JP3740466B2 - 被検体の発光光学的測定のための試薬 - Google Patents
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Description
【0001】
本発明は、その吸収スペクトルを変えることにより測定されるべき成分に直接もしくは間接的に応答する発色団(もしくは発光団)、および測定されるべき成分に応答しない発光団を含有する、最低1種の被検体および/もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および定量的測定の発光光学的(luminescence−optical)方法に関し、ここで発光団の発光スペクトルと発色団の吸収スペクトルとの間に少なくとも部分的な重なり合いが存在し、かつ、ここで、発光団と発色団との間の非放射エネルギー伝達が該発光団に特徴的な最低1種の発光の測定可能な変化を生じさせる。その原理はいわゆるFRET原理として知られる。
【0002】
本発明は、さらに、その吸収スペクトルを変えることにより測定されるべき成分に直接もしくは間接的に応答する発色団(もしくは発光団)、および測定されるべき成分に応答しない発光団を含有する、最低1種の被検体ならびに/または気体もしくは液体の測定媒体の成分の定量的測定のための試薬に関し、ここで発光団の発光スペクトルと発色団の吸収スペクトルとの間に少なくとも部分的な重なり合いが存在し、かつ、ここで、発光団と発色団との間の非放射エネルギー伝達が該発光団に特徴的な最低1種の発光の測定可能な変化を生じさせる。
【0003】
以下において、発光団は、適する励起に際してリン光もしくは蛍光放射を発射する色素と理解される。発色団の吸収スペクトルは、測定されるべき成分により直接、もしくは測定されるべき成分の化学反応生成物により間接的にのいずれかで影響される。「化学成分の定量的測定」という用語は、濃度および活量ならびに気体分圧の測定を指し、該発光団に特徴的な最低1種の発光の値は測定される量を暗示するのに使用される。
【0004】
pHおよび陽イオン感受性の発色団(受容体(acceptor))が発光団(供与体(donor))に好ましくは共有結合される方法およびセンサーは、米国特許第5,232,858号明細書から既知である。測定媒体中で測定されるべきpH値および/もしくは陽イオンの濃度は、発光団の発光減衰時間から生じられる。
【0005】
従来技術が関する限り、米国特許第5,648,269号明細書もまた挙げられるべきである。この文書は、測定される量を測定するための発光団の見かけの発光減衰時間の応用を提案する。1減衰時間成分をもつ発光団で、見かけの発光減衰時間は有効減衰時間と同一である。いくつかの減衰時間成分をもつ発光団では、見かけの減衰時間を評価することはより容易であるが、しかしながら、とりわけ、強固でない系では、増大する誤りという欠点が存在する。
【0006】
発光減衰時間は、それぞれ位相変調もしくは時間分解発光測定技術によって得てよい。
【0007】
類似の方法が欧州特許出願第EP−A−0 214 768号明細書から既知である。その中で、測定媒体中の測定されるべきパラメータの濃度は、測定される発光強度から暗示される。
【0008】
供与体から受容体分子への非放射エネルギー伝達の速度は、2物質の分子の空間的近接に依存する。伝達速度kT(r)は、供与体と受容体との間の空間的距離rに極めて応答性であり、かつ、距離の6乗で減衰し
【0009】
【数1】
【0010】
これにより、TDは受容体の非存在下での供与体の発光減衰時間を示し、またRoは特徴的なフェルスター距離を示す。後者は、エネルギー伝達の50%効率が提供される供与体−受容体距離である。それぞれの供与体−受容体対に依存して、Roは2と9nmとの間である。
【0011】
供与体から受容体分子への非放射エネルギー伝達により、発光団の発光光学的パラメータ(発光量子効率、発光強度、発光減衰時間)の巨視的に測定可能な値は、2物質のかなりの数の分子が相互と緊密な空間的接触にもたらされる場合は、とりわけ効率的な変化を受けることができる。
【0012】
緊密な空間的接触を得るために、米国特許第5,232,858号明細書は供与体および受容体分子の共有結合を提案している。欧州特許出願第EP−A−0 214 768号明細書においては、個々の供与体および受容体分子が、ガラスのような結合支持体の表面に共有結合される。
【0013】
米国特許第5,232,858号明細書に記述されるところの供与体および受容体分子の共有結合は、供与体/受容体の平均の空間的距離が可能な限り一定に保たれるかもしれないという利点を有する。しかしながら、とりわけ大きな合成の努力が、所望の発光団間の共有結合、および適するpHもしくはイオン感受性の発色団を調製するために必要とされることが一欠点である。
【0014】
供与体および受容体分子を結合支持体の表面に共有結合するためにもまたかなりの努力が必要とされ(欧州特許出願第EP−A−0 214 768号明細書)、これはとりわけ、境界表面現象が測定される結果の質を損なうという欠点をもたらす。
【0015】
従って、米国特許第5,942,189号および同第6,046,055号明細書において、発光団および発色団は、測定されるべき化学成分に浸透性であるマトリックス素材中にイオン対として存在する異なる電荷のイオン物質であることが示唆される。
【0016】
例えば金属−リガンド錯体、ある種のポルフィリンおよびランタニドにより表されるような永続する発光団(>100ns、好ましくは>1μsの発光減衰時間を有する)の使用は、一般的商業的応用に最高に重要である。それから生じられるべき発光減衰時間および/もしくは値の測定のための、提供される永続する発光、光電子配列ならびに成分(例えば平均発光減衰時間、位相角)は、位相もしくは時間分解法によってとりわけ安価な様式で決定されるかもしれない。
【0017】
しかしながら、本出願の発明者は、上に挙げられた以前に知られた方法が、とりわけ、永続する発光団の発光が測定媒体の多数の成分により影響されるという共通の欠点をもたらすことを認識した。こうした発光団の既知の一特徴は、サンプルのO2含量への発光の特徴のとりわけ大きな依存性である。結果として、こうした発光団は、従ってO2含量を測定するためにしばしば使用される(欧州特許出願第EP−A−0 907 074号明細書)。それらの発光団を、FRET原理に基づくセンサーとともに供与体色素として使用する場合、従って、測定媒体のO2含量を正確に知りもしくは測定しかつ適切な補正を実施することが必要である。発光量子効率に対する影響を有するさらなる物質の例はアミンおよび水である。連続測定(モニタリング)の経過中に、発光色素は出現する一重項O2により完全にもしくは部分的に破壊されるかもしれない。従って、その過程を制限するための添加物が提案された。しかしながら、既知の有利な発光色素の一般的な一欠点は、サンプルのいずれかの成分、とりわけ水により引き起こされる化学物理的微小環境の小さな変化に対する発光の特徴の感受性である。未知のかつ/または変動する化学的もしくは生化学的組成のサンプル媒体の場合、それは測定の正確さの重大な制限につながる。例えば、医学的診断において、±5ミリpHの再現可能性が、血液pH測定の分野で期待される。
【0018】
