CN109717015A - 一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖及其应用。所述壳寡糖的聚合度为2‑20，脱乙酰度为50％‑80％。所述壳寡糖可通过酶水解低脱乙酰度(脱乙酰度50％‑80％)壳聚糖底物获得，所采用的酶为几丁质酶、壳聚糖酶或具有壳聚糖水解活性的非特异性酶类。相比高脱乙酰度壳寡糖(脱乙酰度>80％)，本发明所述的低脱乙酰度壳寡糖具有更高的促进植物生长活性，可在农作物种植等领域广泛应用。

Description

一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖及其应用

技术领域

本发明属于壳寡糖应用技术领域，具体涉及一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖及其应用。

背景技术

壳寡糖(Chitooligosaccharides，COS)是氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖经β-1,4糖苷键连接形成的聚合度小于20的寡聚物，具有抗炎、抗肿瘤及免疫调节等生物活性。研究显示，壳寡糖的结构，包括聚合度、脱乙酰度及寡糖中的乙酰基位点分布等结构特征在其生物活性发挥中起到决定性作用。传统工艺制备壳聚糖过程中涉及甲壳素的高温强碱脱乙酰，产物壳聚糖只有在脱乙酰度>80％时才具有较好的酸溶解性。因此，现有工业壳聚糖的脱乙酰度通常>80％，壳聚糖中的乙酰基含量较少。以上述壳聚糖为底物制备的壳寡糖的脱乙酰度也>80％，故壳寡糖链上含有的乙酰化单糖组分也相应减少，对应的不同壳寡糖组分种类有限。

利用低温碱法可以实现甲壳素的匀相脱乙酰(Kurita K,Sannan T,IwakuraY.Studies on chitin,.4.Evidence for formation of block and random copolymersof N-acetyl-D-glucosamine and D-glucosamine by heterogeneous and homogeneoushydrolyses[J].Makromolekulare Chemie-Macromolecular Chemistry and Physics,1977,178(12):3197-3202。刘大胜,魏远安,蒋林斌,等.超细甲壳素脱乙酰制备水溶性壳聚糖的研究[J].食品科技,2007,32(9):108-110.)，利用上述方法均可以获得脱乙酰度>50％的低脱乙酰度壳聚糖。由于该类型壳聚糖的糖链上N-乙酰氨基葡萄糖(以下简称A)及氨基葡萄糖(以下简称D)含量均较高，因此可识别A和D的水解酶类，如几丁质酶、壳聚糖酶及具有壳聚糖水解活性的非特异性酶类均可对该类型壳聚糖进行水解，从而获得低脱乙酰度壳寡糖。

发明内容

本发明的目的是，提供一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖及其作为农用肥料的用途，尤其是农作物种植领域的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖，所述壳寡糖的聚合度为2-20，所述壳寡糖的脱乙酰度为50％-80％。

优选地，所述壳寡糖的脱乙酰度为56％-78％。进一步优选地，所述壳寡糖的脱乙酰度为60％-65％，最优选的脱乙酰度为62％。

所述脱乙酰度是指壳寡糖结构中，脱乙酰基链节占总链节的分数。假设壳寡糖的重复结构单元为100个，其中N-乙酰氨基葡糖糖结构单元为22个，氨基葡萄糖结构单元为78个，则对应的脱乙酰度为78％。本文中所述的低脱乙酰度壳寡糖是指脱乙酰度<80％的壳寡糖。

本发明还提供了所述的低脱乙酰度壳寡糖在制备农用肥料中的应用。

优选地，所述农用肥料用于促进植物大麻的生长。

本发明还提供一种农用肥料组合物，该农业肥料组合物含有所述的壳寡糖或所述壳寡糖盐作为活性组分。

优选地，所述农用肥料还包括任选的一种或多种其它农用肥料。

本发明还提供了所述的低脱乙酰度壳寡糖在促进植物生长中的应用。优选地，所述所述植物为大麻。

本发明的农用肥料组合物，除了含有本发明的低脱乙酰度壳寡糖外，进一步含有农用肥料上可接受的载体。这里“农用肥料上可接受的载体”是指农用肥料上接受的材料、成份或介质，如液体或固体填料、稀释剂、辅料、溶剂或封装材料，包括从一个器官或身体的某部分到另一个器官或身体的某部分携带或运输主要农用肥料的试剂。每个载体必须是“可以接受”，能兼容其他形式的农用肥料成分而对植物不造成伤害。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1，通过比较不同脱乙酰度壳寡糖在促进植物生长方面的差异，发明人惊奇地发现，低脱乙酰度(脱乙酰度50％-80％)壳寡糖在促进植物生长方面的活性明显优于高脱乙酰度(脱乙酰度约90％)壳寡糖。

2，本发明涉及的低脱乙酰度壳寡糖具有更好的促进植物生长活性，作为农用肥料能够起到更好的植物促生长效果，在农作物种植领域具有非常好的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例3中不同脱乙酰度壳寡糖在10-160μg/mL浓度范围内促进大麻生长作用的线形图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：不同脱乙酰度壳寡糖制备及组成分析

