碳酸酯由亲水段的聚乙二醇单甲醚引发双硒大环碳酸酯和三亚甲基碳酸酯开环聚合得到，所述聚合物可作为抗肿瘤药物。本发明提供的聚双硒碳酸酯结构可控，硒含量可调，抗肿瘤活性可调；聚合物纳米粒子直接作为药物使用，成分单一，制备简单，避免了普通药物载体在包载药物时存在的稳定性差、过程繁琐等问题。

Description

一种聚双硒碳酸酯聚合物、制备方法及其用途

技术领域

本发明属于高分子材料技术领域，具体地说，涉及一种聚双硒碳酸酯聚合物、制备方法及其用途。

背景技术

21世纪癌症已成为仅次于心血管病的人类第二大杀手。据中国肿瘤登记年报显示，以人的平均寿命74岁计算，人在一生中患癌的几率为22％。化学治疗仍旧是目前癌症治疗的重要方法，常见的化疗药物如阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和铂药等已被广泛应用于临床。然而化疗药物缺乏选择性，大大影响了治疗效果，给患者带来了很大的痛苦。而且，小分子药物大多不溶于血液，很难在体内传递，只有极少量的抗癌药物会到达肿瘤部位起作用。基于此，科学家们开发出纳米载药系统，特别是聚合物载体以克服上述问题。利用聚合物的血液长循环性和主动、被动靶向的特点为肿瘤治疗提供了新的方向，并成功开发出数种载药系统应用于临床。虽然聚合物载体克服了传统小分子药物的缺点，但聚合物本身仅作为载体使用，后续需通过降解等方式排除体外，抗肿瘤仍需依赖化疗药物本身，依然面临着药物突释和脱靶的问题。更为重要的是，在制备载药纳米粒子过程中，通常需要复杂的策略和过程，无形增加了很多成本，同时降低了载体的稳定性，而且装载药物时往往需要特定的聚合物载体。

基于上述这些限制，如果能够开发简单有效的策略，例如利用聚合物纳米粒子本身直接杀死肿瘤细胞，这不仅避免了装载药物的繁琐过程和高额成本，还显著提高了粒子的稳定性和安全性，更加方便快速的进行临床试验研究。最近，人们开发了数种阳离子聚肽和聚碳酸酯，利用阳离子的特点通过细胞坏死的机制杀死肿瘤细胞，提高了肿瘤的治疗效果。但是，就目前文献报道而言，聚合物纳米粒子直接用于抗肿瘤的研究仍然很少，并处于起步阶段，急需开发新型的抗肿瘤聚合物纳米粒子。

硒是生物体必需的微量元素，同时也是一种强氧化剂，能通过一系列含硒酶，使体内过氧化物得以清除，修复自由基过剩所引发的细胞氧化损伤等，起到防治癌症的作用。美国食品药品监督管理局(FDA)在2003年发出申明“硒是抑癌剂”，并向健康人群和肿瘤患者推荐补硒。已有许多含硒小分子如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉被报道具有抗肿瘤作用，然而，这些小分子同样具有和其他小分子药物类似的缺陷，例如治疗效果不理想、没有选择性，无法在体内长循环、溶解性差等。考虑上述硒的抗肿瘤作用，如果将硒引入两亲性聚合物中，不仅可以有效避免含硒小分子药物的缺点，还可发展一类新型的聚合物抗肿瘤药物。近年来，含硒聚合物取得了长足的发展，利用硒灵敏的氧化还原响应性制备了一系列新型的药物载体系统，然而，目前报道的含硒聚合物存在结构不可控、生物难以降解等问题，限制了其在生物医用领域的应用，而且鲜有文献关注含硒聚合物本身是否具有抗肿瘤作用。

我们在专利CN106905292A报道了含双硒的大环碳酸酯单体(M_SeSe)的制备方法，如若能通过共聚制备两亲性双硒聚碳酸酯聚合物，有望解决上述存在的技术瓶颈。有鉴于此，本发明旨在提供一类新型结构可控、硒含量可调、生物可降解的含双硒聚碳酸酯基两亲性共聚物，并将其用于抗肿瘤药物中。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种聚双硒碳酸酯聚合物。

