CN109708996A - 基于手性单壁碳纳米管的粘度探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于手性单壁碳纳米管的粘度探针，在手性单壁碳纳米管表面键合有4‑N，N‑二甲基苯胺基团，依托手性单壁碳纳米管在近红外区域的优异荧光性能，第一次提供了一种基于近红外荧光发射的手性单壁碳纳米管探针，用来检测流体的粘度，特别地，应用于微观生物体内粘度的检测，干扰小，解决了大多数有机小分子并不能在近红外区域发光，弥补近红外区域荧光探针的不足问题。

Description

基于手性单壁碳纳米管的粘度探针及其应用

技术领域：

本发明涉及一种基于手性单壁碳纳米管的粘度探针及其应用。

背景技术：

粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素，同时是流体扩散速率的主要参考指标，粘度探针主要针对宏观大体积的粘稠流体和微环境粘度检测。对微观环境，比如组织、细胞水平的粘度测定，现有方法往往不能达到测试的目的的。而准确测定细胞水平内微环境的粘度又具有非常重要的意义。目前在国际上对粘度探针的研究取得了一些优秀的成果，但仍处于发展的初期。现有的商业化的探针的合成工作量较大，而在医疗诊断及生物荧光成像领域仍然迫切的需求可同时满足光谱性能优良，具有细胞通透性、合成简单，易于产业化的粘度探针。

由于激发态的非辐射衰变可以通过粘度改变，因此荧光分子转子因其在生物环境和材料化学中的广泛应用而受到广泛关注。通常，这种分子的工作机制是基于转子在非粘性或低粘度溶液中自由旋转，通过非辐射过程提供电子激发染料的弛豫。当旋转受到粘性环境的限制时，可以看出分子转子的荧光强度增加。在过去十年中，这种荧光分子转子作为一种有价值的工具，在动脉硬化，阿尔茨海默病等种疾病的研究中发挥了重要作用，这些疾病与扩散行为的异常变化密切相关。其中，基于比率测定的或基于寿命的探针已经在疾病的快速检测中显示出应用的希望。由于近红外区，能有效避开生物体系自发荧光，提高探针的灵敏性，显著提高荧光检测效率，被更多地应用于生物体成像技术。并且，近红外(NIR)区域，特别是第二近红外(NIR-II，1,000至1,700nm)可以深入渗透到组织中并有效地避免生物自发荧光的影响，仍然是生物粘度检测方案的研究方向之一。

手性单壁碳纳米管(SWCNT)是一维(1D)圆柱形纳米材料，在单个维度上产生电子和激子的量子限制。特别是手性单壁碳纳米管表现出超过1μm的特征非常稳定的近红外光致发光，不受流体性质的影响，荧光区域在生物检测窗口中(0.7-1.4μm)。此外，激发和发射带之间的大斯托克斯位移和800nm附近的激发进一步降低了生物环境中自发荧光和散射的背景效应。因此，手性单壁碳纳米管提供了独特的性质，使其非常有效的成为生物分子传感和成像手段。有些报道显示，手性单壁碳纳米管同时可以作为治疗疾病的材料。然而，手性单壁碳纳米管的光子转换效率(光致发光量子产率，Φ)非常低。这是因为无数非辐射“暗”状态的结果促进了纳米管中激发态的有效非辐射弛豫。芳基官能团系统地附着在碳纳米管上可以进一步驱动sp3缺陷能量梯下，并增强纳米管光致发光。共价官能化碳纳米管具有广泛的应用，特别是通过控制sp3缺陷的结合来控制光电特征。到目前为止，还没有关于这种“缺陷诱导”激活纳米管优异荧光性能的探针被报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种基于手性单壁碳纳米管的粘度探针，依托手性单壁碳纳米管在近红外区域的优异荧光性能，第一次提供了一种基于近红外荧光发射的手性单壁碳纳米管探针，解决了大多数有机小分子并不能在近红外区域发光，弥补近红外区域荧光探针的不足问题。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种基于手性单壁碳纳米管的粘度探针，在手性单壁碳纳米管表面键合有4-N，N-二甲基苯胺基团，具有如下结构：

