CN109701016B - 靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体及制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体及制备和应用，所述纳米药物递送载体包括纳米金三角片，纳米金三角片的表面依次连接复合物聚(4‑苯乙烯磺酸钠)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)形成纳米金三角片复合物；靶向肺癌基因的siRNA纳米药物吸附连接纳米金三角片复合物。本发明将siRNA纳米药物与GNPs/PSS/PDADMAC相连接，从而得到既具有靶向性，也具有光热治疗、免疫治疗双重作用的多功能纳米药物递送载体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药、光热治疗、免疫治疗、肿瘤治疗领域，具体地，涉及一种靶向肺癌基因的纳米药物递送载体的制备和应用。
背景技术
目前全球公认的癌症治疗手段通常包括手术、化疗、放疗以及免疫治疗，但因为肿瘤的差异性很大，这些手段仍然面临着严峻挑战，因为它们不足以有效的靶向癌症部位，不能彻底清除癌细胞，尤其是对晚期癌症患者。因此，越来越多的研究关注于提升对肿瘤的靶向性以及进行多种叠加治疗。光热治疗(PTT)对治疗各种癌症有很大的希望，这种疗法利用近红外激光照射肿瘤部位，通过引起肿瘤部位产生高温，从而杀伤肿瘤细胞，起到癌症治疗的作用。
传统的纳米药物载体递送系统靶向性较差，而且不具有光热效应。为了能有利于治疗各种癌症，急需开发一种具有靶向性，同时具有光热治疗、免疫治疗双重作用的多功能纳米药物递送载体。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体及制备和应用，将siRNA纳米药物与GNPs/PSS/PDADMAC相连接，从而得到既具有靶向性，也具有光热治疗、免疫治疗双重作用的多功能纳米药物递送载体。
根据本发明第一方面，提供一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体，所述纳米药物递送载体包括纳米金三角片，所述纳米金三角片的表面先连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)，形成纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物；再与所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物上连接聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)形成纳米金三角片复合物，即纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物(GNPs/PSS/PDADMAC)；靶向肺癌基因的siRNA纳米药物吸附连接所述纳米金三角片复合物，得到纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)-siRNA，即为靶向肺癌的多功能纳米药物递送载体。
优选地，所述靶向肺癌基因的siRNA纳米药物为靶向人类肺癌PD-L1、EGFR、KRAS任一种基因的siRNA纳米药物。
本发明将siRNA纳米药物与GNPs/PSS/PDADMAC相连接，从而得到即具有靶向性，也具有光热治疗、免疫治疗双重作用的多功能纳米药物递送载体。进一步为，通过静电吸附，将siRNA纳米药物吸附到GNPs/PSS/PDADMAC的表面，从而提高了荷载效率。
根据本发明的第二方面，提供一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，包括：
S1：合成纳米金三角片：通过碘化钾或碘化钠以及抗坏血酸，将纳米金球蚀刻为纳米金三角片；
S2：在所述纳米金三角片表面连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)，得到纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物；
S3：再将所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物表面连接复合物聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，得到所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物；
S4：将靶向肺癌基因的siRNA纳米药物与所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)通过静电吸附作用进行相连接，得到产物纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)-siRNA。
上述制备中，在纳米金三角片表面先后连接上PSS、PDADMAC，提高了纳米金三角片在水溶液中的稳定性以及生物相容性。