本发明的第二个目的是提供一种所述聚双硒碳酸酯聚合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子。

本发明的第四个目的是提供一种所述聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的制备方法。

本发明的第五个目的是提供一种所述聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面提供了一种聚双硒碳酸酯聚合物，具有以下重复结构单元：

其中，P为20～450的整数；m为1～40的整数；n为10～200的整数；所述聚双硒碳酸酯聚合物为嵌段共聚物，分子量分布指数通常在1～2之间，分子量为5～5kg/mol，通过改变p、m和n的投料比可得到不同分子量的聚合物，控制聚合物的组分，进而可调节聚合物中的硒含量。

所述聚双硒碳酸酯聚合物中，聚乙二醇的链段数P优选为45～113，双硒乙醇大环碳酸酯的链段数m优选为2～20，三亚甲基碳酸酯的链段数n优选为30～100。

本发明的第二个方面提供了一种所述聚双硒碳酸酯聚合物的制备方法，包括以下步骤：

在氩气保护下，将摩尔比为1:(1～40):(10～200)的聚乙二醇单甲醚MPEG、双硒大环碳酸酯单体M_SeSe和三亚甲基碳酸酯单体TMC混合抽真空，加入脂肪酶和干燥的溶剂，在50～90℃条件下开环聚合反应12～144h，经过后处理获得聚双硒碳酸酯聚合物。

所述溶剂为无水甲苯，用量为每克单体(M_SeSe和TMC)需4～20mL溶剂。

所述聚乙二醇单甲醚MPEG的数均分子量为1000～20000。

所述脂肪酶为Novozym435酶。

所述脂肪酶与单体(M_SeSe和TMC)质量比为(0.02～0.40)：1。

所述大环双硒碳酸酯单体M_SeSe参照专利CN106905292A的制备方法，包括以下步骤：

按摩尔比1:1的硼氢化钠和硒粉投料，在常温、水溶剂中反应0.1～4h，得到红褐色的Na₂Se₂溶液，然后加入等当量或过量的溴乙醇的四氢呋喃溶液，40～60℃下反应1～12h，得到双硒乙醇(HOCH₂CH₂SeSeCH₂CH₂OH)；接着在氩气保护下，将摩尔比1:1～1:1.5的双硒乙醇和碳酸二苯酯加入无水甲苯(用量为每克碳酸二苯酯需甲苯200～700mL)中，在酶催化(Novozym435酶)的作用下于50～90℃下反应8～24h，得到所述单体M_SeSe。

本发明的第三个方面提供了一种聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子，粒径为70～100nm，具有球形形貌的聚合物粒子。

本发明的第四个方面提供了一种所述聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

将所述聚双硒碳酸酯聚合物溶于有机溶剂(如DMF、THF等)中，逐滴滴加到双蒸水中搅拌，然后透析，隔段时间换水，最后通过冷冻干燥技术(用冰箱-20℃冷冻24～48h，取出后放置于冷冻干燥机中，在-80℃、10Pa下冷冻24h)除去水溶剂，得到所述聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子粉末。

本发明的第五个方面提供了一种所述聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供的聚双硒碳酸酯聚合物结构可控，生物可降解且硒含量可调，可以采用大分子自组装制备纳米粒子，所制备的纳米粒子具有广谱的抗肿瘤活性，对正常细胞和癌细胞具有一定的选择性，可发展成一类新型的抗肿瘤聚合物纳米药物。

本发明提供的聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子制备简单，成分单一，由于不需要包载小分子药物，纳米粒子不仅稳定性高，且容易保存和再分散，避免了普通药物载体在包载药物时存在的稳定差、过程繁琐等缺点。