R1为4-N,N二甲基苯胺；R2为手性单壁纳米管，手性指数分别为(6,5)，(7,5)，(8,4)。

所述基于手性单壁碳纳米管的粘度探针的合成方法，该方法包括以下步骤：

1)手性单壁纳米管通过超声处理分散在阴离子表面活性剂水溶液中，然后超速离心纯化，然后分散在阴离子表面活性剂水溶液配置浓度为0.1-1mg/L的手性单壁纳米管溶液；

2)合成4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐：四氟硼酸溶液加入反应容器中，然后在冰浴冷却搅拌下加入1-氨基-4-N，N-二甲基苯胺，然后滴加亚硝酸钠水溶液，反应后过滤，在真空过滤下用乙醚洗涤沉淀的4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐，同时避光。

3)将步骤2)得到的4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐溶解在水中，室温下与等份的步骤1)得到的手性单壁纳米管溶液避光反应，在手性单壁碳纳米管表面键合有4-N，N-二甲基苯胺基团，得到粘度探针，用UVvis-NIR吸收和荧光光谱监测样品。

所述阴离子表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠(SDS)。

4-N，N-二甲基苯胺作为转子，对溶液粘度非常敏感。手性单壁碳纳米管中sp3缺陷位点的化学掺杂有效地产生3个荧光发射通道。在低粘度环境中，探针的3个荧光峰非常弱，但是在高粘度环境中，探针的3个发射出现了不同强度的变化，这种变化可以以比率的形式对粘度响应。

随着溶剂粘度的增加，染料发射强度迅速增加，而且符合关系式，在各发射峰处的强度的比例值与粘度的对数值呈线性变化，也符合关系式，并且能用比率的方法测试化合物所处溶液环境的粘度，可以借此采用比例成像法来检测细胞内粘度的变化。

本发明还保护所述基于手性单壁碳纳米管的粘度探针的应用，用来检测流体的粘度，特别地，应用于微观生物体内粘度的检测。

纳米管长度的小直径组合赋予了其在复杂环境中扩散速率优异。具有轨道跟踪显微镜的单壁碳纳米管可以显示流体体积的空间图，其确定主动传输速度，并计算局部粘度。

本发明的有益效果如下：本发明依托手性单壁碳纳米管在近红外区域的优异荧光性能，第一次提供了一种基于近红外荧光发射的手性单壁碳纳米管探针，用来检测流体的粘度，特别地，应用于微观生物体内粘度的检测，干扰小，解决了大多数有机小分子并不能在近红外区域发光，弥补近红外区域荧光探针的不足问题。

附图说明：

图1是纳米管的结构和纳米管粘度检测的原理；其中，a)纳米管的结构和纳米管粘度检测的原理，b)在非粘性和粘性介质中掺杂纳米管的电子衰变过程的示意图，c)掺杂(6,5)纳米管围绕单键的扭转角对应的HOMO和LOMO状态的势能曲线，当激子返回基态时，激子可以发射光子，从而产生光致发光或通过非辐射跃迁回到基态。

图2是重氮官能化(6,5)纳米管中的荧光光谱变化过程；其中，(a)原始纳米管荧光强度与4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐官能化后纳米管(b)荧光的比较；(c)键合以后纳米管发射光谱随着溶剂粘度增加的变化；(d-f)该过程中纳米管的激发-发射3D变化图。颜色条表示荧光强度的线性比例：白色对应于强荧光发射，而接近0的低荧光强度强度由黑色表示。

图3是对数(I1130nm/I990nm)和logη之间的线性比例关系，以及在560nm处激发的在水和甘油的溶剂中log(I1270nm/I990nm)和logη之间的线性比例关系。