优选地，所述合成纳米金三角片，包括：将十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)与去离子水混合，再加入四氯金酸、碘化钾(KI)或碘化钠(NaI)、氢氧化钠(NaOH)，再加入抗坏血酸(比如L-AA)，轻微混匀，溶液颜色变为无色，然后加入氢氧化钠终止还原反应，得到的沉淀即为纳米金三角片。
上述步骤中：将纳米金球蚀刻为纳米金三角片，得到的纳米金三角片边长在40-120nm，形态均一，产量大于90％。
优选地，所述在所述纳米金三角片表面连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)，包括：在制备的所述纳米金三角片溶液，加入聚(4-苯乙烯磺酸钠)溶液和氯化钠溶液发生反应，常温条件下搅拌反应物，反应完成进行离心分离，收集沉淀，所述沉淀冻干后得到所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物。
优选地，所述再将所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物表面连接复合物聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，包括：在制备的所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物溶液中，加入聚(二烯丙基二甲基氯化铵)溶液和氯化钠溶液发生反应，常温条件下搅拌反应物，反应完成后进行离心分离，收集沉淀，将所述沉淀冻干后得到所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物。
优选地，所述将靶向肺癌基因的siRNA纳米药物与所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)通过静电吸附作用进行相连接，包括：在制备所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物加入所述靶向肺癌基因的siRNA纳米药物，其中，所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物和所述靶向肺癌的siRNA纳米药物的质量比例为5-8:1；混合后室温避光孵育，所述靶向肺癌基因的siRNA纳米药物将通过静电吸附于所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物的表面，得到产物。
优选地，GNPs/PSS/PDADMAC与siRNA的质量比例为：5-8:1。
根据本发明的第三方面，提供一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的应用，其中：所述纳米药物递送载体应用于制备纳米金三角片的光热治疗或免疫治疗药物；或，所述纳米药物递送载体作为治疗肺癌基因的药物的应用。
传统的纳米药物载体递送系统靶向性较差，而且不具有光热效应。本发明开发的基于纳米金三角片的多功能纳米药物递送载体，可实现肿瘤的靶向性，也可进行光热治疗和免疫治疗。比如，采用上述纳米药物递送载体制成的药物，可以用于治疗的肺癌肿瘤细胞为高表达PD-L1基因的肺癌肿瘤细胞的一种或多种；治疗时，所述纳米药物递送载体采用尾静脉注射方式注入，同时，在肿瘤部位采用近红外激光照射。通过siRNA纳米药物靶向性，主动靶向肺癌肿瘤细胞，进入肿瘤细胞后，敲除肿瘤细胞的PD-L1基因，招募免疫细胞进行肿瘤细胞的杀伤，同时，在近红外光的照射下引起光热效应，抑制肿瘤的生长。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明纳米药物递送载体可用于制备肿瘤治疗药物。与现有技术相比，本发明创新的将靶向肺癌基因的siRNA纳米药物与GNPs/PSS/PDADMAC相连接，从而得到既具有靶向性，也具有光热治疗、免疫治疗双重作用的多功能纳米药物递送载体。
本发明的制备方法中，将纳米金球蚀刻为纳米金三角片，得到的纳米金三角片边长在40-120nm，形态均一，产量大于90％；通过在纳米金三角片表面先后连接上PSS、PDADMAC，提高纳米金三角片在水溶液中的稳定性以及生物相容性。
进一步的，本发明实施例中合成的多功能纳米药物递送载体连接有PD-L1siRNA纳米药物，该纳米药物既可用于靶向肺癌基因，也可在进入肿瘤细胞后实现肿瘤细胞PD-L1基因的敲除，同时，该纳米药物载体中的纳米金三角片还具有光热治疗作用，从而实现对肿瘤的联合治疗(免疫治疗与光热治疗)并有效抑制肿瘤的生长。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是本发明一优选实施例中的纳米药物递送载体的制备方法流程图；
图2是本发明一优选实施例中的纳米药物递送载体的TEM表征图；
图3是本发明一优选实施例中的纳米药物递送载体的UV-vis图谱；
图4是本发明一优选实施例中的纳米药物递送载体用于联合治疗肺癌细胞HCC827的CCK-8结果图；