本发明提供的聚双硒碳酸酯纳米粒子的抗肿瘤活性可通过聚合物的结构(硒含量)进行严格调控，将聚合物中的有效成分以硒计算并和临床使用的阿霉素(DOX)比较发现，两者具有相当的抗肿瘤效果，在高浓度区域，聚合物纳米粒子甚至具有更高的抗肿瘤活性。

本发明提供的聚双硒碳酸酯纳米粒子对肿瘤细胞和正常细胞具有很高的选择性，其对正常细胞的毒性远小于对癌细胞的毒性；更为重要的是，由于其特殊的抗肿瘤机理，本身不产生耐药性，可以显著杀死耐药株癌细胞。

本发明提供的聚双硒碳酸酯纳米粒子增加了体内的循环时间，解决了小分子抗肿瘤药物易被体内清除的问题，起到增加疗效、降低化疗毒副作用，降低机体耐药性，有望发展成一类新型的抗肿瘤大分子纳米药物。

附图说明

图1是聚双硒碳酸酯共聚物纳米胶束的TEM图。

图2是不同浓度的聚双硒碳酸酯共聚物纳米粒子对癌细胞和正常细胞的毒性示意图。

图3是不同浓度的聚双硒碳酸酯共聚物纳米粒子对癌细胞和正常细胞产生ROS的情况示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明实施例中所用的试剂聚乙二醇单甲醚MPEG、三亚甲基碳酸酯单体TMC均购买于Sigma Aldrich公司，为分析纯。Novozym435酶为诺维信产品，购买于南京诚纳化工有限公司，使用前P₂O₅中抽真空48h。

实施例1

聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC839的合成：

在氩气保护下，将聚乙二醇单甲醚MPEG(M_n＝2000，100mg，0.05mmol)、大环双硒碳酸酯单体M_SeSe(280mg，0.5mmol)和三亚甲基碳酸酯单体TMC(202mg，2.0mmol)迅速加入到预先抽烤过三次的聚合瓶中，抽真空3h后加入48mg Novozym435酶和3.8mL干燥的甲苯，于70℃下反应72h。反应结束后，加入4～8mL二氯甲烷溶解，过滤除去酶，用约100mL冰无水乙醚沉降，得到黄色聚合物抽真空干燥至恒重，获得聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC839，P为45，m为8，n为39。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.42(-OCOOCH₂)，4.24(-OCOO CH₂CH₂Se)，3.16(CH₂CH₂Se)，2.05(-OCOOCH₂CH₂)，3.65和3.38分别为MPEG重复单元和末端甲基氢；GPC：M_n＝12.3kg/mol，PDI(分子量分布指数)＝1.1。

所述大环双硒碳酸酯单体M_SeSe的制备方法包括以下步骤，按照专利CN106905292A的合成方法制备该化合物，具体如下：

首先合成双硒乙醇，将硼氢化钠(3.5g，0.092mol)和水(150mL)置于500mL反应瓶中，加入硒粉(7.3g，0.092mol)，室温下反应30min，得到红褐色的Na₂Se₂溶液。随后氩气保护下，加入溴乙醇(11.6g，0.092mol)的THF溶液(140mL)，于50℃下反应6h。停止反应，用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，经硅胶柱柱分离(淋洗液为乙酸乙酯:二氯甲烷＝1:1(v/v))得到化合物(HOCH₂CH₂SeSeCH₂CH₂OH，简记为“双硒乙醇”)。

接着，在氩气保护下，将得到的双硒乙醇(0.5g，2.0mmol)和二苯基碳酸酯(碳酸二苯酯)(0.65g，3.0mmol)和0.65g脂肪酶Novozym435加入到250mL无水甲苯中，于70℃下反应12h。停止反应，过滤除去酶，减压蒸馏除去甲苯，经硅胶柱分离(淋洗液为二氯甲烷)得到粗产物，乙酸乙酯重结晶进一步纯化得到目标物大环双硒碳酸酯单体M_SeSe，产率50～70％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ4.41(t,J＝6.8Hz,8H,a),3.25(t,J＝6.8Hz,8H,b)；¹³C NMR(400MHz,CDCl₃):δ154.59,67.39,27.48；HRMS(ESI,m/z):M+C10H16O6Se4Na计算值：572.7522；测得值：572.7567。

