CN109731140A - 一种长效基因表达细胞支架及其制备方法 - Google Patents

一种长效基因表达细胞支架及其制备方法 Download PDF

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CN109731140A CN201811610332.6A CN201811610332A CN109731140A CN 109731140 A CN109731140 A CN 109731140A CN 201811610332 A CN201811610332 A CN 201811610332A CN 109731140 A CN109731140 A CN 109731140A
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贾翠英
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Abstract

本发明公开了一种长效基因表达细胞支架，包括包含数个磁小体的非病毒载体超顺磁颗粒、细胞因子表达质粒和复合蛋白，所述细胞因子表达质粒与所述超顺磁颗粒混合后，再包被所述复合蛋白，所述复合蛋白包括可逃逸机体免疫攻击、可被细胞降解代谢的明胶；其制备方法，本发明先将细胞因子表达质粒与超顺磁颗粒混合形成超顺磁颗粒加载表达质粒，再在其外层用可被细胞降解利用的含有明胶的复合蛋白进行包被，制得的细胞支架同源性好、更具长期缓释；采用的复合蛋白形成水凝胶的杂合体比单纯的胶原蛋白和硫酸软骨素具有更强的机械耐受性；在被软骨细胞转化为软骨基质过程中,该细胞支架具备更好的机械耐受性和更长期诱导细胞的代谢活力。

Description

一种长效基因表达细胞支架及其制备方法
技术领域
本发明是涉及一种负载细胞因子表达质粒的长效基因表达细胞支架及其制备方法。
背景技术
细胞支架，也称为组织工程支架材料，是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的不同组织，并根据具体替代组织具备的功能的材料。为了使种子细胞增殖和分化，需要提供一个由生物可溶性材料所构成的细胞支架，细胞支架材料相当于人工细胞外基质。组织工程支架材料包括：骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官，如肝、脾、肾、膀胱等的组织支架材料，是治疗各种慢性软组织疾病的有效手段，其应用前景广阔。
关节软骨能减少相邻两骨间的摩擦，减少组织损伤，使运动系统耐久性不可缺失的部分。一方面随着动物年龄的增长，软骨细胞衰退，软骨的组织更新跟不上磨损，发生软骨组织的损伤与缺损，是关节炎发生的主要机制。另一方面有些运动损伤软骨组织或者外伤引起的软骨损伤也是关节炎发生的重要机制。关节腔清创术，微骨折术等只能暂时减轻或者缓解症状，不能有效地促进软骨组织的修复再生。而现在软骨细胞移植形成的水凝胶结构不稳定，随着时间的推移，容易被机械力破坏或者发生生物降解。因此形成稳定长期的类软骨结构，在过渡形成新的成熟软骨组织对软骨再生技术革新具有重要的临床意义。
近年来，组织工程学不断发展，细胞治疗技术日新月异，用于软骨再生的细胞因子的研究已经很成熟，细胞的体外实验也都有了很好的实验成果。但是，在临床上对于关节炎的治疗却遇到了很多瓶颈的问题。比如，细胞支架的不稳定、细胞支架中残留物对人体的危害、治疗后易复发等种种问题。这主要是由于现有方法所制的软骨细胞支架的机械性和生物可利用性较差，致使细胞因子类的药物的包裹层易被破坏、药物释放时间短和释放量不稳定，较短的药效致使治疗后易复发等问题的出现，而且药物的包裹层不能够被人体完全吸收，残留于人体内会造成二次伤害，以上多种原因致使目前的载药细胞支架技术在临床应用于关节炎的治疗上效果并不理想。
细胞支架对构成材料的要求很高，主要有两大类，一类是人工合成材料，一类是天然生物材料，与人工合成材料相比，天然生物材料的优势在于其直接取自生物体内，有良好的生物相容性和生物可降解性；此外，天然生物材料本身类似于细胞外基质的结构，可促进细胞粘附、增殖和分化；现有技术中，用于载药细胞支架的药物包裹层的天然生物材料较多，包括丝素蛋白、胶原蛋白、蜗牛粘蛋白、甾醇、卵磷脂等；另一方面，在骨缺损修复过程中，细胞因子的作用尤为重要，但直接将其注入患者患处使用存在着费用昂贵、半衰期段，需反复应用、容易引起免疫反应等问题。