图5是本发明一优选实施例中的纳米药物递送载体用于联合治疗肺癌肿瘤模型的光热效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明的实施例提供一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体，该载体包括纳米金三角片复合物和靶向肺癌基因的siRNA纳米药物；其中，纳米金三角片的表面依次连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)形成所述纳米金三角片复合物；靶向肺癌基因的siRNA纳米药物吸附连接纳米金三角片复合物。
金纳米材料在近红外激光照射后，通过控制激光照射的功率与持续时间，温度可以升高至50-60摄氏度，这给肿瘤治疗提供了一个新的方向。本发明中采用纳米金三角片复合物来连接靶向肺癌基因的siRNA纳米药物。实际使用中，靶向肺癌基因的siRNA纳米药物可以是靶向人类肺癌PD-L1、EGFR、KRAS等任一种基因的siRNA纳米药物。这些基因均具有调控肿瘤增殖、转移等功能或用途，利用具有这些功能或用途的基因与纳米金三角片复合物结合之后，采用本发明上述的载体设计，实现既具有靶向性，也具有光热治疗、免疫治疗的双重目的。比如，在一优选实施例中，靶向肺癌基因的siRNA纳米药物可以采用PD-L1基因(PD-L1siRNA)。由于肿瘤细胞表面高表达PD-L1配体，可以与免疫细胞表面的PD-1受体相结合，从而引起免疫细胞的“衰弱”，降低或躲避免疫细胞的杀伤。而PD-L1siRNA纳米药物不仅可以主动识别高表达PD-L1的肿瘤细胞，在进入肿瘤细胞后，还可以敲除PD-L1基因，使肿瘤细胞不再表达PD-L1配体，如此，可以增强体内的免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。如图1所示，基于纳米金三角片制备的一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的示意图及作用方式，纳米药物递送载体的核心是纳米金三角片，然后在其表面连接上聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)，最后再连上PD-L1siRNA纳米药物。具体作用方式为：PD-L1siRNA可以靶向肺癌细胞，纳米药物递送载体被细胞胞吞后，一方面，在近红外激光照射后，纳米金三角片可以迅速升温，产生光热效应，从而导致肿瘤细胞的死亡，另外一方面，PD-L1siRNA可以沉默肿瘤细胞的PD-L1基因，从而导致T细胞能识别并杀伤肿瘤细胞，同时还能招募其它的免疫细胞到达肿瘤部位，进一步增强免疫治疗的效果。
在部分优选实施例中，所述聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)平均分子量(Mw)为：50000-150000。或者，所述聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDADMAC)平均分子量(Mw)为：50000-400000。纳米药物递送载体平均直径为40-120nm。
在部分优选实施例中，纳米金三角片与所述靶向肺癌基因的siRNA纳米药物的质量比例为5-8:1。
本发明的实施例还提供上述的靶向肺癌的多功能纳米药物递送载体的制备方法，可以按照以下步骤执行：
S1：合成纳米金三角片；包括通过碘化钾或碘化钠，以及L型抗坏血酸，将纳米金球蚀刻为纳米金三角片；
S2：在纳米金三角片表面连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)，得到纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物；
S3：再将纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物表面连接复合物聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，得到纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物；
S4：将靶向肺癌基因的siRNA纳米药物与纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)通过静电吸附作用进行相连接，得到产物纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(siRNAGNPs/PSS/PDADMAC-siRNA)(缩写为GNPs-siRNA)。通过静电吸附，将siRNA纳米药物吸附到GNPs/PSS/PDADMAC的表面，提高了荷载效率。
在部分优选实施例中，合成纳米金三角片的步骤包括：将十六烷基三甲基氯化铵与去离子水混合，再加入四氯金酸、碘化钾或碘化钠、氢氧化钠，再快速加入抗坏血酸发生还原反应，将反应物混合均匀，溶液颜色变为无色，然后再快速加入氢氧化钠终止还原反应，静置，然后进行离心分离，得到的沉淀即为纳米金三角片。