实施例2

聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC646的合成：

在氩气保护下，将聚乙二醇单甲醚MPEG(M_n＝2000，100mg，0.05mmol)、大环双硒碳酸酯单体M_SeSe(224mg，0.4mmol)和三亚甲基碳酸酯单体TMC(255mg，2.5mmol)迅速加入到预先抽烤过三次的聚合瓶中，抽真空3h后加入48mg Novozym435酶和3.8mL干燥的甲苯，于70℃下反应72h。反应结束后，加入4～8mL二氯甲烷溶解，过滤除去酶，用约100mL冰无水乙醚沉降，得到黄色聚合物抽真空干燥至恒重，获得聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC646，P为45，m为6，n为46。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.42(-OCOOCH₂)，4.24(-OCOO CH₂CH₂Se)，3.16(CH₂CH₂Se)，2.05(-OCOOCH₂CH₂)，3.65和3.38分别为MPEG重复单元和末端甲基氢；GPC：M_n＝13.9kg/mol，PDI(分子量分布指数)＝1.2。

实施例3

聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC459的合成：

在氩气保护下，将聚乙二醇单甲醚MPEG(M_n＝2000，100mg，0.05mmol)、大环双硒碳酸酯单体M_SeSe(140mg，0.25mmol)和三亚甲基碳酸酯单体TMC(306mg，3mmol)迅速加入到预先抽烤过三次的聚合瓶中，抽真空3h后加入45mg Novozym435酶和3.6mL干燥的甲苯，于70℃下反应72h。反应结束后，加入4～8mL二氯甲烷溶解，过滤除去酶，用约100mL冰无水乙醚沉降，得到黄色聚合物抽真空干燥至恒重，获得聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC459，P为45，m为4，n为59。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.41(-OCOOCH₂)，4.24(-OCOO CH₂CH₂Se)，3.16(CH₂CH₂Se)，2.05(-OCOOCH₂CH₂)，3.65和3.37分别为MPEG重复单元和末端甲基氢；GPC：M_n＝13.2kg/mol，PDI(分子量分布指数)＝1.1。

实施例4

聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC280的合成：

在氩气保护下，将聚乙二醇单甲醚MPEG(M_n＝2000，100mg，0.05mmol)、大环双硒碳酸酯单体M_SeSe(56mg，0.1mmol)和三亚甲基碳酸酯单体TMC(408mg，4mmol)迅速加入到预先抽烤过三次的聚合瓶中，抽真空3h后加入46mg Novozym435酶和3.7mL干燥的甲苯，于70℃下反应72h。反应结束后，加入4～8mL二氯甲烷溶解，过滤除去酶，用约100mL冰无水乙醚沉降，得到黄色聚合物抽真空干燥至恒重，获得聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC280，P为45，m为2，n为80。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.42(-OCOOCH₂)，4.24(-OCOO CH₂CH₂Se)，3.16(CH₂CH₂Se)，2.05(-OCOOCH₂CH₂)，3.65和3.38分别为MPEG重复单元和末端甲基氢；GPC：M_n＝12.8kg/mol，PDI(分子量分布指数)＝1.1。

实施例5

聚双硒碳酸酯聚合物(PSeSeTMC996)的合成：

在氩气保护下，将聚乙二醇单甲醚MPEG(M_n＝5000，125mg，0.025mmol)、大环双硒碳酸酯单体M_SeSe(275mg，0.25mmol)和三亚甲基碳酸酯单体TMC(255mg，2.5mmol)迅速加入到预先抽烤过三次的聚合瓶中，抽真空3h后加入53mg Novozym435酶和4mL干燥的甲苯，于70℃下反应72h。反应结束后，加入4～8mL二氯甲烷溶解，过滤除去酶，用约100mL冰无水乙醚沉降，得到黄色聚合物抽真空干燥至恒重，获得聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC996，P为113，m为9，n为96。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.42(-OCOOCH₂)，4.24(-OCOO CH₂CH₂Se)，3.16(CH₂CH₂Se)，2.05(-OCOOCH₂CH₂)，3.65和3.38分别为MPEG重复单元和末端甲基氢；GPC：M_n＝24.5kg/mol，PDI(分子量分布指数)＝1.4。