測定されるべきサンプルの成分により引き起こされる失敗に対するサセプタンスに関して、測定されるべき物質(被検体)もしくはその反応生成物を可逆的に結合する発光団(供与体)および発色団(受容体、指示薬(indicator))に基づく、FRET原理に基づく発光光学的測定方法を改良することが、本発明の目的である。さらに、かなりの数の受容体分子および遮蔽された供与体分子の空間的近接を得るために必要とされるとりわけ多くの化学合成段階が回避されるはずである。
【0019】
本発明により、本目的は、発光団(供与体)および発色団(受容体)が異なる化学相中に配置されるために達成される。供与体相のマトリックス素材は、該供与体の発光の特徴に影響を及ぼすサンプル媒体の成分に本質的に不浸透性であるべきである。受容体相のマトリックス素材は、それぞれ被検体もしくはその反応生成物に対し浸透性であるべきである。
【0020】
従って、本発明は、受容体色素、ならびに供与体色素を表す粒子を含有し、それにより供与体色素および受容体色素が異なる化学相(chemical phase)中に配置され、受容体色素は粒子に結合したままで提供され、かつ、該粒子は、該供与体色素の発光の特徴に影響を及ぼすサンプル媒体もしくはサンプル媒体の成分に本質的に不浸透性である、FRET原理に従ってアッセイを実施するための試薬に関する。
【0021】
従って、供与体相のマトリックス素材は、分析されるべき物質中の小粒子の形態で分散されるように提供され、受容体分子は該粒子の表面に結合される。
【0022】
それにより、発色団は、表面で官能基に吸着もしくは静電、または最も好ましくは共有結合されてよい。
【0023】
好ましい一態様において、ポリアクリルニトリルおよびその誘導体、PVCならびに/もしくはポリ塩化ビニリデンのような無可塑ポリマーが、供与体色素を含有する粒子のための素材として使用される。
【0024】
最低1種の被検体および/もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および/もしくは定量的測定のための本発明の方法は、測定媒体への本発明の試薬の添加を含んで成る。
【0025】
従って、粒子に結合されている受容体色素とともに供与体色素を含有する粒子のみが、例えば測定キュベット中の測定媒体に添加されなければならず、それに際してそれぞれの分析がそれ自体既知の様式で実施される。従って、測定媒体は同時にまた受容体相でもある。
【0026】
好ましくは、本発明の方法は、サンプルのpH値の測定、またはサンプル中のイオン、とりわけLi+、Na+、K+、Mg++、Ca++もしくはCl−の濃度および/もしくは活量の測定に使用される。
【0027】
本発明の方法の応用のさらなる領域はいわゆる変換器に関する。その中で、発色団は被検体と直接反応しないがしかし間接的に反応する。それの例はいわゆる酵素的センサー(例えば尿素およびクレアチニンを測定するための)である。それにより、1種もしくはそれ以上の酵素が被検体と反応して、発色団と直接反応する生成物の形成に至る。
【0028】
好ましくは、測定媒体は体液、とりわけ血液、血漿もしくは血清である。
【0029】
本発明により使用される最も有利な発光団(供与体)は、高い発光量子効率および長い発光減衰時間(>100ns)を特徴とするものである。好ましい発光団は、パラジウム、ロジウム、白金、ルテニウム、オスミウム、希土類(とりわけユーロピウムおよびランタン)の陽イオン性の有機金属錯体である。これらの有機金属錯体の有機部分は、例えば、ポルフィリン、ビピリジル、フェナントロリンもしくは他の複素環化合物の群からのリガンドよりなってよい。
【0030】
好ましいpHおよび陽イオン感受性の発色団(受容体)は、その光吸収が測定されるべきサンプル媒体の成分との直接もしくは間接的な化学的/物理的相互作用に際して変化することができ、かつ、その吸収スペクトルが発光団の発光スペクトルと少なくとも部分的に重なり合う、陰イオン物質である。
I)サンプルのpH値の測定
従来技術によるpH測定のための光センサー(O.S.Wolfbeis “Fiber Optic Chemical Sensors and Biosensors”,CRC プレス(CRC−Press)、ボカレイトン、1991、Vol.I、第8章中、M.J.P.LeinerとO.S.Wolfbeis “Fiber Optic pH Sensors”を参照されたい)は、通常、イオン透過性の、好ましくは親水性のポリマーマトリックス中に取り込まれた吸収色素(発色団)もしくは蛍光色素を含有する。サンプル媒体のpH値(pH=−log(aH+))に依存して、熱力学的平衡が、それぞれ発色団もしくは蛍光団のプロトン化された形態と脱プロトン化された形態との間で確立される。光学的方法により測定可能な2つの形態の濃度比から、サンプル媒体のpH値を得てよい。
反応:
【0031】
【数2】
【0032】
AHはプロトン化された、およびA−は脱プロトン化された形態のpH感受性の発色団である。H+はプロトンを示す。Kdは平衡定数である。cは濃度を示す。
【0033】
最初に挙げられた米国特許第5,232,858号明細書に、pH非感受性の発光団(供与体)に好ましくは共有結合されるpH感受性の発色団が記述されている。発光団(L)の発光減衰時間から試験溶液のpH値が得られる。
【0034】
本発明の発光光学的pH測定のために、例えば、それぞれ受容体相に提供されるかもしくは受容体相と少なくとも直接接触する受容体色素としてpH感受性の発色団が使用され、それにより、受容体相は分析されるべき媒体(測定媒体)である。
【0035】
サンプル媒体の低いpH値(pH<<発色団のpK)の例において、発色団は完全にプロトン化された形態で存在する。脱プロトン化された発色団の吸収帯域および発光団の発光帯域の最小のスペクトルの重なり合いにより、発光団から発色団への非放射エネルギー伝達速度が最小に達する。相応して、該発光団の平均の発光減衰時間および相対発光強度の値が最大に達する。
【0036】
サンプル媒体の高いpH値(pH>>発色団のpKa)の例において、発色団は完全に脱プロトン化された形態で存在する。脱プロトン化された発色団の吸収帯域および発光団の発光帯域の最大のスペクトルの重なり合いにより、発光団(供与体、供与体色素)から発色団(受容体、受容体色素)への非放射エネルギー伝達速度が最大に達する。相応して、該発光団の平均の発光減衰時間および相対発光強度の値が最小に達する。
【0037】
発色団のpKd値(pKd=−logKd)の±1.5pH単位の範囲のサンプル媒体のpH値について、サンプル媒体のpH値は、該発光団の平均の発光減衰時間もしくは相対発光強度から、十分な正確さを伴い暗示されるかもしれない。
II)サンプル中の陽イオンおよび陰イオンの濃度および/もしくは活量の測定(Li+、Na+、K+、Mg++、Ca++、Cl−)
サンプル媒体中の陽イオンの濃度および/もしくは活量を測定するための、それぞれ以前に知られている光センサーおよび光測定方法は、多様な方法に基づく。最初に挙げられたところの米国特許第5,232,858号明細書は、陽イオン非感受性の発光団に好ましくは共有結合される陽イオン感受性の発色団(発色イオノフォア(chromoionophore))を記述する。
【0038】
非常に高い陽イオン濃度(cY+p>>発色団のKd)のサンプル媒体の例において、発色団は完全に錯体形成された形態で存在する。(Yは測定されるべき陽イオンであり、+pはその原子番号である。)非常に低い陽イオン濃度(cY+p<<発色団のKd)のサンプル媒体の例において、発色団は遊離の錯体形成されない形態で存在する。
【0039】