因此，如何将基因表达质粒转入患处进入细胞，并可持续稳定形成一定浓度的细胞因子，进而促进成骨作用，对本领技术发展将具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题和需求，本发明的目的是提供一种长效基因表达细胞支架及其制备方法，可将基因表达质粒转入患处进入细胞，并可持续稳定形成一定浓度的细胞因子，进而促进成骨作用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种长效基因表达细胞支架，包括超顺磁颗粒、细胞因子表达质粒和复合蛋白，所述超顺磁颗粒为非病毒载体且包括数个磁小体，所述细胞因子表达质粒与所述超顺磁颗粒混合形成超顺磁颗粒加载表达质粒，所述超顺磁颗粒加载表达质粒外层包被所述复合蛋白，所述复合蛋白包括可逃逸机体免疫攻击、可被细胞降解代谢的明胶。
作为优选方案，所述细胞因子表达质粒包括能够表达出碱性成纤维bFGF、转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3和BMP-2中一种或多种的细胞因子表达质粒。
作为进一步优选方案，所述细胞因子表达质粒能够表达出的碱性成纤维bFGF、转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3或BMP-2的浓度范围为0-2mg/ml。
作为进一步优选方案，所述细胞因子表达质粒包括质粒exp-bFGF或质粒exp-BMP中的一种或两种。
作为优选方案，所述磁小体为直接或间接产生磁性的物质，所述磁小体包括但不限于氧化铁、铁、镍、钴及其合金。
作为优选方案，所述复合蛋白包括不同浓度的I型胶原、II型胶原、III型胶原、明胶、硫酸软骨素、透明质酸、聚乳酸及其衍生物中一种或多种，所述复合蛋白是以明胶或者胶原为主的复合物，在人体内具有同源性和免疫原性低的特点。
本发明还提供上述任意一种长效基因表达细胞支架的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1：制备纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒
S1.1：将葡聚糖、氯化亚铁、氯化铁按质量比40∶1∶2.7混合，在60℃条件下反应1h,添加适量的氨水,反应产物12000×g离心15min,取上清,用滤膜过滤，制得纳米级磁小体；
S1.2：将等质量的多聚赖氨酸与上述制得的纳米级磁小体混合，超声震荡1h后，12000×g离心5min,去除上清,用浓度为150mmol/L的NaCl溶液洗涤后重悬，再用磁铁诱导纳米级磁小体30分钟至2小时，纳米级磁小体聚集成团并成为顺磁结构，得到葡聚糖修饰的纳米级超顺磁颗粒，即pll-DCIONP；
S1.3：在pH值为3～5的条件下,将步骤S1.2制得的pll-DCIONP与质粒exp-bFGF或者质粒exp-BMP以质量比1∶1混合,在4℃条件下放置1h以上，得到pll-DCIONP-bFGF/BMP2纳米磁性载体，即为纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒；
S2：在纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒外包被复合蛋白
在步骤S1制得的纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒外再包被一层可被细胞利用、具有软骨诱导作用的胶原物质制成的复合蛋白；
S2.1：先取2.5g的明胶粉剂、0.5g的硫酸软骨素粉剂和25mg的透明质酸钠加入40ml双蒸水中于30℃条件下搅拌至完全溶解制得混合液C，之后用0.2μm针式滤器进行过滤除菌处理，得到复合蛋白溶液；
S2.2：将60ml的无菌植物油和1ml的Span80混合并预热至60℃，然后缓慢滴入预热至60℃的所述复合蛋白溶液，并采用电动搅拌机500-900r/min的转速搅拌均匀，乳化时间10-15min，形成复合蛋白的稳定乳液；
S2.3：将步骤S1中制得的纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒与制得的复合蛋白的稳定乳液按照混合比1:3v/v的比例混合，得到混合乳液；
S2.4：将步骤S2.3得到混合乳液冰浴冷却至5℃以下，此过程持续电动搅拌机以500-900r/min的转速搅拌，然后加入30ml预冷丙酮搅拌至40min后电动搅拌机停止搅拌，再经高速离机分离处理出微球后用蒸馏水反复清洗微球，最后将微球冻干处理，即完成明胶-硫酸软骨素–透明质酸钠包被细胞因子表达质粒的长效基因表达细胞支架的制备。
作为优选方案，在步骤S2.2之后，还进行以下操作步骤：