实施例6

聚双硒碳酸酯聚合物(PSeSeTMC1899)的合成：

在氩气保护下，将聚乙二醇单甲醚MPEG(M_n＝4000，80mg，0.02mmol)、大环双硒碳酸酯单体M_SeSe(220mg，0.4mmol)和三亚甲基碳酸酯单体TMC(204mg，2mmol)迅速加入到预先抽烤过三次的聚合瓶中，抽真空3h后加入45mg Novozym435酶和3.5mL干燥的甲苯，于70℃下反应72h。反应结束后，加入4～8mL二氯甲烷溶解，过滤除去酶，用约100mL冰无水乙醚沉降，得到黄色聚合物抽真空干燥至恒重，获得聚双硒碳酸酯聚合物PSeSeTMC1899，P为90，m为18，n为99。¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ4.42(-OCOOCH₂)，4.24(-OCOO CH₂CH₂Se)，3.16(CH₂CH₂Se)，2.05(-OCOOCH₂CH₂)，3.65和3.38分别为MPEG重复单元和末端甲基氢；GPC：M_n＝31.4kg/mol，PDI(分子量分布指数)＝1.5。

实施例7

聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

采用油滴水-透析法制备聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子，首先准确称取实施例1-4制备的聚双硒碳酸酯聚合物25mg，将其完全溶解于DMF(2.5mL)中，在适当的搅拌速率下，逐滴滴加到10～15mL双蒸水中，随后搅拌2h，放入到截留分子量为3500的透析袋中透析24h，每隔一定时间换水。通过冷冻干燥技术(用冰箱-20℃冷冻24～48h，取出后放置于冷冻干燥机中，在-80℃、10Pa下冷冻24h)除去水溶剂可得到聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子粉末，使用时将其分散。临界胶束浓度可通过荧光光谱仪测得，聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的粒径可通过动态光散射(DLS)测得，具体数据如表1所示，其球形形貌可通过透射电镜(TEM)直接观察，如图1所示，图1是聚双硒碳酸酯共聚物纳米胶束的TEM图。

表1实施例1～4制备的聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的表征数据

	Diameter(nm)<sup>a</sup>	PDI<sup>a</sup>	CMC(mg mL<sup>-1</sup>)
				PSeSeTMC839	75.5±0.1	0.16±0.01	0.058
PSeSeTMC646	83.7±0.2	0.11±0.03	0.048
				PSeSeTMC459	97.1±0.1	0.15±0.06	0.052
PSeSeTMC280	85.2±0.5	0.15±0.02	0.043

实施例8

聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的广谱抗肿瘤活性实验

聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的细胞毒性通过CCK-8法测试。测试前，所有的液体样品均通过0.22μm的滤头过滤，并通过完全培养基(DMEM)(组成为：10％的高温灭菌的新生牛血清蛋白(FBS，GIBCO)，100U/mL的青霉素，以及100mg/L的链霉素。培养条件：37℃，含5％CO₂)稀释得到不同浓度的样品溶液。将四种癌细胞(4T1-乳腺癌细胞，A549-肺癌细胞，CT26-结肠癌细胞，Hela-宫颈癌细胞。)接种在96孔板中，接种密度约1×10⁴个一孔，培养24h待细胞完全贴壁后，培养基替换成含有不同浓度样品(阿霉素DOX作为对比)的完全培养基DMEM溶液，继续培养24h，同时用不含样品的DMEM培养细胞作为阳性对照组。随后弃去上清液，重新加入100μL培养基DMEM溶液和10μL CCK8溶液，孵育2h。通过酶标仪(Bio-Rad550)于450nm波长下读出吸光度值。然后根据以下公式计算细胞存活率(Cell viability)