参考刘大胜等(刘大胜,魏远安,蒋林斌,等.超细甲壳素脱乙酰制备水溶性壳聚糖的研究[J].食品科技,2007,32(9):108-110.)的方法制备低脱乙酰度壳聚糖，具体方法如下：称取超微粉碎后的甲壳素粉末30g，加入到10倍的45％氢氧化钠溶液中，搅拌均匀，然后升温至60℃进行脱乙酰反应2h，反应完毕后离心，沉淀物用60％的乙醇-水混合溶液洗涤至无碱性，干燥后得产品。使用¹H-NMR测定上述制备的壳聚糖及购买的商品壳聚糖的脱乙酰度，根据¹H-NMR图谱确定上述制备的壳聚糖的脱乙酰度为为62％，商品壳聚糖的脱乙酰度为94％。称取制备的低脱乙酰度壳聚糖及购买的高脱乙酰度壳聚糖各10g，分别加至装有200mL1.5％乙酸水溶液的恒温反应釜中，充分搅拌使其完全溶解。调节反应温度至40℃，分别加入100U壳聚糖酶，恒温反应48小时。反应结束后，离心去除不容物，上清经旋转蒸发仪在40℃下浓缩至50-100mL，再经冷冻干燥得成品壳寡糖，依次命名为COS-62(脱乙酰度为62％的壳寡糖)及COS-94(脱乙酰度为94％的壳寡糖)。

实施例2：不同脱乙酰度壳寡糖组成分析

使用MALDI-TOF质谱方法对上述壳寡糖的组分进行鉴定。具体方法为：称取制备的壳寡糖样品COS-62及COS-94，用超纯水配置成浓度为2mg/mL的水溶液，各吸取1μL点样至样品板上，待其自然干燥后，各加入1μL基质2,5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液，待其干燥后使用autoflex Ⅲ smartbeam型MALDI-TOF质谱仪(Bruker公司)进行检测(正离子反射模式)。质谱结果表明：COS-62的寡糖链中含有较多的N-乙酰氨基葡萄糖，而COS-94主要为全脱乙酰的壳寡糖，二者的聚合度均在2-20之间。

实施例3：不同脱乙酰度壳寡糖促进植物大麻生长活性比较

为比较实施例1中制备的不同脱乙酰度壳寡糖(COS-62及COS-94)对植物生长的促进作用，使用拌种方法对大麻进行壳寡糖处理，然后确定其对大麻的促生长作用。具体方法为：称取适量COS-62及COS-94，分别配制如下浓度水溶液：10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL及160μg/mL。将大麻种子置于上述不同壳寡糖溶液中浸泡30min后种植，以水为浸泡的阴性对照。待大麻生长45天后测定不同处理组大麻的平均株高，计算不同处理组与阴性对照组相比的增长率。数据结果参见图1，为COS-62和COS-94在10-160μg/mL浓度范围内相对阴性对照组增长率的线形图。图1结果显示，与未处理组相比，壳寡糖处理组的大麻株高均出现明显增高，COS-94组在浸泡浓度为40μg/mL时促生长效果最明显，增高达25.12％；而COS-62组在浸泡浓度为80μg/mL时促生长效果最明显，增高达54.62％。COS-94不同浓度的增高范围是12.5-25.12％，COS-62不同浓度的增高效果均接近或超过40％。上述结果说明，壳寡糖具有一定的植物促生长活性，且低脱乙酰度壳寡糖比高脱乙酰度壳寡糖具有更好的植物促生长活性。

实施例4不同低脱乙酰度壳寡糖促进植物大麻生长活性比较

进一步在脱乙酰度62％壳聚糖的基础上，参考刘大胜等(刘大胜,魏远安,蒋林斌,等.超细甲壳素脱乙酰制备水溶性壳聚糖的研究[J].食品科技,2007,32(9):108-110.)的方法，在60℃下通过调整脱乙酰反应时间(反应时间分别有1h、6h、12h)，重新制备不同脱乙酰度的壳聚糖，通过1H-NMR确定脱乙酰度。根据1H-NMR图谱数据，确定脱乙酰度分别为56％(脱乙酰反应时间为1h)、70％(脱乙酰反应时间为6h)及78％(脱乙酰反应时间为12h)。参考实施例1中的方法对上述壳聚糖底物进行水解，得到的产物依次记为COS-56，COS-70及COS-78。

将COS-56，COS-70及COS-78，与COS-62一起用于评价不同低脱乙酰度壳寡糖促进植物大麻生长活性，具体参照实施例3的方法。结果表明：与未处理组相比，脱乙酰度56％、62％、70％及78％的壳寡糖组在处理浓度80μg/mL时均明显促进植物大麻生长，大麻增高效果均在35％以上，其中，脱乙酰度62％的壳寡糖具有最好的促进大麻生长效果。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖，其特征在于：所述壳寡糖的聚合度为2-20，所述壳寡糖的脱乙酰度为50％-80％。

2.根据权利要求1所述的一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖，其特征在于：所述壳寡糖的脱乙酰度为56％-78％。

3.根据权利要求1所述的一种具有促进植物生长活性的低脱乙酰度壳寡糖，其特征在于：所述壳寡糖的脱乙酰度为60％-65％。

4.权利要求1-3任一项所述的低脱乙酰度壳寡糖在制备农用肥料中的应用。

5.根据权利要求4所述的低脱乙酰度壳寡糖在制备农用肥料中的应用，其特征在于：所述农用肥料用于促进大麻的生长。

6.一种农用肥料组合物，该组合物含有如权利要求1-3任一项所述的壳寡糖或所述壳寡糖盐作为活性组分。

7.如权利要求6所述的一种农用肥料组合物，其特征在于：所述农用肥料组合物还包括任选的一种或多种其它农用肥料。

8.根据权利要求6所述的农用肥料组合物，所述农用肥料组合物进一步含有农用肥料上可接受的载体。

9.权利要求1-3任一项所述的低脱乙酰度壳寡糖在促进植物生长中的应用。

10.根据权利要求9所述的低脱乙酰度壳寡糖在促进植物生长中的应用，其特征在于：所述植物为大麻。