S2.2.1：将mTG溶解于PBS中，制得酶浓度达10％(W/V)的mTG溶液，将mTG溶液经过滤除菌处理后备用；
S2.2.2：将步骤S2.2制得的复合蛋白的稳定乳液与步骤S2.2.1制得的mTG溶液按照1克：10个酶活力单位的比例混合。
作为优选方案，步骤S2.4中，在混合乳液冰浴冷却至5℃以下5min后，在混合乳液加入1ml 25％的戊二醛溶液进行交联固化处理60min，然后再加入30ml过冷丙酮及后续处理；本步骤进行交联固化处理采用的戊二醛溶液还可以替换成其他交联剂，其他交联剂包括TG酶，聚乳酸，聚乙酸，环氧类化合物，戊二醛等；不经过交联固化处理的长效基因表达细胞支架同样能够具有较强的机械耐受性和生物可利用性，保护所载质粒通过表达实现细胞因子的长期缓释性，同时具有简化流程、节约成本的优点；经过交联固化处理的长效基因表达细胞支架，可使长效基因表达细胞支架的微粒体相对于不经过交联固化处理的体积会减小15％左右，其微粒体更结实，不易分解，具有更好的长期缓释性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明先将细胞因子表达质粒与超顺磁颗粒混合形成超顺磁颗粒加载表达质粒，再在其外层用可被细胞降解利用的含有明胶的复合蛋白进行包被，制得的长效基因表达细胞支架可现实细胞因子1年以上的长期缓释，相较于现有直接载细胞因子的细胞支架1-2个月的缓释期，其稳定长期缓释更显著；本发明采用游离表达系统，对于本体基因没有修改，这样会使此表达更加安全可靠；在应用时，复合蛋白形成水凝胶的杂合体比单纯的胶原蛋白和硫酸软骨素具有更强的机械耐受性；采用的复合蛋白中的胶原蛋白具有软骨基质的同源性可以保护细胞支架形成的类软骨组织免受机体免疫系统和酶系统的攻击；在长效基因表达细胞支架被软骨细胞消化转化为软骨基质的过程中，细胞因子表达质粒不断表达释放出诱导软骨的细胞因子进而加速形成机体自身的软骨基质，从而延长了药物缓释期，同时，使形成的类软骨组织的具有更好的机械耐受性和细胞代谢活力更好。
附图说明
图1为本发明实施例提供的一种长效基因表达细胞支架结构示意图；
图2为本发明实施例提供的磁小体的结构示意图；
图3为本发明实施例提供的超顺磁颗粒的结构示意图；
图4为本发明实施例提供的超顺磁颗粒加载表达质粒的结构示意图；
图5为本发明实施例提供的将长效基因表达细胞支架注射进入关节腔初始时期的原理示意图；
图6为本发明实施例提供的将长效基因表达细胞支架注射进入关节腔3个月后被消化、进入细胞并持续表达细胞因子促软骨组织成熟的原理示意图；
图7为本发明实施例提供的将长效基因表达细胞支架注射进入关节腔12个月后被代谢并持续表达细胞因子促软骨组织成熟的原理示意图；
图8为本发明实施例提供的长效基因表达细胞支架的电镜图。
图中标号示意如下：1、磁小体；2、超顺磁颗粒；3、超顺磁颗粒加载表达质粒；4、明胶包被后的超顺磁表达系统；5、成软骨细胞；6、初生软骨组织；7、消化中的细胞支架；8、消化后可表达的细胞支架；9、进入细胞并进行细胞因子表达的细胞支架；10、形成中的软骨组织；11、成熟的软骨组织。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细描述。
实施例
结合图1至图8所示，本实施例提供的一种长效基因表达细胞支架，包括由数个磁小体1构成的非病毒载体的超顺磁颗粒2、细胞因子表达质粒和复合蛋白，所述细胞因子表达质粒与所述超顺磁颗粒2混合形成超顺磁颗粒加载表达质粒3，所述超顺磁颗粒加载表达质粒3可形成一定浓度的细胞因子从而指导细胞分化与生长，所述超顺磁颗粒加载表达质粒3外层包被所述复合蛋白，所述复合蛋白包括可逃逸机体免疫攻击、可被细胞降解代谢的明胶，复合明胶具有逃逸自体免疫攻击的性能，超顺磁颗粒加载表达质粒3通过复合蛋白包被可延长的作用时间，具有更长的细胞因子缓释功能；所述磁小体1为直接或间接产生磁性的物质，所述磁小体1包括但不限于氧化铁、铁、镍、钴及其合金。
在本实施例中，所述细胞因子表达质粒包括能够表达出碱性成纤维bFGF、转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3和BMP-2中一种或多种的细胞因子表达质粒；所述细胞因子表达质粒能够表达出的碱性成纤维bFGF、转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3或BMP-2的浓度范围为0-2mg/ml；作为优选，所述细胞因子表达质粒包括质粒exp-bFGF或质粒exp-BMP中的一种或多种。