Cell viability(％)＝(OD_test)/(OD_control)×100

其中OD_test为含有胶束的细胞孔板读数，OD_control为不加胶束的细胞孔板读数。

表2.实施例1～4制备的四种聚合物对应不同细胞的IC₅₀值(以聚合物浓度计算)

Polymers	Se％	4T1(μg/mL)	A549(μg/mL)	CT26(μg/mL)	Hela(μg/mL)
						PSeSeTMC839	24.9	4.3	7.0	3.5	3.5
PSeSeTMC646	18.9	5.4	8.0	4.6	5.2
						PSeSeTMC459	11.2	7.6	10.5	6.1	6.3
PSeSeTMC280	5.6	35.4	66.9	19.6	36.7

从表2中可以发现，聚双硒碳酸酯纳米粒子对于不同的癌细胞均表现出很强的杀伤能力，具有广谱的抗肿瘤活性。随着硒含量的降低，IC₅₀逐渐增大，抗肿瘤活性逐渐降低，说明聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的抗肿瘤活性可通过聚合物的结构进行调节。随后，通过表2的硒含量数值可以计算杀死50％肿瘤细胞对应的硒浓度值，如表3所示。同时和DOX对比，可以看出，以硒计算，两种具有相当的抗肿瘤效果，甚至比DOX具有更低的IC₅₀，意味着具有更高的抗肿瘤活性，表明聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子在抗肿瘤领域具有广阔的前景。

表3.实施例1～4制备的四种聚合物对应不同细胞的IC₅₀值(以硒和DOX浓度计算)

Polymers	Se％	4T1(μg/mL)	A549(μg/mL)	CT26(μg/mL)	Hela(μg/mL)
						PSeSeTMC839	24.9	1.07	1.74	0.87	0.87
PSeSeTMC646	18.9	1.02	1.51	0.87	0.98
						PSeSeTMC459	11.2	0.85	1.18	0.68	0.70
PSeSeTMC280	5.6	1.98	3.74	1.09	2.06
						DOX	0	1.41	5.36	6.76	1.40

实施例9

聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的抗肿瘤选择性

按实施例8细胞毒性实验的方式，选择三组正常细胞(LO2-肝细胞，HF-成纤维细胞，MSC-间充质细胞)考察聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子(以实施例3制备的聚合物PSeSeTMC459为考察对象)对正常细胞的毒性，并与癌细胞(Hela-宫颈癌细胞)对比，见图2所示，图2是不同浓度的聚双硒碳酸酯共聚物纳米粒子对癌细胞和正常细胞的毒性示意图，可以发现，在三个不同浓度下，癌细胞的存活率显著低于正常细胞，特别是浓度为6μg/mL时，约有50％的癌细胞死亡，而其他三个正常细胞均保持很高的存活率，说明聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的抗肿瘤具有一定的选择性，即选择性的杀死肿瘤细胞，而对正常细胞的毒性较小。

实施例10

聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子抗肿瘤的耐药性

选择乳腺癌细胞(MCF-7)和乳腺癌耐药性细胞(MCF-7/ADR)，采用实施例8的方式分别测定聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子(以实施例3制备的聚合物PSeSeTMC459为考察对象)对这两种细胞的毒性，然后计算得出IC₅₀，通过以下公式计算耐药指数，结果如表4所示。

耐药指数＝IC50_MCF-7/ADR/IC50_MCF-7

其中，IC50_MCF-7/ADR为药物对乳腺癌耐药性细胞的半致死浓度，IC50_MCF-7为药物对乳腺癌细胞的半致死浓度。

由表4可知，聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子对乳腺癌细胞(MCF-7)和乳腺癌耐药性细胞(MCF-7/ADR)均具有良好的抗肿瘤效果，其耐药指数仅为1.18，可以显著杀死耐药性细胞，而DOX对乳腺癌耐药性细胞的抗肿瘤效果明显下降，在所测试的浓度范围内(0.1-20μg/mL)细胞均保持了85％以上的存活率，基本对MCF-7/ADR失去杀伤力，其耐药指数(>6.06)也显著大于聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子。由此可知，聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子作为抗肿瘤药物可显著杀死耐药性细胞，若与化疗药物联用可大大降低化疗药物的副作用，从而减轻治疗患者的痛苦，未来具有广阔的应用前景。