在部分优选实施例中，上述纳米金三角片的合成中：CTAC浓度为100-200mM，HAuCl4浓度为22-28mM，KI或NaI浓度为10-100mM，NaOH浓度为0.08-0.12M，AA浓度为32-128mM。合成所述纳米金三角片(GNPs)的反应条件：反应温度为28-30度；反应时间为5-10分钟；离心转速为10000-11000rpm，时间为10-30min。
在部分优选实施例中，纳米金三角片通过以下方法表面连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)，在制备的纳米金三角片溶液，加入聚(4-苯乙烯磺酸钠)溶液和氯化钠溶液发生反应，常温条件下搅拌反应物，反应完成进行离心分离，收集沉淀，沉淀冻干后得到纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物。
在部分优选实施例中，纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物通过以下方法表面连接复合物聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，在制备的纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物溶液中，加入聚(二烯丙基二甲基氯化铵)溶液和氯化钠溶液发生反应，常温条件下搅拌反应物，反应完成后进行离心分离，收集沉淀，将沉淀冻干后得到纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物。
在部分优选实施例中，靶向肺癌基因的siRNA纳米药物与纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物通过以下方法进行静电吸附，在制备纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物加入靶向肺癌基因的siRNA纳米药物，其中，纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物和靶向肺癌的siRNA纳米药物的质量比例为5-8:1；混合后室温避光孵育，靶向肺癌基因的siRNA纳米药物将通过静电吸附于纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物的表面，得到产物。
在部分优选实施例中：靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体应用于制备纳米金三角片的光热治疗或免疫治疗药物上。治疗的肿瘤细胞为高表达PD-L1基因的肺癌肿瘤细胞的一种或多种；治疗时，所述纳米药物递送载体采用尾静脉注射方式注入，同时，在肿瘤部位采用近红外激光照射。
基于上述靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体及制备方法，以下通过具体的实施例来详细说明，便于本领域技术人员进一步理解，但以下实施例并不用于限定本发明的范围。为了更好地进行说明，以下实施例中使用靶向肺癌基因的siRNA纳米药物为人类PD-L1siRNA，该siRNA纳米药物从公开渠道购买获得，比如从生物工程(上海)股份有限公司购买；当然，也可以从其他公司购买。
实施例1：
本实施例中提供一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，由以下步骤构成：
(1)纳米金三角片GNPs的合成
取1.6ml CTAC(十六烷基三甲基氯化铵，100mM)与8mL去离子水混合，随后加入80μL HAuCl4(25.4mM)，75μL KI(10mM)，20.3μL NaOH(0.1M)，快速加入80μL of AA(抗坏血酸，64mM)，轻微混匀，溶液颜色变为无色，然后快速加入20μL NaOH(0.1M)终止还原反应，将反应瓶应放置在28摄氏度的烘箱中，静置10分钟。然后进行离心分离，离心速度为11000rpm，30min，得到的沉淀即为纳米金三角片GNPs，平均直径为42±2.8nm。
(2)纳米金三角片表面连接复合物PSS
根据步骤(1)制备20ml GNPs溶液，加入4ml PSS溶液(10mg mL-1，使用1mM NaCl溶液配制)溶液和2mL NaCl溶液，常温条件下搅拌一小时，搅拌速度为450rpm。离心，转速为10000rpm，10分钟，收集沉淀，用超纯水洗2遍，沉淀冻干后即为GNPs/PSS。
(3)GNPs/PSS表面连接复合物PDADMAC
根据步骤(2)制备20ml GNPs/PSS溶液，加入4mL PDADMAC溶液(10mg mL-1，使用1mMNaCl溶液配制)溶液和2mL NaCl溶液，常温条件下搅拌一小时，搅拌速度为450rpm。离心，转速为10000rpm，10分钟，收集沉淀，用超纯水洗2遍，沉淀冻干后即为GNPs/PSS/PDADMAC。
(4)GNPs/PSS/PDADMAC与siRNA相连