在本实施例中，所述复合蛋白包括不同浓度的I型胶原、II型胶原、III型胶原、明胶、硫酸软骨素、透明质酸、聚乳酸及其衍生物中一种或多种，所述复合蛋白是以明胶或者胶原为主的复合物，在人体内具有同源性和免疫原性低的特点。
在本实施例中，所述质粒exp-BMP的基因序列为：
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTATGGTGGCCGGGACCCGCTGTCTTCTAGCGTTGCTGCTTCCCCAGGTCCTCCTGGGCGGCGCGGCTGGCCTCGTTCCGGAGCTGGGCCGCAGGAAGTTCGCGGCGGCGTCGTCGGGCCGCCCCTCATCCCAGCCCTCTGACGAGGTCCTGAGCGAGTTCGAGTTGCGGCTGCTCAGCATGTTCGGCCTGAAACAGAGACCCACCCCCAGCAGGGACGCCGTGGTGCCCCCCTACATGCTAGACCTGTATCGCAGGCACTCAGGTCAGCCGGGCTCACCCGCCCCAGACCACCGGTTGGAGAGGGCAGCCAGCCGAGCCAACACTGTGCGCAGCTTCCACCATGAAGAATCTTTGGAAGAACTACCAGAAACGAGTGGGAAAACAACCCGGAGATTCTTCTTTAATTTAAGTTCTATCCCCACGGAGGAGTTTATCACCTCAGCAGAGCTTCAGGTTTTCCGAGAACAGATGCAAGATGCTTTAGGAAACAATAGCAGTTTCCATCACCGAATTAATATTTATGAAATCATAAAACCTGCAACAGCCAACTCGAAATTCCCCGTGACCAGACTTTTGGACACCAGGTTGGTGAATCAGAATGCAAGCAGGTGGGAAAGTTTTGATGTCACCCCCGCTGTGATGCGGTGGACTGCACAGGGACACGCCAACCATGGATTCGTGGTGGAAGTGGCCCACTTGGAGGAGAAACAAGGTGTCTCCAAGAGACATGTTAGGATAAGCAGGTCTTTGCACCAAGATGAACACAGCTGGTCACAGATAAGGCCATTGCTAGTAACTTTTGGCCATGATGGAAAAGGGCATCCTCTCCACAAAAGAGAAAAACGTCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACGCCTTAAGTCCAGCTGTAAGAGACACCCTTTGTACGTGGACTTCAGTGACGTGGGGTGGAATGACTGGATTGTGGCTCCCCCGGGGTATCACGCCTTTTACTGCCACGGAGAATGCCCTTTTCCTCTGGCTGATCATCTGAACTCCACTAATCATGCCATTGTTCAGACGTTGGTCAACTCTGTTAACTCTAAGATTCCTAAGGCATGCTGTGTCCCGACAGAACTCAGTGCTATCTCGATGCTGTACCTTGACGAGAATGAAAAGGTTGTATTAAAGAACTATCAGGACATGGTTGTGGAGGGTTGTGGGTGTCGCTAGCCCGACCTCGCCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCAC(Seq ID NO.1)。
在本实施例中，所述质粒exp-bFGF的基因序列为：
GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTATGGCTGCTGGTAGTATTACCACTCTGCCGGCACTGCCGGAAGATGGTGGTAGCGGTGCGTTCCCGCCGGGCCACTTCAAGGACCCCAAGCGGCTGTACTGCAAGAACGGGGGCTTCTTCCTGCGCATCCACCCCGACGGCCGAGTGGACGGGGTCCGCGAGAAGAGCGACCCACACATCAAACTACAACTTCAAGCAGAAGAGAGAGGGGTTGTGTCTATCAAAGGAGTGTGTGCAAACCGTTACCTTGCTATGAAAGAAGATGGAAGATTACTAGCTTCTAAATGTGTTACAGACGAGTGTTTCTTTTTTGAACGATTGGAGTCTATAACTACAATACTTACCGGTCAAGGAAATACACCAGCTGGTATGTGGCACTGAAACTAACTGGGCAATATAAACTTGGATCCAAAACAGGACCTGGGCAGAAAGCTATACTTTTTCTTCCAATGTCTGCTAAGAGCTGAAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCAC(Seq ID NO.2)。