图4是在与4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐反应后，拉曼变化：键合后的纳米管的拉曼紊乱峰(D)强度增加。

图5是SDS对原始纳米管(左)和键合后纳米管(右)荧光光谱的影响。

图6是加入4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐后，每20小时测定纳米管的荧光光谱。

图7是原始纳米管在水中和60％甘油中的荧光光谱。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：基于手性单壁碳纳米管的粘度探针的制备

过程如下：

(1)富含手性的手性指数为(6,5)单壁纳米管(简称原始纳米管)通过在0℃下尖端超声处理单独分散在1wt％SDS的水溶液中2小时，然后超速离心(离心转速为180,000g，20℃,3小时)以除去结合在一起的纳米管和金属杂质。

(2)将纯化的手性指数为(6,5)单壁纳米管用1wt％SDS(十二烷基硫酸钠)的H₂O溶液稀释，在其E11的峰值波长处吸收0.12(使用标准的1-cm路径长度比色皿)，该浓度对应的纳米管浓度约0.66mg/L。

(3)按照以下方法合成4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐：将1.5mL去离子水和1mL四氟硼酸溶液(四氟硼酸溶液在水中含量为48wt％)加入圆底烧瓶中，然后在冰浴圆底烧瓶中冷却。向冷却的圆底烧瓶中加入2mmol 4-N，N-二甲基氨基苯胺，将4.5mmol亚硝酸钠溶于1mL水中并在搅拌下滴加到圆底烧瓶中，反应2小时后，过滤。在真空过滤下用200mL乙醚洗涤沉淀的4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐，同时避光，将得到的盐储存在4℃条件下。

(4)将步骤3)得到的4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸重氮盐溶解在H₂O中，得到浓度为10^-2M，用于在室温下与等份的步骤1)得到的SDS悬浮的手性指数为(6,5)-手性单壁纳米管溶液中避光反应，在手性单壁碳纳米管表面键合有4-N，N-二甲基苯胺基团，得到粘度探针(也简称官能化后纳米管或键合以后纳米管)。4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸重氮盐溶液被避光并立即使用，起始反应物4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸重氮盐]与碳摩尔比为1：100。反应过程为期3天，用UVvis-NIR吸收和荧光光谱监测样品。荧光光谱结果参见图2、图6。在重氮盐掺杂后，官能化碳纳米管的拉曼光谱显示在1,300cm^-1处的(D)峰明显增强(图4)，说明4-N，N-二甲基苯胺键合到手性单壁纳米管的表面。

粘度探针的粘度测试方法。

分别精确配置含有1×10^-6M粘度探针的甘油-乙醇溶液，V甘油:V水分别是1:9,2:8,3:7,4:6,5:5,6:4,7:3,8:2,9:1的两相混合溶液，溶液中分别将SDS的量配置为1wt％。超声20分钟，除掉气泡后静置1小时，在紫外分光光度仪和荧光光度仪上测量其吸收和发射光谱。所选用激发波长是560nm。所用仪器为紫外可见分光光度计，型号：erkinElmer Lambda1050 UV-vis-NIR spectrophotometer；荧光分光光度计，型号：HORIBA320。