サンプル媒体の測定されるべき陽イオンの対数濃度log(cY+p)が−log(Kd)±1.5の範囲にある場合、サンプル媒体中の測定されるべき陽イオンの濃度は、該発光団の平均の発光減衰時間および/もしくは相対発光強度から、十分な正確さを伴い暗示されるかもしれない。
【0040】
本発明により使用されるpH感受性の発色団を下に表1に例示する:
【0041】
【表1】
【0042】
加えて、一般的形態
【0043】
【化1】
【0044】
のpH感受性のトリフェニルメタン色素を使用する。相互に独立に、R1−6は、H、ハロゲン原子、ニトロ基およびアルキル基であってよい。X−は発色団を共有固定するための任意の基を示す。適する基は、例えば−(CH2)n−SO3−もしくは−(CH2)n−COO−、−(CH2)n−NH2(n=0〜18)である。
【0045】
一般的形態
【0046】
【化2】
【0047】
式中、相互に独立に、R1−R4はそれぞれハロゲン原子、ニトロ基もしくはアルキル基のような置換基、および共有固定に適する基を示し、それにより、しかしながら、最低1個の−OH基が存在しなければならない
のpH感受性のアゾ色素。
本発明による使用に適する陽イオン感受性の発色団:
リチウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムイオンの測定のために本発明により使用可能な陽イオン感受性の発色イオノフォアの例は、陰イオン性アゾ色素、スチルベン色素およびメロシアニンを包含し、それらは最低1個のイオン選択基(イオノフォア基)を含有し、かつ、最長波長を伴うその吸収帯域は少なくとも部分的に発光団の発光帯域と重なり合い、測定されるべき陽イオンとの相互作用は最長波長を伴う吸収帯域のスペクトルのシフトに至る。
【0048】
【表2】
【0049】
使用される他の中心原子はIr、Rh、Pd、PtもしくはReである。
較正値の決定:
較正曲線(図1)およびO2依存性の決定を、正弦様式で変調された励起光に関して発光の位相シフトを測定することにより実施した。永続する発光団の使用により、45kHzの変調周波数を表す単純な測定の手配が十分である。測定の目的上、センサー円板をセンサーフォイルからパンチで切り取り、それらを二腕の光導体束の端片に結合し、そしてそれぞれの測定媒体と接触させたか、もしくは、光導体束の端片を、サンプルを含有する測定媒体中に直接浸した。正弦様式で45kHzまで変調された5Vの増幅電圧で供給される青色LED(470nm)を励起光源として使用した。青色フォイルフィルターを励起光のフィルターとして使用した。励起光は光導体によってそれぞれセンサーフォイルもしくは試験液体に導いた。発射された発光を、光導体束によってフィルター(OG 570ガラスフィルター(ショット(Schott))および赤色フォイルフィルターの組合せ)に導き、そしてさらに検出器(光電子増倍管、型 ハママツ(Hamamatsu)H5702)上に導いた。LEDの正弦様式で変調された分布電圧および検出器のシグナルを、ロックイン増幅器によって評価した。位相シフトφを測定シグナルとして得た。減衰時間τを、以下の式、すなわちτ=tan(φ)/(2πf)に従って、測定された位相シフトφおよび変調周波数f=45kHzから計算した。
【0050】
それぞれNaOHもしくはHClの助けを借りて所望のpH値に調節されたリン酸緩衝液を、pH試薬(図1)の測定および/もしくは較正媒体として使用した。緩衝液は、空気を用いる圧力測定学(tonometrics)を使用することにより大気酸素値に調節したか、もしくはNa2SO3を添加することにより酸素を含まないようにした。
【0051】
図1は、FRET原理(実施例部分の節2.3に従って生じられる)に基づきかつpH感受性の受容体色素を含有する光試薬の較正曲線を示し、供与体色素は本発明の供与体相(粒子)中に「保護された様式で」存在する。2本の曲線は、異なるpH値(横軸)を表す較正液体中に分散されたpH試薬の発光の位相角(縦軸)を示す。「O」により示される曲線は、空気(21.95%O2)により飽和されている場合に取った。「N」により示される曲線はN2により飽和されている場合に取った。
実施例
Ru(ジフフェン)3TMS2
[Ru(II)−トリス−(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)(3−トリメチルシリル)−1−プロパンスルホン酸]
(I.KlimantとO.S.Wolfbeis,Anal.Chem.67(1995)3160)。
実施例1
本実施例は、本発明により供与体相中に埋込まれる供与体色素が、受容体相中に埋込まれている同一の色素より小さいO2感受性を表すことを示す。
埋込まれた供与体色素を伴うナノ粒子の調製の一般的記述。
1.1 受容体相中への供与体色素の埋込
1mgの供与体色素Ru(ジフフェン)3TMS2および100mgの親水性ポリマーD4(親水性配列をもつポリウレタン;タインデイル プレインズ ハンター LTD(Tyndale Plains Hunter LTD)、ニュージャージー州リンゴウズ、08551、米国)をエタノール:水(90:10 w/w)に溶解した。溶液はナイフの適用によりポリエステルフォイル(マイラー(Mylar)、デュポン(Dupont))を引き上げられた。溶媒の蒸発後に、およそ20μmの層厚を伴う薄膜が出現した。
測定の手配(45kHz、青色LED、OG 570)
乾燥: 空気 55.4° N2: 58.3°
水: 空気飽和 : 53.5° N2飽和: 58.4°
測定結果は、受容体相中に「保護されない様式で」存在している供与体色素Ru(ジフフェン)3TMS2が、O2を含まない(N2飽和)もしくは21.95%O2(空気)で飽和された気体および水性媒体と接触されている場合に、それぞれ2.9°(乾燥受容体相)もしくは4.9°(浸潤受容体相)のO2感受性を表すことを示す。
1.2 供与体色素を含むナノ粒子の調製
400mgのポリアクリルニトリル(ポリサイエンス(Polyscience))および8mgのRu(ジフフェン)3TMS2を80mlのDMF(メルク(Merck))に溶解した。500mlの水中にゆっくりと滴らせた後に、出現された懸濁物をNaClと混合しかつ遠心分離した。遠心分離の廃液を、水で数回、およびその後エタノールで洗浄した。
1.3 層状にされた受容体相中への供与体色素を運搬するナノ粒子の埋込
エタノール懸濁物(1.2の)を、5mlのエタノール:水(90:10 w/w)中の400mgの親水性ポリマーD4(タインデイル プレインズ ハンター LTD(Tyndale Plains Hunter LTD)、ニュージャージー州リンゴウズ、08551、米国)の溶液と混合した。懸濁物はナイフの適用によりポリエステルフォイル(マイラー(Mylar)、デュポン(Dupont))を引き上げられた。溶媒の蒸発後におよそ20μmの層厚をもつ薄膜が出現した。
測定の手配(45kHz、青色LED、OG 570)
乾燥: 空気 57.4°; N2: 58.2°
水: 空気飽和 : 56.8° O2を含まない(SO3 2−):58.6°
測定結果は、本発明のナノ粒子中に埋込まれそして従って供与体相中に「保護された様式で」存在している供与体色素Ru(ジフフェン)3TMS2が、O2を含まないもしくは21.95%O2飽和された気体もしくは水性媒体と接触されている場合に、それぞれ0.8°(乾燥受容体相)もしくは1.6°(湿潤受容体相)のO2感受性を表すことを示す。
【0052】