本实施例还提供一种上述的长效基因表达细胞支架的制备方法，具体包括以下步骤：
S1：制备纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒
S1.1：将葡聚糖、氯化亚铁、氯化铁按质量比40∶1∶2.7混合，在60℃条件下反应1h,添加适量的氨水,反应产物12000×g离心15min,取上清,用滤膜过滤，制得纳米级磁小体1；
S1.2：将等质量的多聚赖氨酸与上述制得的纳米级磁小体1混合，超声震荡1h后，12000×g离心5min,去除上清,用浓度为150mmol/L的NaCl溶液洗涤后重悬，再用磁铁诱导纳米级磁小体30分钟至2小时，纳米级磁小体1聚集成团并成为顺磁结构，得到葡聚糖修饰的纳米级超顺磁颗粒2，即pll-DCIONP；
S1.3：在pH值为3～5的条件下,将步骤S1.2制得的pll-DCIONP与质粒exp-bFGF或者质粒exp-BMP以质量比1∶1混合,在4℃条件下放置1h以上，得到pll-DCIONP-bFGF/BMP2纳米磁性载体，即为纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒3；
S2：在纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒外包被复合蛋白
在步骤S1制得的纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒3外再包被一层可被细胞利用、具有软骨诱导作用的胶原物质制成的复合蛋白；
S2.1：先取2.5g的明胶粉剂、0.5g的硫酸软骨素粉剂和25mg的透明质酸钠加入40ml双蒸水中于30℃条件下搅拌至完全溶解制得混合液C，之后用0.2μm针式滤器进行过滤除菌处理，得到复合蛋白溶液；在本实施例中，所述明胶粉剂和所述硫酸软骨素粉剂采用美国Sigma-Aldrich公司(美国西格玛奥德里奇公司)生产的明胶粉剂和硫酸软骨素粉剂；
S2.2：将60ml的无菌植物油和1ml的Span80混合并预热至60℃，然后缓慢滴入预热至60℃的所述复合蛋白溶液，并采用电动搅拌机500-900r/min的转速搅拌均匀，乳化时间10-15min，形成复合蛋白的稳定乳液；
S2.2.1：将mTG溶解于PBS中，制得酶浓度达10％(W/V)的mTG溶液，将mTG溶液经过滤除菌处理后备用；
S2.2.2：将步骤S2.2制得的复合蛋白的稳定乳液与步骤S2.2.1制得的mTG溶液按照1克：10个酶活力单位的比例混合，即每毫升4％复合蛋白的稳定乳液添加40μL 10％的mTG溶液；
S2.3：将步骤S1中制得的纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒3与混合有mTG的复合蛋白的稳定乳液按照混合比1:3v/v的比例混合，得到混合乳液；
S2.4：将步骤S2.3得到混合乳液冰浴冷却至5℃以下，此过程持续电动搅拌机以500-900r/min的转速搅拌，然后加入30ml预冷丙酮搅拌至40min后电动搅拌机停止搅拌，再经高速离机分离处理出微球后用蒸馏水反复清洗微球，最后将微球冻干处理，即完成明胶-硫酸软骨素–透明质酸钠包被细胞因子表达质粒的长效基因表达细胞支架的制备。
作为优选方案，在本实施例中，步骤S2.4中，在混合乳液冰浴冷却至5℃以下5min后，在混合乳液加入1ml 25％的戊二醛溶液进行交联固化处理60min，然后再加入30ml过冷丙酮及后续处理；本步骤进行交联固化处理采用的戊二醛溶液还可以替换成其他交联剂，其他交联剂包括TG酶，聚乳酸，聚乙酸，环氧类化合物，戊二醛等；不经过交联固化处理的长效基因表达细胞支架同样能够具有较强的机械耐受性和生物可利用性，保护所载质粒通过表达实现细胞因子的长期缓释性，同时具有简化流程、节约成本的优点；经过交联固化处理的长效基因表达细胞支架，可使长效基因表达细胞支架的微粒体相对于不经过交联固化处理的体积会减小15％左右，其微粒体更结实，不易分解，具有更好的长期缓释性。
本实施例所述长效基因表达细胞支架的使用方法如下：
1、制备脐血干细胞：
采用人脐血间充质干细胞做细胞种子，将其用含体积分数为10％胎牛血清、体积分数为1％双抗的低糖细胞培养基DMEM培养液，以3×108L-1的细胞浓度接种至细胞培养瓶中进行培养传代，得到脐血来源间充质干细胞；