手性单壁纳米管与4-N，N-二甲基苯胺键合后，以最强激发波段560nm激发，我们在1130nm和1270nm处观察到两个新的荧光峰(图2)。两个峰标记为E^- ₁₁和E_T，E^- ₁₁和E_T分别是E₁₁在990nm红移140nm和280nm产生的新发射峰。随着重氮四氟硼酸盐对手性单壁纳米管官能化程度的增加，E₁₁光致发光的绝对强度变弱，E^- ₁₁的相对强度逐渐增加，但反应进行3天后E_T的强度仍然非常弱(图6)。此时的纳米管的荧光特征已经非常稳定，并且在一周内几乎没有变化。在粘性溶液中，如图2c所示，纳米管粘度探针的粘度敏感性通过测量其在水和甘油的混合物中的荧光强度变化来说明。随着甘油与水的比例越来越高，溶液的粘度从1.0cP(水)增加到约782.8cP(90％甘油)，与之平行，纳米管粘度探针在990nm处的荧光强度增加1.5倍，1130nm增加2.4倍，1270nm增加4.6倍。结果表明，它仅在E₁₁的990nm峰处产生非常小的响应。然而，新的荧光发射E^- ₁₁峰在1130nm和E_T1270nm处随着溶剂粘度的增加荧光非常敏感，同时E_T诱导比E^- ₁₁更敏感，而原始纳米管在相同的条件下并没有对粘度产生变化(图7)。这种行为可以通过限制手性单壁纳米管表面上的二甲基苯胺基团旋转来解释：在粘性溶液中，二甲基苯胺基团的内部旋转受到阻碍，导致纳米管的非辐射速率常数降低。另一方面，我们通过向纳米管粘度探针溶液中添加不同浓度的SDS来评估表面活性剂对纳米管粘度探针的影响。如图5所示，键合后的纳米管的光谱受粘度的影响大于不同浓度的SDS的0.8％至3.5wt％。这表明本发明纳米管粘度探针对粘度非常敏感并且可用于检测溶液粘度。

基于荧光强度的测量总是受到一些外部因素的影响，例如染料浓度，仪器因素等。比率法是基于使用具有最大两个或更多发射通道的探针来获得避免大部分干扰的方法并且与探针浓度无关，这被认为优于使用强度信号的测定方法。基于三个荧光峰值如图3所示，纳米管粘度探针的荧光比(I_1130nm/I_990nm和I_1270nm/I_990nm)的对数分别与整个研究的粘度范围(η)的溶液呈线性关系。这符合方程：

log If＝C+xlogη (1)

其中C是浓度和温度依赖常数，x是染料依赖常数。在该研究的粘度范围内观察到优异的线性(其比率I_1130nm/I_990nm，R₂＝0.987，x＝0.073；其比率I_1270nm/I_990nm，R₂＝0.995，x＝0.175)，这表明本发明纳米管粘度探针可以用作比率传感器以定量检测溶液粘度。较高的斜率表明随着粘度增加，荧光比率的变化更快。因此，其在I_1270nm/I_990nm处的比率显示出比在I_1130nm/I_990nm处的粘度感测更敏感。

Claims (6)

1.一种基于手性单壁碳纳米管的粘度探针，其特征在于，在手性单壁碳纳米管表面键合有4-N，N-二甲基苯胺基团。

2.根据权利要求1所述基于手性单壁碳纳米管的粘度探针，其特征在于，手性单壁纳米管手性指数分别为(6,5)，(7,5)，(8,4)。

3.一种权利要求1所述基于手性单壁碳纳米管的粘度探针的合成方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)手性单壁纳米管通过超声处理分散在阴离子表面活性剂水溶液中，然后超速离心纯化，然后分散在阴离子表面活性剂水溶液配置浓度为0.1-1mg/L的手性单壁纳米管溶液；

2)四氟硼酸溶液加入反应容器中，然后在冰浴冷却搅拌下加入1-氨基-4-N，N-二甲基苯胺，然后滴加亚硝酸钠水溶液，反应后过滤，在真空过滤下用乙醚洗涤沉淀的4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐，同时避光。

3)将步骤2)得到的4-N，N-二甲基苯胺-重氮四氟硼酸盐溶解在水中，室温下与等份的步骤1)得到的手性单壁纳米管溶液避光反应，得到粘度探针。

4.根据权利要求3所述基于手性单壁碳纳米管的粘度探针的合成方法，其特征在于，阴离子表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠。

5.权利要求1所述基于手性单壁碳纳米管的粘度探针的应用，其特征在于，用来检测流体的粘度。

6.根据权利要求5所述基于手性单壁碳纳米管的粘度探针的应用，其特征在于，应用于微观生物体内粘度的检测。