これらの値を1.1の値と比較することにより、本発明により供与体相中に存在する全く同一の供与体色素が、従来技術により受容体相中に直接存在する供与体色素より小さいO2感受性を表すことをが、従って明らかとなる。
実施例2(本発明の試薬)
pH官能性ナノ粒子およびpH感受性層の調製の一般的記述
第一段階において、アクリロニトリルおよびOH官能性メタクリレートより構成されるOH官能性コポリマーを調製する。第二段階において、埋込まれた供与体色素を含有するナノ粒子をそのポリマーから調製する。第三段階において、pH感受性の受容体色素を、該コポリマーの官能基に共有結合する。そうすることにおいて、受容体色素は、該粒子の「軟」親水性領域(受容体相)中に主として配置され、従ってイオンにとって到達可能である。供与体色素は主として「硬」領域(供与体相)中に溶解され、従って物質が到達を獲得することを妨害することを困難にする。
2.1 コポリマーの調製
230gの脱イオン化H2Oを、窒素での2時間のすすぎにより酸素を含まないようにした。攪拌および窒素環境下で、4gのSDS(ドデシル硫酸ナトリウムp.A.、メルク(Merck))を溶解した。20mlのアクリロニトリル(フルカ(Fluka))および1mlのポリエチレングリコールモノメタクリレート(ポリサイエンス(Polyscience)、n=200、注文番号16712)をその溶液に添加した。その混合物を50°にし、そして4mlの1N HCl(メルク(Merck))と混合した。重合を、400mgのペルオキソ二硫酸アンモニウム(メルク(Merck))を添加することにより開始し、そして50°で12時間実施した。ポリマーを吸引分離し、そして水およびエタノールで数回洗浄した。以下において、このポリマーをPAN−PEGと呼ぶ。
2.2 供与体色素を含むナノ粒子の調製
400mgのPAN−PEGおよび20mgの供与体色素Ru(ジフフェン)3TMS2を80mlのDMF(メルク(Merck))に溶解した。500mlの水にゆっくりと滴らせた後に、懸濁物をNaClと混合しかつ遠心分離した。遠心分離の廃液を水で数回洗浄した。
2.3 発色団のpH感受性の受容体色素のナノ粒子への結合
25mgのpH感受性の受容体色素N9(メルク(Merck))を8 Tr.濃H2SO4(メルク(Merck))とともに粉砕し、そしてウォータージェット真空中で30分間活性化した。色素を100mlの脱イオン水に吸収させ、そしてNaOHの助けを借りてpH7にした。上述された遠心分離の廃液をこの混合物に添加し、5分後に4.2gのNaCO3、および5分後に2mlの5M NaOHを添加した。さらなる20分後に、濃HCLによるpH3への酸性化を実施した。粒子を遠心分離により分離し、そして塩基性緩衝液、水およびエタノールで洗浄した。
【0053】
かように調製された粒子を水性の測定媒体に懸濁し、そして測定を多様なpH値でかつ空気およびN2飽和下で実施した。結果を図1に描き、そして、pH測定の目的上、pH感受性の粒子は試薬(=英語で「プローブ」)として測定媒体に添加してよいことを示す。
【0054】
測定媒体:pH7.3 空気飽和:50.0° O2を含まないN2飽和):51.3°
【図面の簡単な説明】
以下において、本発明は図1を参照してより詳細に説明することができ、ここで
【図1】 発明にかかる、pH測定のための本発明の試薬の較正曲線を表す。
本発明は、その吸収スペクトルを変えることにより測定されるべき成分に直接もしくは間接的に応答する発色団(もしくは発光団)、および測定されるべき成分に応答しない発光団を含有する、最低1種の被検体および/もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および定量的測定の発光光学的(luminescence−optical)方法に関し、ここで発光団の発光スペクトルと発色団の吸収スペクトルとの間に少なくとも部分的な重なり合いが存在し、かつ、ここで、発光団と発色団との間の非放射エネルギー伝達が該発光団に特徴的な最低1種の発光の測定可能な変化を生じさせる。その原理はいわゆるFRET原理として知られる。
【0002】
本発明は、さらに、その吸収スペクトルを変えることにより測定されるべき成分に直接もしくは間接的に応答する発色団(もしくは発光団)、および測定されるべき成分に応答しない発光団を含有する、最低1種の被検体ならびに/または気体もしくは液体の測定媒体の成分の定量的測定のための試薬に関し、ここで発光団の発光スペクトルと発色団の吸収スペクトルとの間に少なくとも部分的な重なり合いが存在し、かつ、ここで、発光団と発色団との間の非放射エネルギー伝達が該発光団に特徴的な最低1種の発光の測定可能な変化を生じさせる。
【0003】
以下において、発光団は、適する励起に際してリン光もしくは蛍光放射を発射する色素と理解される。発色団の吸収スペクトルは、測定されるべき成分により直接、もしくは測定されるべき成分の化学反応生成物により間接的にのいずれかで影響される。「化学成分の定量的測定」という用語は、濃度および活量ならびに気体分圧の測定を指し、該発光団に特徴的な最低1種の発光の値は測定される量を暗示するのに使用される。
【0004】
pHおよび陽イオン感受性の発色団(受容体(acceptor))が発光団(供与体(donor))に好ましくは共有結合される方法およびセンサーは、米国特許第5,232,858号明細書から既知である。測定媒体中で測定されるべきpH値および/もしくは陽イオンの濃度は、発光団の発光減衰時間から生じられる。
【0005】
従来技術が関する限り、米国特許第5,648,269号明細書もまた挙げられるべきである。この文書は、測定される量を測定するための発光団の見かけの発光減衰時間の応用を提案する。1減衰時間成分をもつ発光団で、見かけの発光減衰時間は有効減衰時間と同一である。いくつかの減衰時間成分をもつ発光団では、見かけの減衰時間を評価することはより容易であるが、しかしながら、とりわけ、強固でない系では、増大する誤りという欠点が存在する。
【0006】
発光減衰時間は、それぞれ位相変調もしくは時間分解発光測定技術によって得てよい。
【0007】
類似の方法が欧州特許出願第EP−A−0 214 768号明細書から既知である。その中で、測定媒体中の測定されるべきパラメータの濃度は、測定される発光強度から暗示される。
【0008】
供与体から受容体分子への非放射エネルギー伝達の速度は、2物質の分子の空間的近接に依存する。伝達速度kT(r)は、供与体と受容体との間の空間的距離rに極めて応答性であり、かつ、距離の6乗で減衰し
【0009】
【数1】
【0010】
これにより、TDは受容体の非存在下での供与体の発光減衰時間を示し、またRoは特徴的なフェルスター距離を示す。後者は、エネルギー伝達の50%効率が提供される供与体−受容体距離である。それぞれの供与体−受容体対に依存して、Roは2と9nmとの間である。
【0011】
供与体から受容体分子への非放射エネルギー伝達により、発光団の発光光学的パラメータ(発光量子効率、発光強度、発光減衰時間)の巨視的に測定可能な値は、2物質のかなりの数の分子が相互と緊密な空間的接触にもたらされる場合は、とりわけ効率的な変化を受けることができる。
【0012】
緊密な空間的接触を得るために、米国特許第5,232,858号明細書は供与体および受容体分子の共有結合を提案している。欧州特許出願第EP−A−0 214 768号明細書においては、個々の供与体および受容体分子が、ガラスのような結合支持体の表面に共有結合される。
【0013】