用胰酶对得到的脐血来源间充质干细胞进行处理后，采用生理盐水离心洗涤2次，之后，用MSC Attachment medium重悬细胞，调整细胞密度至1.6×1010L-1，形成微团后，加入1.0mL～2.0mL的软骨诱导培养基并每两至三天进行换液一次，进行诱导培养14天，制得脐血干细胞溶液。
2、将上述制得的长效基因表达细胞支架注入患处：
将0.025g的6-硫酸软骨素和0.125g的明胶溶解于2ml的PBS缓冲液中，然后加入0.05g的上述制得的包被有基因表达体系质粒的长效基因表达细胞支架、1ml的1％的玻璃酸钠与40U的mTG酶的混合液，再加入1ml的诱导过的细胞浓度为2×107L-1成软骨细胞5、1ml的细胞浓度为2×107L-1的上述制得的脐血干细胞溶液，混合均匀后注射入相应关节炎模型实验动物或者人体的关节炎的关节腔内。
如图5-图7所示，将本发明所述长效基因表达细胞支架即明胶包被后的超顺磁表达系统4注入动物或者人体内后，分布于初生软骨组织6周围，随着明胶被细胞不断降解代谢形成不具有完整复合蛋白层的消化中的细胞支架7，之后，超顺磁颗粒加载表达质粒3进入细胞内，不断表达形成细胞因子促进软骨形成(如图6中形成中的软骨组织10)；本发明长效基因表达细胞支架制作费用低，通过一次注入获得更长时间的治疗，减少注射次数和免疫反应，包被基因表达体系质粒的长效基因表达细胞支架，具有更长久、稳定的细胞因子调控缓释功能；在本实施中，超顺磁颗粒加载表达质粒3通过复合蛋白包装后的形成的具备长效诱导表达载体的细胞支架，通过高分辨率场发射扫描电镜电子显微镜形成显微图，每个明胶包被后的超顺磁表达系统4即明胶微球的大小在20μm-50μm之间，可包被2nm-5nm的超顺磁颗粒加载表达质粒3，其大小可以通过注射器和细胞治疗其它成分一同注入关节囊，在关节囊内形成细胞支架。
综上所诉可见：本发明先将细胞因子表达质粒与超顺磁颗粒2混合形成超顺磁颗粒加载表达质粒3，再在其外层用可被细胞降解利用的含有明胶的复合蛋白进行包被，制得的长效基因表达细胞支架可现实细胞因子1年以上的长期缓释，相较于现有直接载细胞因子的细胞支架1-2个月的缓释期，其稳定长期缓释更显著；本发明采用游离表达系统，对于本体基因没有修改，这样会使此表达更加安全可靠；在应用时，复合蛋白形成水凝胶的杂合体比单纯的胶原蛋白和硫酸软骨素具有更强的机械耐受性；采用的复合蛋白中的胶原蛋白具有软骨基质的同源性可以保护细胞支架形成的类软骨组织免受机体免疫系统和酶系统的攻击；在长效基因表达细胞支架被软骨细胞消化转化为软骨基质的过程中，细胞因子表达质粒不断表达释放出诱导软骨的细胞因子进而加速形成机体自身的软骨基质，从而延长了药物缓释期，同时，形成的软骨组织的机械耐受性和代谢活力更好。
最后有必要在此指出的是：以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海北陆医药科技有限公司
<120> 一种长效基因表达细胞支架及其制备方法
<130> L18110217F
<141> 2018-12-27
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1851
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa 540
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctatggtg gccgggaccc 600
gctgtcttct agcgttgctg cttccccagg tcctcctggg cggcgcggct ggcctcgttc 660
cggagctggg ccgcaggaag ttcgcggcgg cgtcgtcggg ccgcccctca tcccagccct 720
ctgacgaggt cctgagcgag ttcgagttgc ggctgctcag catgttcggc ctgaaacaga 780
gacccacccc cagcagggac gccgtggtgc ccccctacat gctagacctg tatcgcaggc 840
actcaggtca gccgggctca cccgccccag accaccggtt ggagagggca gccagccgag 900
ccaacactgt gcgcagcttc caccatgaag aatctttgga agaactacca gaaacgagtg 960
ggaaaacaac ccggagattc ttctttaatt taagttctat ccccacggag gagtttatca 1020