siRNA纳米药物与GNPs/PSS/PDADMAC通过静电吸附连接。根据步骤(3)制备得到的GNPs/PSS/PDADMAC加入一定量的siRNA，即向750μl GNPs/PSS/PDADMAC溶液(浓度为10μgmL-1)中缓慢加入1.5μg PD-L1siRNA。混合后室温避光孵育30分钟。siRNA将通过静电吸附于GNPs/PSS/PDADMAC的表面。离心，转速为8000rpm，8分钟，沉淀冻干后即为GNPs/PSS/PDADMAC-siRNA(缩写为GNPs-siRNA)，即得到靶向肺癌的多功能纳米药物递送载体。
本实施例中，使用的靶向肺癌基因的siRNA纳米药物为人类PD-L1siRNA，该纳米药物既可用于靶向肺癌基因，也可在进入肿瘤细胞后实现肿瘤细胞PD-L1基因的敲除，同时，该纳米药物载体中的纳米金三角片还具有光热治疗作用，从而实现对肿瘤的联合治疗(免疫治疗与光热治疗)并有效抑制肿瘤的生长。该纳米药物可以精确识别并敲除人类PD-L1基因，从而肿瘤细胞表面不表达或低表达PD-L1配体，这就使得体内的免疫细胞的杀伤性能得以恢复，从而提高对肿瘤细胞的杀伤效果。此外，PD-L1基因的敲除，还会引起肿瘤细胞自身的增殖速度下降，迁移能力变弱。
实施例2：
本实施例提供一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，由以下步骤构成：
(1)纳米金三角片的合成
首先，取8mL CTAC(100mM)与40mL去离子水混合，随后依次加入400μL HAuCl4(25.4mM)，375μL KI或NaI(10mM)，115μL NaOH(0.1M)，混匀，此时溶液颜色是淡黄色；然后，快速加入400μL of AA(96mM)，轻微混匀，溶液颜色变为无色，然后快速加入50μL NaOH(0.1M)终止还原反应，反应瓶放置在29摄氏度的烘箱中，静置15分钟。然后进行离心，离心速度为10000rpm，20分钟，得到的沉淀即为纳米金三角片GNPs，平均直径为89±5.8nm。
(2)纳米金三角片表面连接复合物PSS
根据步骤(1)制备20ml GNPs溶液，加入4ml PSS溶液(10mg mL-1，使用1mM NaCl溶液配制)溶液和2mL NaCl溶液，常温条件下搅拌45min，搅拌速度为550rpm。离心，转速为11000rpm，10分钟，收集沉淀，用超纯水洗2遍，沉淀冻干后即为GNPs/PSS。
(3)GNPs/PSS表面连接复合物PDADMAC
根据步骤(2)制备20ml GNPs/PSS溶液，加入4mL PDADMAC溶液(10mg mL-1，使用1mMNaCl溶液配制)溶液和2mL NaCl溶液，常温条件下搅拌45min，搅拌速度为550rpm。离心，转速为11000rpm，10分钟，收集沉淀，用超纯水洗2遍，沉淀冻干后即为GNPs/PSS/PDADMAC。
(4)GNPs/PSS/PDADMAC与siRNA相连
siRNA纳米药物与GNPs/PSS/PDADMAC通过静电吸附连接。根据步骤(3)制备得到的GNPs/PSS/PDADMAC加入一定量的siRNA，即向1000μl GNPs/PSS/PDADMAC溶液(浓度为10μgmL-1)中缓慢加入2μg PD-L1siRNA。混合后室温避光孵育30分钟。siRNA将通过静电吸附于GNPs/PSS/PDADMAC的表面。离心，转速为7500rpm，10分钟，沉淀冻干后即为GNPs/PSS/PDADMAC-siRNA(缩写为GNPs-siRNA)，即得到靶向肺癌的多功能纳米药物递送载体。
实施例3
本实施例提供一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，由以下步骤构成：
(1)纳米金三角片的合成
首先，取1.6ml CTAC(100mM)与8mL去离子水混合，随后加入80μL HAuCl4(25.4mM)，100μL KI(10mM)，20.3μL NaOH(0.1M)，快速加入80μL of AA(128mM)，轻微混匀，溶液颜色变为无色，然后快速加入10μL NaOH(0.1M)终止还原反应，将反应瓶应放置在28摄氏度的烘箱中，静置10分钟。然后进行离心分离，离心速度为10000rpm，30min，得到的沉淀即为纳米金三角片GNPs，平均直径为115±7.8nm。
(2)GNPs表面连接复合物PSS
根据步骤(1)制备40mL GNPs溶液，加入8mL PSS溶液(10mg mL-1，使用1mM NaCl溶液配制)溶液和4mL NaCl溶液，常温条件下搅拌一小时，搅拌速度为500rpm。离心，转速为11000rpm，8分钟，收集沉淀，用超纯水洗2遍，沉淀冻干后即为GNPs/PSS。
(3)GNPs/PSS表面连接复合物PDADMAC
根据步骤(2)制备40mL GNPs/PSS溶液，加入8mL PDADMAC溶液(10mg mL-1，使用1mMNaCl溶液配制)溶液和4mL NaCl溶液，常温条件下搅拌50分钟，搅拌速度为500rpm。离心，转速为11000rpm，8分钟，收集沉淀，用超纯水洗2遍，沉淀冻干后即为GNPs/PSS/PDADMAC。
(4)siRNA纳米药物与GNPs/PSS/PDADMAC静电吸附