米国特許第5,232,858号明細書に記述されるところの供与体および受容体分子の共有結合は、供与体/受容体の平均の空間的距離が可能な限り一定に保たれるかもしれないという利点を有する。しかしながら、とりわけ大きな合成の努力が、所望の発光団間の共有結合、および適するpHもしくはイオン感受性の発色団を調製するために必要とされることが一欠点である。
【0014】
供与体および受容体分子を結合支持体の表面に共有結合するためにもまたかなりの努力が必要とされ(欧州特許出願第EP−A−0 214 768号明細書)、これはとりわけ、境界表面現象が測定される結果の質を損なうという欠点をもたらす。
【0015】
従って、米国特許第5,942,189号および同第6,046,055号明細書において、発光団および発色団は、測定されるべき化学成分に浸透性であるマトリックス素材中にイオン対として存在する異なる電荷のイオン物質であることが示唆される。
【0016】
例えば金属−リガンド錯体、ある種のポルフィリンおよびランタニドにより表されるような永続する発光団(>100ns、好ましくは>1μsの発光減衰時間を有する)の使用は、一般的商業的応用に最高に重要である。それから生じられるべき発光減衰時間および/もしくは値の測定のための、提供される永続する発光、光電子配列ならびに成分(例えば平均発光減衰時間、位相角)は、位相もしくは時間分解法によってとりわけ安価な様式で決定されるかもしれない。
【0017】
しかしながら、本出願の発明者は、上に挙げられた以前に知られた方法が、とりわけ、永続する発光団の発光が測定媒体の多数の成分により影響されるという共通の欠点をもたらすことを認識した。こうした発光団の既知の一特徴は、サンプルのO2含量への発光の特徴のとりわけ大きな依存性である。結果として、こうした発光団は、従ってO2含量を測定するためにしばしば使用される(欧州特許出願第EP−A−0 907 074号明細書)。それらの発光団を、FRET原理に基づくセンサーとともに供与体色素として使用する場合、従って、測定媒体のO2含量を正確に知りもしくは測定しかつ適切な補正を実施することが必要である。発光量子効率に対する影響を有するさらなる物質の例はアミンおよび水である。連続測定(モニタリング)の経過中に、発光色素は出現する一重項O2により完全にもしくは部分的に破壊されるかもしれない。従って、その過程を制限するための添加物が提案された。しかしながら、既知の有利な発光色素の一般的な一欠点は、サンプルのいずれかの成分、とりわけ水により引き起こされる化学物理的微小環境の小さな変化に対する発光の特徴の感受性である。未知のかつ/または変動する化学的もしくは生化学的組成のサンプル媒体の場合、それは測定の正確さの重大な制限につながる。例えば、医学的診断において、±5ミリpHの再現可能性が、血液pH測定の分野で期待される。
【0018】
測定されるべきサンプルの成分により引き起こされる失敗に対するサセプタンスに関して、測定されるべき物質(被検体)もしくはその反応生成物を可逆的に結合する発光団(供与体)および発色団(受容体、指示薬(indicator))に基づく、FRET原理に基づく発光光学的測定方法を改良することが、本発明の目的である。さらに、かなりの数の受容体分子および遮蔽された供与体分子の空間的近接を得るために必要とされるとりわけ多くの化学合成段階が回避されるはずである。
【0019】
本発明により、本目的は、発光団(供与体)および発色団(受容体)が異なる化学相中に配置されるために達成される。供与体相のマトリックス素材は、該供与体の発光の特徴に影響を及ぼすサンプル媒体の成分に本質的に不浸透性であるべきである。受容体相のマトリックス素材は、それぞれ被検体もしくはその反応生成物に対し浸透性であるべきである。
【0020】
従って、本発明は、受容体色素、ならびに供与体色素を表す粒子を含有し、それにより供与体色素および受容体色素が異なる化学相(chemical phase)中に配置され、受容体色素は粒子に結合したままで提供され、かつ、該粒子は、該供与体色素の発光の特徴に影響を及ぼすサンプル媒体もしくはサンプル媒体の成分に本質的に不浸透性である、FRET原理に従ってアッセイを実施するための試薬に関する。
【0021】
従って、供与体相のマトリックス素材は、分析されるべき物質中の小粒子の形態で分散されるように提供され、受容体分子は該粒子の表面に結合される。
【0022】
それにより、発色団は、表面で官能基に吸着もしくは静電、または最も好ましくは共有結合されてよい。
【0023】
好ましい一態様において、ポリアクリルニトリルおよびその誘導体、PVCならびに/もしくはポリ塩化ビニリデンのような無可塑ポリマーが、供与体色素を含有する粒子のための素材として使用される。
【0024】
最低1種の被検体および/もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および/もしくは定量的測定のための本発明の方法は、測定媒体への本発明の試薬の添加を含んで成る。
【0025】
従って、粒子に結合されている受容体色素とともに供与体色素を含有する粒子のみが、例えば測定キュベット中の測定媒体に添加されなければならず、それに際してそれぞれの分析がそれ自体既知の様式で実施される。従って、測定媒体は同時にまた受容体相でもある。
【0026】
好ましくは、本発明の方法は、サンプルのpH値の測定、またはサンプル中のイオン、とりわけLi+、Na+、K+、Mg++、Ca++もしくはCl−の濃度および/もしくは活量の測定に使用される。
【0027】
本発明の方法の応用のさらなる領域はいわゆる変換器に関する。その中で、発色団は被検体と直接反応しないがしかし間接的に反応する。それの例はいわゆる酵素的センサー(例えば尿素およびクレアチニンを測定するための)である。それにより、1種もしくはそれ以上の酵素が被検体と反応して、発色団と直接反応する生成物の形成に至る。
【0028】
好ましくは、測定媒体は体液、とりわけ血液、血漿もしくは血清である。
【0029】
本発明により使用される最も有利な発光団(供与体)は、高い発光量子効率および長い発光減衰時間(>100ns)を特徴とするものである。好ましい発光団は、パラジウム、ロジウム、白金、ルテニウム、オスミウム、希土類(とりわけユーロピウムおよびランタン)の陽イオン性の有機金属錯体である。これらの有機金属錯体の有機部分は、例えば、ポルフィリン、ビピリジル、フェナントロリンもしくは他の複素環化合物の群からのリガンドよりなってよい。
【0030】
好ましいpHおよび陽イオン感受性の発色団(受容体)は、その光吸収が測定されるべきサンプル媒体の成分との直接もしくは間接的な化学的/物理的相互作用に際して変化することができ、かつ、その吸収スペクトルが発光団の発光スペクトルと少なくとも部分的に重なり合う、陰イオン物質である。
I)サンプルのpH値の測定
従来技術によるpH測定のための光センサー(O.S.Wolfbeis “Fiber Optic Chemical Sensors and Biosensors”,CRC プレス(CRC−Press)、ボカレイトン、1991、Vol.I、第8章中、M.J.P.LeinerとO.S.Wolfbeis “Fiber Optic pH Sensors”を参照されたい)は、通常、イオン透過性の、好ましくは親水性のポリマーマトリックス中に取り込まれた吸収色素(発色団)もしくは蛍光色素を含有する。サンプル媒体のpH値(pH=−log(aH+))に依存して、熱力学的平衡が、それぞれ発色団もしくは蛍光団のプロトン化された形態と脱プロトン化された形態との間で確立される。光学的方法により測定可能な2つの形態の濃度比から、サンプル媒体のpH値を得てよい。