cctcagcaga gcttcaggtt ttccgagaac agatgcaaga tgctttagga aacaatagca 1080
gtttccatca ccgaattaat atttatgaaa tcataaaacc tgcaacagcc aactcgaaat 1140
tccccgtgac cagacttttg gacaccaggt tggtgaatca gaatgcaagc aggtgggaaa 1200
gttttgatgt cacccccgct gtgatgcggt ggactgcaca gggacacgcc aaccatggat 1260
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taagcaggtc tttgcaccaa gatgaacaca gctggtcaca gataaggcca ttgctagtaa 1380
cttttggcca tgatggaaaa gggcatcctc tccacaaaag agaaaaacgt caagccaaac 1440
acaaacagcg gaaacgcctt aagtccagct gtaagagaca ccctttgtac gtggacttca 1500
gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc ttttactgcc 1560
acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat gccattgttc 1620
agacgttggt caactctgtt aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac 1680
tcagtgctat ctcgatgctg taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc 1740
aggacatggt tgtggagggt tgtgggtgtc gctagcccga cctcgcctct ggctaataaa 1800
ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca c 1851
<210> 2
<211> 1234
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa 540
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctatggct gctggtagta 600
ttaccactct gccggcactg ccggaagatg gtggtagcgg tgcgttcccg ccgggccact 660
tcaaggaccc caagcggctg tactgcaaga acgggggctt cttcctgcgc atccaccccg 720
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cagaagagag aggggttgtg tctatcaaag gagtgtgtgc aaaccgttac cttgctatga 840
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aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta 1140
aacgggtctt gaggggtccc gacctcgacc tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt 1200
gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc tcac 1234

Claims (10)

1.一种长效基因表达细胞支架，包括超顺磁颗粒、细胞因子表达质粒和复合蛋白，所述超顺磁颗粒为非病毒载体且包括多个磁小体，所述细胞因子表达质粒与所述超顺磁颗粒混合形成超顺磁颗粒加载表达质粒，所述超顺磁颗粒加载表达质粒外层包被所述复合蛋白，所述复合蛋白包括可逃逸机体免疫攻击、可被细胞降解代谢的明胶。
2.根据权利要求1所述的长效基因表达细胞支架，其特征在于：所述细胞因子表达质粒包括能够表达出碱性成纤维bFGF、转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3和BMP-2中一种或多种的细胞因子表达质粒。