表4.聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子和阿霉素的耐药指数

Sample	IC50<sub>MCF-7</sub>	IC50<sub>MCF-7/ADR</sub>	耐药指数
				PSeSeTMC459	5.1	6.0	1.18
DOX	3.36	>20	>6.06

实施例11

聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的抗肿瘤机理

聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的抗肿瘤活性可能与活性氧(ROS)的上调有关，因此，测定了癌细胞和聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子培养后ROS的变化。具体选取实施例3制备的聚合物PSeSeTMC459为考察对象研究聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的抗肿瘤机理。

ROS探针的稀释：按照1:1000的比例用无血清的DMEM稀释DCFH-DA，使其最终浓度为10μmol/L。阳性对照组加入活性氧阳性对照(Rousp)，孵育20-30min。在6孔板中，接种5×10⁵个Hela或者HF细胞，加入3mL DMEM(10％FBS)，5％CO₂，37℃培养24h。随后改用浓度为3μg/mL、6μg/mL及12μg/mL的PSeSeTMC459纳米粒子的培养基3mL，接着培养24h。细胞Hela收集后悬浮于配置好的DCFH-DA中，37℃下孵育20min。每隔一定的时间(3-5min)倒置混匀一下，保证DCFH-DA和Hela细胞最大可能接触，随后用DMEM漂洗细胞，重复三次，为了能够有效除去没有进入细胞内的DCFH-DA，取一定量Hela细胞用流式细胞仪分析，结果如图3所示，图3是不同浓度的聚双硒碳酸酯共聚物纳米粒子对癌细胞和正常细胞产生ROS的情况示意图。

从图3中可以看到，聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子会显著提高癌细胞内ROS的含量，且随着浓度的增加，ROS的量不断增加，说明聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子通过调控细胞内ROS含量的上升从而起到抗肿瘤的效果。与正常细胞相比，在同样的浓度下，ROS升高幅度较小，这与毒性的结果一致。因此聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的抗肿瘤是材料诱导胞内产生过量的ROS导致的，而正常细胞和癌细胞诱导ROS上调的选择性导致了抗肿瘤的选择性。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用；

其中，所述双硒碳酸酯聚合物具有下式所示重复单元：

式中，P为20～450的整数；m为1～40的整数；n为10～200的整数。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其中，P为45～113，m为2～20，n为30～100，分子量分布指数为1～2。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，其中所用的聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子的粒径为70nm～100nm。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，其中所述聚双硒碳酸酯聚合物纳米粒子由主要步骤如下的制备方法制得：

将聚双硒碳酸酯聚合物溶于有机溶剂中，逐滴滴加到双蒸水中搅拌，然后透析，隔段时间换水，通过冷冻干燥技术除去水溶剂，得到目标纳米粒子；

其中，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃，所述的聚双硒碳酸酯聚合物由主要步骤如下的制备方法制得：

在氩气保护下，将摩尔比为1:(1～40):(10～200)的聚乙二醇单甲醚、大环双硒碳酸酯单体和三亚甲基碳酸酯单体混合抽真空，加入脂肪酶和干燥的溶剂，在50℃～90℃条件下开环聚合反应12h～144h，得到目标聚合物；

其中，所述的脂肪酶为Novozym435酶，其与单体质量比为(0.02～0.40)：1；所述的溶剂为无水甲苯，用量为每克单体需4mL～20mL；

其中，所述单体是大环双硒碳酸酯和三亚甲基碳酸酯。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，其中所述聚乙二醇单甲醚的数均分子量为1,000～20,000；

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述的肿瘤为乳腺癌、肺癌、结肠癌或宫颈癌。