反応:
【0031】
【数2】
【0032】
AHはプロトン化された、およびA−は脱プロトン化された形態のpH感受性の発色団である。H+はプロトンを示す。Kdは平衡定数である。cは濃度を示す。
【0033】
最初に挙げられた米国特許第5,232,858号明細書に、pH非感受性の発光団(供与体)に好ましくは共有結合されるpH感受性の発色団が記述されている。発光団(L)の発光減衰時間から試験溶液のpH値が得られる。
【0034】
本発明の発光光学的pH測定のために、例えば、それぞれ受容体相に提供されるかもしくは受容体相と少なくとも直接接触する受容体色素としてpH感受性の発色団が使用され、それにより、受容体相は分析されるべき媒体(測定媒体)である。
【0035】
サンプル媒体の低いpH値(pH<<発色団のpK)の例において、発色団は完全にプロトン化された形態で存在する。脱プロトン化された発色団の吸収帯域および発光団の発光帯域の最小のスペクトルの重なり合いにより、発光団から発色団への非放射エネルギー伝達速度が最小に達する。相応して、該発光団の平均の発光減衰時間および相対発光強度の値が最大に達する。
【0036】
サンプル媒体の高いpH値(pH>>発色団のpKa)の例において、発色団は完全に脱プロトン化された形態で存在する。脱プロトン化された発色団の吸収帯域および発光団の発光帯域の最大のスペクトルの重なり合いにより、発光団(供与体、供与体色素)から発色団(受容体、受容体色素)への非放射エネルギー伝達速度が最大に達する。相応して、該発光団の平均の発光減衰時間および相対発光強度の値が最小に達する。
【0037】
発色団のpKd値(pKd=−logKd)の±1.5pH単位の範囲のサンプル媒体のpH値について、サンプル媒体のpH値は、該発光団の平均の発光減衰時間もしくは相対発光強度から、十分な正確さを伴い暗示されるかもしれない。
II)サンプル中の陽イオンおよび陰イオンの濃度および/もしくは活量の測定(Li+、Na+、K+、Mg++、Ca++、Cl−)
サンプル媒体中の陽イオンの濃度および/もしくは活量を測定するための、それぞれ以前に知られている光センサーおよび光測定方法は、多様な方法に基づく。最初に挙げられたところの米国特許第5,232,858号明細書は、陽イオン非感受性の発光団に好ましくは共有結合される陽イオン感受性の発色団(発色イオノフォア(chromoionophore))を記述する。
【0038】
非常に高い陽イオン濃度(cY+p>>発色団のKd)のサンプル媒体の例において、発色団は完全に錯体形成された形態で存在する。(Yは測定されるべき陽イオンであり、+pはその原子番号である。)非常に低い陽イオン濃度(cY+p<<発色団のKd)のサンプル媒体の例において、発色団は遊離の錯体形成されない形態で存在する。
【0039】
サンプル媒体の測定されるべき陽イオンの対数濃度log(cY+p)が−log(Kd)±1.5の範囲にある場合、サンプル媒体中の測定されるべき陽イオンの濃度は、該発光団の平均の発光減衰時間および/もしくは相対発光強度から、十分な正確さを伴い暗示されるかもしれない。
【0040】
本発明により使用されるpH感受性の発色団を下に表1に例示する:
【0041】
【表1】
【0042】
加えて、一般的形態
【0043】
【化1】
【0044】
のpH感受性のトリフェニルメタン色素を使用する。相互に独立に、R1−6は、H、ハロゲン原子、ニトロ基およびアルキル基であってよい。X−は発色団を共有固定するための任意の基を示す。適する基は、例えば−(CH2)n−SO3−もしくは−(CH2)n−COO−、−(CH2)n−NH2(n=0〜18)である。
【0045】
一般的形態
【0046】
【化2】
【0047】
式中、相互に独立に、R1−R4はそれぞれハロゲン原子、ニトロ基もしくはアルキル基のような置換基、および共有固定に適する基を示し、それにより、しかしながら、最低1個の−OH基が存在しなければならない
のpH感受性のアゾ色素。
本発明による使用に適する陽イオン感受性の発色団:
リチウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムイオンの測定のために本発明により使用可能な陽イオン感受性の発色イオノフォアの例は、陰イオン性アゾ色素、スチルベン色素およびメロシアニンを包含し、それらは最低1個のイオン選択基(イオノフォア基)を含有し、かつ、最長波長を伴うその吸収帯域は少なくとも部分的に発光団の発光帯域と重なり合い、測定されるべき陽イオンとの相互作用は最長波長を伴う吸収帯域のスペクトルのシフトに至る。
【0048】
【表2】
【0049】
使用される他の中心原子はIr、Rh、Pd、PtもしくはReである。
較正値の決定:
較正曲線(図1)およびO2依存性の決定を、正弦様式で変調された励起光に関して発光の位相シフトを測定することにより実施した。永続する発光団の使用により、45kHzの変調周波数を表す単純な測定の手配が十分である。測定の目的上、センサー円板をセンサーフォイルからパンチで切り取り、それらを二腕の光導体束の端片に結合し、そしてそれぞれの測定媒体と接触させたか、もしくは、光導体束の端片を、サンプルを含有する測定媒体中に直接浸した。正弦様式で45kHzまで変調された5Vの増幅電圧で供給される青色LED(470nm)を励起光源として使用した。青色フォイルフィルターを励起光のフィルターとして使用した。励起光は光導体によってそれぞれセンサーフォイルもしくは試験液体に導いた。発射された発光を、光導体束によってフィルター(OG 570ガラスフィルター(ショット(Schott))および赤色フォイルフィルターの組合せ)に導き、そしてさらに検出器(光電子増倍管、型 ハママツ(Hamamatsu)H5702)上に導いた。LEDの正弦様式で変調された分布電圧および検出器のシグナルを、ロックイン増幅器によって評価した。位相シフトφを測定シグナルとして得た。減衰時間τを、以下の式、すなわちτ=tan(φ)/(2πf)に従って、測定された位相シフトφおよび変調周波数f=45kHzから計算した。
【0050】
それぞれNaOHもしくはHClの助けを借りて所望のpH値に調節されたリン酸緩衝液を、pH試薬(図1)の測定および/もしくは較正媒体として使用した。緩衝液は、空気を用いる圧力測定学(tonometrics)を使用することにより大気酸素値に調節したか、もしくはNa2SO3を添加することにより酸素を含まないようにした。
【0051】
図1は、FRET原理(実施例部分の節2.3に従って生じられる)に基づきかつpH感受性の受容体色素を含有する光試薬の較正曲線を示し、供与体色素は本発明の供与体相(粒子)中に「保護された様式で」存在する。2本の曲線は、異なるpH値(横軸)を表す較正液体中に分散されたpH試薬の発光の位相角(縦軸)を示す。「O」により示される曲線は、空気(21.95%O2)により飽和されている場合に取った。「N」により示される曲線はN2により飽和されている場合に取った。
実施例
Ru(ジフフェン)3TMS2
[Ru(II)−トリス−(4,7−ジフェニル−1,10−フェナントロリン)(3−トリメチルシリル)−1−プロパンスルホン酸]
(I.KlimantとO.S.Wolfbeis,Anal.Chem.67(1995)3160)。
実施例1