3.根据权利要求2所述的长效基因表达细胞支架，其特征在于：所述细胞因子表达质粒能够表达出的碱性成纤维bFGF、转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3或BMP-2的浓度范围为0-2mg/ml。
4.根据权利要求2所述的长效基因表达细胞支架，其特征在于：所述细胞因子表达质粒包括质粒exp-bFGF或质粒exp-BMP中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的长效基因表达细胞支架，其特征在于：所述磁小体为直接或间接产生磁性的物质。
6.根据权利要求5所述的长效基因表达细胞支架，其特征在于：所述磁小体包括但不限于氧化铁、铁、镍、钴及其合金。
7.根据权利要求1所述的长效基因表达细胞支架，其特征在于：所述复合蛋白包括不同浓度的I型胶原、II型胶原、III型胶原、明胶、硫酸软骨素、透明质酸、聚乳酸及其衍生物中一种或多种。
8.一种长效基因表达细胞支架的制备方法，其特征在于：权利要求1-7任一一种所述的长效基因表达细胞支架通过下述方法制得，具体包括以下步骤：
S1：制备纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒
S1.1：将葡聚糖、氯化亚铁、氯化铁按质量比40∶1∶2.7混合，在60℃条件下反应1h,添加适量的氨水,反应产物12000×g离心15min,取上清,用滤膜过滤，制得纳米级磁小体；
S1.2：将等质量的多聚赖氨酸与上述制得的纳米级磁小体混合，超声震荡1h后，12000×g离心5min,去除上清,用浓度为150mmol/L的NaCl溶液洗涤后重悬，再用磁铁诱导纳米级磁小体30分钟至2小时，纳米级磁小体聚集成团并成为顺磁结构，得到葡聚糖修饰的纳米级超顺磁颗粒；
S1.3：在pH值为3～5的条件下,将步骤S1.2制得的葡聚糖修饰的纳米级超顺磁颗粒与质粒exp-bFGF或者质粒exp-BMP以质量比1∶1混合,在4℃条件下放置1h以上，得到纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒；
S2：在纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒外包被复合蛋白
在步骤S1制得的纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒外再包被一层可被细胞利用、具有软骨诱导作用的胶原物质制成的复合蛋白；
S2.1：先取2.5g的明胶粉剂、0.5g的硫酸软骨素粉剂和25mg的透明质酸钠加入40ml双蒸水中于30℃条件下搅拌至完全溶解制得混合液C，之后用0.2μm针式滤器进行过滤除菌处理，得到复合蛋白溶液；
S2.2：将60ml的无菌植物油和1ml的Span80混合并预热至60℃，然后缓慢滴入预热至60℃的所述复合蛋白溶液，并采用电动搅拌机500-900r/min的转速搅拌均匀，乳化时间10-15min，形成复合蛋白的稳定乳液；
S2.3：将步骤S1中制得的纳米级超顺磁颗粒加载表达质粒与制得的复合蛋白的稳定乳液按照混合比1:3v/v的比例混合，得到混合乳液；
S2.4：将步骤S2.3得到混合乳液冰浴冷却至5℃以下，此过程持续电动搅拌机以500-900r/min的转速搅拌，然后加入30ml预冷丙酮搅拌至40min后电动搅拌机停止搅拌，再经高速离机分离处理出微球后用蒸馏水反复清洗微球，最后将微球冻干处理，即完成明胶-硫酸软骨素–透明质酸钠包被细胞因子表达质粒的长效基因表达细胞支架的制备。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：在步骤S2.2之后，还进行以下操作步骤：
S2.2.1：将mTG溶解于PBS中，制得酶浓度达10％(W/V)的mTG溶液，将mTG溶液经过滤除菌处理后备用；
S2.2.2：将步骤S2.2制得的复合蛋白的稳定乳液与步骤S2.2.1制得的mTG溶液按照1克：10个酶活力单位的比例混合，即每毫升4％复合蛋白的稳定乳液添加40μL 10％的mTG溶液。
10.根据权利要求9所述的长效基因表达细胞支架的制备方法，其特征在于：步骤S2.4中，在混合乳液冰浴冷却至5℃以下5min后，在混合乳液加入1ml 25％的戊二醛溶液进行交联固化处理60min，然后再加入30ml过冷丙酮及后续处理。
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