根据步骤(3)制备得到的GNPs/PSS/PDADMAC加入一定量的siRNA，即向2400μlGNPs/PSS/PDADMAC溶液(浓度为10μg mL-1)中缓慢加入3μg PD-L1siRNA。混合后室温避光孵育45分钟。siRNA将通过静电吸附于GNPs/PSS/PDADMAC的表面。离心，转速为6000rpm，15分钟，沉淀冻干后即为GNPs/PSS/PDADMAC-siRNA(缩写为GNPs-siRNA)，即得到靶向肺癌的多功能纳米药物递送载体。
如图2所示的TEM图片，实施例1、实施例2和实施例3制备的纳米金三角片GNPs，形态均一，三角的边长为40-120nm。
如图3所示的UV-vis图谱，实施例1、实施例2和实施例3制备的纳米金三角片GNPs，在615nm处出现了较强的吸收峰，而530nm处没有吸收峰，这说明制备的纳米金三角片纯度很高，几乎没有金球。
基于上述实施例1-3制备的纳米药物递送载体，以下通过实施例4、5的实验来证明它们对肺癌细胞的作用。下述实施例4、实施例5中所采用的表征方法有透射电子显微镜(TEM)，紫外光谱(UV-vis)等。通过CCK-8试剂盒检测纳米药物递送载体对肺癌细胞HCC827的治疗作用，以及用热成像仪来检测纳米药物递送载体靶向肿瘤部位并在激光照射后引起肿瘤部位温度升高。
实施例4：
GNPs-siRNA对肺癌细胞HCC827的治疗作用
为检测GNPs-siRNA对肺癌细胞HCC827的治疗作用，将HCC827细胞(10000个/孔)种植于2块96孔板，孵育12h。更换新鲜培养液后，分别加入40μg mL-1(金元素浓度)的GNPs-siRNA，GNPs，PBS，以及Lipo-siRNA(作为阳性对照组，使用Lipofectamine 3000转染PD-L1siRNA)，然后在37度CO2培养箱中继续培养12h。其中一块板使用808nm激光照射，激光功率为800mW cm-2，照射3分钟。另外一块板不做任何激光处理。然后继续培养12小时，使用CCK-8试剂盒检测细胞活性。
如图4所示，本实施例的结果表明：(1)PBS阴性对照组，不管是否照射激光，细胞均保持很好的活性。(2)GNPs组，未照射激光时，细胞活性很好，说明了GNPs纳米材料很好的生物相容性；照射激光后，由于纳米金三角片的光热作用，导致HCC827细胞活性下降很快。(3)Lipo-siRNA组，未照射激光，细胞活性出现下降，这说明PD-L1基因的敲除可引起HCC827细胞增殖下降和活性下降；照射激光后，对细胞的活性的影响不大。(4)GNPs-siRNA组，未照射激光，由于siRNA的基因敲除作用，HCC827细胞的增殖受到了影响，细胞活性下降；激光照射后，在基因沉默以及光热作用的双重效果下，HCC827细胞活性大幅度的下降。
实施例5：
GNPs-siRNA对小鼠肿瘤模型的治疗作用
本实施例中选用4-6周的BALB/c裸鼠用于建立肺癌肿瘤模型，将一定数量的肺癌HCC827细胞接种至裸鼠的皮下，待肿瘤体积约180mm3即可用于光热治疗。将肿瘤模型分为三种：(1)PBS对照组，(2)GNPs处理组，(3)GNPs-siRNA处理组。分别尾静脉注射100μL PBS、GNPs、GNPs-siRNA。24h后，对肿瘤部位进行激光照射。如图5所示，激光照射后，其中，GNPs组与GNPs-siRNA组，肿瘤部位的温度分别升高至：41.2与41.5摄氏度。而PBS对照组的温度为36.5摄氏度。
通过本实施例进一步说明了GNPs-siRNA纳米药物递送载体具有很好的靶向性，可以靶向到肿瘤部位并进入到细胞内；同时纳米金三角片的光热作用带来的温度升高也可杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长。
上述优选实施例以PD-L1siRNA为例，对本发明的纳米药物递送载体及其制备和用途进行了详细说明，但上述PD-L1siRNA纳米药物仅是本发明siRNA纳米药物的一个优选，在其他实施例中，也可以根据实际情况选择其他的靶向肺癌基因的siRNA纳米药物。本发明的siRNA纳米药物不限于PD-L1siRNA，只要具有调控肿瘤增殖、转移等功能或用途的基因，与纳米金三角片复合物结合之后，都能实现既具有靶向性，也具有光热治疗、免疫治疗的双重目的。其具体实现的原理与上述PD-L1siRNA相同，在此不再赘述。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (7)
1.一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体，其特征在于，所述纳米药物递送载体包括纳米金三角片，所述纳米金三角片的表面连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)，形成纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物；再在所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物上连接聚(二烯丙基二甲基氯化铵)形成纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物即纳米金三角片复合物；靶向肺癌基因的siRNA纳米药物吸附连接所述纳米金三角片复合物，得到纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)-siRNA，即靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体；