本実施例は、本発明により供与体相中に埋込まれる供与体色素が、受容体相中に埋込まれている同一の色素より小さいO2感受性を表すことを示す。
埋込まれた供与体色素を伴うナノ粒子の調製の一般的記述。
1.1 受容体相中への供与体色素の埋込
1mgの供与体色素Ru(ジフフェン)3TMS2および100mgの親水性ポリマーD4(親水性配列をもつポリウレタン;タインデイル プレインズ ハンター LTD(Tyndale Plains Hunter LTD)、ニュージャージー州リンゴウズ、08551、米国)をエタノール:水(90:10 w/w)に溶解した。溶液はナイフの適用によりポリエステルフォイル(マイラー(Mylar)、デュポン(Dupont))を引き上げられた。溶媒の蒸発後に、およそ20μmの層厚を伴う薄膜が出現した。
測定の手配(45kHz、青色LED、OG 570)
乾燥: 空気 55.4° N2: 58.3°
水: 空気飽和 : 53.5° N2飽和: 58.4°
測定結果は、受容体相中に「保護されない様式で」存在している供与体色素Ru(ジフフェン)3TMS2が、O2を含まない(N2飽和)もしくは21.95%O2(空気)で飽和された気体および水性媒体と接触されている場合に、それぞれ2.9°(乾燥受容体相)もしくは4.9°(浸潤受容体相)のO2感受性を表すことを示す。
1.2 供与体色素を含むナノ粒子の調製
400mgのポリアクリルニトリル(ポリサイエンス(Polyscience))および8mgのRu(ジフフェン)3TMS2を80mlのDMF(メルク(Merck))に溶解した。500mlの水中にゆっくりと滴らせた後に、出現された懸濁物をNaClと混合しかつ遠心分離した。遠心分離の廃液を、水で数回、およびその後エタノールで洗浄した。
1.3 層状にされた受容体相中への供与体色素を運搬するナノ粒子の埋込
エタノール懸濁物(1.2の)を、5mlのエタノール:水(90:10 w/w)中の400mgの親水性ポリマーD4(タインデイル プレインズ ハンター LTD(Tyndale Plains Hunter LTD)、ニュージャージー州リンゴウズ、08551、米国)の溶液と混合した。懸濁物はナイフの適用によりポリエステルフォイル(マイラー(Mylar)、デュポン(Dupont))を引き上げられた。溶媒の蒸発後におよそ20μmの層厚をもつ薄膜が出現した。
測定の手配(45kHz、青色LED、OG 570)
乾燥: 空気 57.4°; N2: 58.2°
水: 空気飽和 : 56.8° O2を含まない(SO3 2−):58.6°
測定結果は、本発明のナノ粒子中に埋込まれそして従って供与体相中に「保護された様式で」存在している供与体色素Ru(ジフフェン)3TMS2が、O2を含まないもしくは21.95%O2飽和された気体もしくは水性媒体と接触されている場合に、それぞれ0.8°(乾燥受容体相)もしくは1.6°(湿潤受容体相)のO2感受性を表すことを示す。
【0052】
これらの値を1.1の値と比較することにより、本発明により供与体相中に存在する全く同一の供与体色素が、従来技術により受容体相中に直接存在する供与体色素より小さいO2感受性を表すことをが、従って明らかとなる。
実施例2(本発明の試薬)
pH官能性ナノ粒子およびpH感受性層の調製の一般的記述
第一段階において、アクリロニトリルおよびOH官能性メタクリレートより構成されるOH官能性コポリマーを調製する。第二段階において、埋込まれた供与体色素を含有するナノ粒子をそのポリマーから調製する。第三段階において、pH感受性の受容体色素を、該コポリマーの官能基に共有結合する。そうすることにおいて、受容体色素は、該粒子の「軟」親水性領域(受容体相)中に主として配置され、従ってイオンにとって到達可能である。供与体色素は主として「硬」領域(供与体相)中に溶解され、従って物質が到達を獲得することを妨害することを困難にする。
2.1 コポリマーの調製
230gの脱イオン化H2Oを、窒素での2時間のすすぎにより酸素を含まないようにした。攪拌および窒素環境下で、4gのSDS(ドデシル硫酸ナトリウムp.A.、メルク(Merck))を溶解した。20mlのアクリロニトリル(フルカ(Fluka))および1mlのポリエチレングリコールモノメタクリレート(ポリサイエンス(Polyscience)、n=200、注文番号16712)をその溶液に添加した。その混合物を50°にし、そして4mlの1N HCl(メルク(Merck))と混合した。重合を、400mgのペルオキソ二硫酸アンモニウム(メルク(Merck))を添加することにより開始し、そして50°で12時間実施した。ポリマーを吸引分離し、そして水およびエタノールで数回洗浄した。以下において、このポリマーをPAN−PEGと呼ぶ。
2.2 供与体色素を含むナノ粒子の調製
400mgのPAN−PEGおよび20mgの供与体色素Ru(ジフフェン)3TMS2を80mlのDMF(メルク(Merck))に溶解した。500mlの水にゆっくりと滴らせた後に、懸濁物をNaClと混合しかつ遠心分離した。遠心分離の廃液を水で数回洗浄した。
2.3 発色団のpH感受性の受容体色素のナノ粒子への結合
25mgのpH感受性の受容体色素N9(メルク(Merck))を8 Tr.濃H2SO4(メルク(Merck))とともに粉砕し、そしてウォータージェット真空中で30分間活性化した。色素を100mlの脱イオン水に吸収させ、そしてNaOHの助けを借りてpH7にした。上述された遠心分離の廃液をこの混合物に添加し、5分後に4.2gのNaCO3、および5分後に2mlの5M NaOHを添加した。さらなる20分後に、濃HCLによるpH3への酸性化を実施した。粒子を遠心分離により分離し、そして塩基性緩衝液、水およびエタノールで洗浄した。
【0053】
かように調製された粒子を水性の測定媒体に懸濁し、そして測定を多様なpH値でかつ空気およびN2飽和下で実施した。結果を図1に描き、そして、pH測定の目的上、pH感受性の粒子は試薬(=英語で「プローブ」)として測定媒体に添加してよいことを示す。
【0054】
測定媒体:pH7.3 空気飽和:50.0° O2を含まないN2飽和):51.3°
【図面の簡単な説明】
以下において、本発明は図1を参照してより詳細に説明することができ、ここで
【図1】 発明にかかる、pH測定のための本発明の試薬の較正曲線を表す。
Claims (5)
- 受容体色素、ならびに供与体色素を含有する粒子を含有し、それにより供与体色素および受容体色素が異なる化学相中に配置され、受容体色素は該粒子に結合したままで提供され、かつ、該粒子は該供与体色素の発光の特徴に影響を及ぼすサンプル媒体もしくはサンプル媒体の成分に本質的に不浸透性である、FRET原理に従ってアッセイを実施するための試薬。
- 無可塑ポリマーが粒子の素材として使用されることを特徴とする、請求項1記載の試薬。
- ポリアクリルニトリルおよびその誘導体、PVCならびに/もしくはポリ塩化ビニリデンがポリマーとして使用されることを特徴とする、請求項2記載の試薬。
- 測定媒体への請求項1ないし3のいずれか記載の試薬の添加を含んで成る、最低1種の被検体および/もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および/もしくは定量的測定方法。
- それがサンプルのpH値の測定またはサンプル中のイオンの濃度および/もしくは活量の測定のために実施されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
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CA2717563C (en) * | 2008-03-03 | 2017-02-28 | Kansas State University Research Foundation | Diagnostic assays for detecting protease activity associated with cancer |
WO2009152492A1 (en) * | 2008-06-13 | 2009-12-17 | University Of Connecticut | Nucleic acid materials for nonradiative energy transfer and methods of production and use |
WO2010135319A1 (en) * | 2009-05-18 | 2010-11-25 | University Of Connecticut | Nucleic acid-based photovoltaic cell |
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US4396579A (en) * | 1981-08-06 | 1983-08-02 | Miles Laboratories, Inc. | Luminescence detection device |
US4457977A (en) * | 1981-09-30 | 1984-07-03 | The Dow Chemical Company | Metallized plastic articles |
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US4929561A (en) * | 1985-08-08 | 1990-05-29 | Regents Of The University Of California | Absorption-emission optrode and methods of use thereof |
US4868103A (en) * | 1986-02-19 | 1989-09-19 | Enzo Biochem, Inc. | Analyte detection by means of energy transfer |
US4822746A (en) * | 1986-06-25 | 1989-04-18 | Trustees Of Tufts College | Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors |
US5254477A (en) * | 1986-06-25 | 1993-10-19 | Trustees Of Tufts College | Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods |
US5037615A (en) * | 1987-10-30 | 1991-08-06 | Cordis Corporation | Tethered pair fluorescence energy transfer indicators, chemical sensors, and method of making such sensors |
AT390517B (de) * | 1988-08-04 | 1990-05-25 | Avl Verbrennungskraft Messtech | Optischer sensor und verfahren zu dessen herstellung |
EP0381026A3 (de) | 1989-02-03 | 1991-05-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Optischer Sauerstoffsensor |
ATE106566T1 (de) * | 1989-11-21 | 1994-06-15 | Bayer Ag | Optischer biosensor. |
DE4208645A1 (de) * | 1992-03-18 | 1993-09-23 | Bayer Ag | Optischer festphasenbiosensor auf basis fluoreszenzfarbstoffmarkierter polyionischer schichten |
US5585235A (en) | 1993-04-13 | 1996-12-17 | Diagnescent Technologies, Inc. | Fluorescent assay and method that corrects for spectral interference |
JP3359409B2 (ja) * | 1994-01-12 | 2002-12-24 | 株式会社ナガオカ | 汚泥処理用加圧式脱水装置および汚泥処理方法 |
US5945526A (en) * | 1996-05-03 | 1999-08-31 | Perkin-Elmer Corporation | Energy transfer dyes with enhanced fluorescence |
FI102922B1 (fi) | 1996-06-28 | 1999-03-15 | Valtion Teknillinen | Fluoresenssiin perustuva immunomääritysmenetelmä |
AT405103B (de) * | 1996-10-16 | 1999-05-25 | Avl Verbrennungskraft Messtech | Sensorschicht zur quantitativen bestimmung zumindest einer chemischen komponente einer gasförmigen oder flüssigen probe |
AT405462B (de) * | 1997-05-30 | 1999-08-25 | Avl List Gmbh | Verfahren zur bestimmung eines alkaliions |
US6348322B1 (en) * | 1997-10-17 | 2002-02-19 | Duke University | Method of screening for specific binding interactions |
GB2341189B (en) * | 1998-08-31 | 2001-06-13 | Amersham Pharm Biotech Inc | Energy transfer dyes |
AT409307B (de) * | 1999-01-12 | 2002-07-25 | Hoffmann La Roche | Optisch-chemischer sensor |
GB9901072D0 (en) * | 1999-01-19 | 1999-03-10 | Imp Cancer Res Tech | Methods for detecting changes to a macromolecular component of a cell |
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