所述靶向肺癌基因的siRNA纳米药物为靶向人类肺癌PD-L1基因的siRNA纳米药物；
所述聚(4-苯乙烯磺酸钠)平均分子量为：50000-150000Mw；
所述聚(二烯丙基二甲基氯化铵)平均分子量为：50000-400000Mw；
所述纳米药物递送载体平均直径为40-120nm；
所述纳米金三角片与所述靶向肺癌基因的siRNA纳米药物的质量比例为(5-8):1。
2.一种权利要求1所述的靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，其特征在于，包括：
S1：合成纳米金三角片：通过碘化钾或碘化钠以及抗坏血酸，将纳米金球蚀刻为纳米金三角片；
S2：在所述纳米金三角片表面连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)，得到纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物；
S3：再将所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物表面连接复合物聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，得到所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物；
S4：将靶向肺癌基因的siRNA纳米药物与所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)通过静电吸附作用进行相连接，得到产物纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)-siRNA。
3.根据权利要求2所述的一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，其特征在于，所述合成纳米金三角片，包括：将十六烷基三甲基氯化铵与去离子水混合，再加入四氯金酸、碘化钾或碘化钠、氢氧化钠，再快速加入抗坏血酸发生还原反应，将反应物混合均匀，溶液颜色变为无色，然后再快速加入氢氧化钠终止还原反应，静置，然后进行离心分离，得到的沉淀即为纳米金三角片。
4.根据权利要求2所述的一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，其特征在于，所述在所述纳米金三角片表面连接复合物聚(4-苯乙烯磺酸钠)，包括：
制备的所述纳米金三角片的溶液，加入聚(4-苯乙烯磺酸钠)溶液和氯化钠溶液发生反应，常温条件下搅拌反应物，反应完成进行离心分离，收集沉淀，所述沉淀冻干后得到所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物。
5.根据权利要求2所述的一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，其特征在于，所述将所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物表面连接复合物聚(二烯丙基二甲基氯化铵)，包括：
制备的所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)复合物的溶液，加入聚(二烯丙基二甲基氯化铵)溶液和氯化钠溶液发生反应，常温条件下搅拌反应物，反应完成后进行离心分离，收集沉淀，将所述沉淀冻干后得到所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物。
6.根据权利要求2所述的一种靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的制备方法，其特征在于，所述将靶向肺癌基因的siRNA纳米药物与所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)通过静电吸附作用进行相连接，包括：
在所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物加入所述靶向肺癌的siRNA纳米药物，其中，所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物和所述靶向肺癌基因的siRNA纳米药物的质量比例为(5-8):1；混合后室温避光孵育，所述靶向肺癌基因的siRNA纳米药物将通过静电吸附于所述纳米金三角片/聚(4-苯乙烯磺酸钠)/聚(二烯丙基二甲基氯化铵)复合物的表面，得到产物。
7.一种权利要求1所述的靶向肺癌基因的多功能纳米药物递送载体的应用，其特征在于：所述纳米药物递送载体应用于制备纳米金三角片的光热治疗或免疫治疗药物；或，所述纳米药物递送载体应用于制备治疗肺癌基因的药物。
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