CN109674990A - 具有调节egfr作用的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有调节EGFR作用的组合物及其制备方法，所述组合物包括黄花蒿、银杏、桔梗、姜黄、绞股蓝、葡萄、蜂蜜、蕉科植物萃取液和桃胶，所述组合物的制备方法如下：先对8‑12重量份的黄花蒿进行提取，得黄花蒿提取物，并在20‑30份重量份的葡萄发酵后加入5‑10重量份的银杏和2‑4重量份的绞股蓝，得浓缩液和混合物，再将2‑4重量份的姜黄、5‑10重量份的桃胶、所述黄花蒿提取物和所述混合物干燥后粉碎，再加入所述浓缩液混合均匀后，压制成球型药丸，然后在所述药丸外部浇注5‑8重量份的蜂蜜和1‑2重量份的蕉科植物萃取液，即得。本发明操作步骤简单易行，无毒副作用，且对提高人体免疫力具有良好的效果。

Description

具有调节EGFR作用的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及植物药用领域。更具体地说，本发明涉及一种具有调节EGFR作用的组合物及其制备方法。
背景技术
肝癌，是我国最常见且恶性程度最高的肿瘤之一，目前，手术切除仍是治疗原发性肝癌的首选方法。然而根治性切除后患者的5年复发率高、转移率高，这成为肝癌临床治疗的难题。因此，探寻肝癌细胞侵袭转移的特异性规律，并针对此寻找有效的药物干预手段将有可能为抗肝癌新药的开发以及临床肝癌的个体化治疗提供新的思路和方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明的一个目的是提供一种具有调节EGFR作用的组合物及其制备方法，所述组合物包括黄花蒿、银杏、桔梗、姜黄、绞股蓝、葡萄、蜂蜜、蕉科植物萃取液和桃胶，所述组合物的制备方法如下：先对8-12重量份的黄花蒿进行提取，得黄花蒿提取物，并将20-30份重量份的葡萄发酵后加入5-10重量份的银杏和2-4重量份的绞股蓝再进行振荡和过滤，得混合液和混合物，将所述混合液浓缩10倍后得浓缩液，再将2-4重量份的姜黄、5-10重量份的桃胶、所述黄花蒿提取物和所述混合物干燥后粉碎，再加入所述浓缩液混合均匀后，压制成球型药丸，然后在所述药丸外部浇注5-8重量份的蜂蜜和1-2重量份的蕉科植物萃取液，即得。本发明操作步骤简单易行，无毒副作用，且对提高人体免疫力具有良好的效果。
为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种具有调节EGFR作用的组合物，其按重量份计包括：黄花蒿8-12份、银杏5-10份、桔梗7-10份、姜黄2-4份、绞股蓝2-4份、葡萄20-30份、蜂蜜5-8份、蕉科植物萃取液1-2份和桃胶5-10份。
还提供了一种具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、取8-12重量份的黄花蒿清洗、干燥并粉碎后，加入20-30重量份的丙酮和7-10重量份的桔梗，并置于0-4℃下放置24-48h，再置于30kHz的超声波中处理20-30min后，置于40-50℃的旋转蒸发器中40-60min，得黄花蒿提取物；
S2、取20-30份重量份的葡萄清洗、表面干燥后压碎，再于常温下放入25-28kHz的超声波中处理5-8min后，置于常温下避光放置1-2d，然后移入5-10℃下密封并避光放置5-8d，再加入5-10重量份的银杏和2-4重量份的绞股蓝混合均匀后，移入常温下200-400r/min的摇床中振荡40-80min，再过滤，得混合液和混合物，将所述混合液浓缩10倍后得浓缩液；
S3、分别取2-4重量份的姜黄、5-10重量份的桃胶、所述黄花蒿提取物和所述混合物干燥后粉碎，再加入所述浓缩液混合均匀，置于40-60℃下熬制20-30min后，压制成球型药丸；
S4、在所述药丸的外部浇注5-8重量份的蜂蜜，置于40-50℃下干燥，得组合物，其中，所述蜂蜜中还有1-2重量份的蕉科植物萃取液。
优选的是，所述的具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，所述混合液在浓缩之前加入了1-2重量份的烟草花蛋白，所述烟草花蛋白的提取方法如下：
Y1、取5-8重量份的烟草花清洗、干燥后，用液氮研磨至粉末，再加入20-30重量份的质量分数为10％的TCA丙酮溶液并振荡均匀后，置于4℃下以10000-12000r/min离心5-8min，弃去上清液，得第一沉淀物，向所述第一沉淀物中加入15-30重量份的质量分数为80％的乙醇溶液，再次置于4℃下以10000-12000r/min离心5-8min，弃去上清液，得第二沉淀物；
Y2、向第二沉淀物中加入20-30重量份的丙酮溶液，置于摇床中于200-400r/min处理10-20min，再次置于4℃下以10000-12000r/min离心5-8min后，弃去上清液，得第三沉淀物，再将所述第三沉淀物置于室温下干燥10-20min后，再加入15-30重量份的质量分数为60％的乙醇溶液，置于-20℃下放置10-20min，再置于4℃下以10000-12000r/min离心5-8min，弃去上清液，得第四沉淀物，用无水乙醇洗涤3次所述第四沉淀物后干燥，得烟草花蛋白。
优选的是，所述的具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，S4中所述蜂蜜中还含有10-12重量份的搅拌物，所述搅拌物的制备方法如下：取8-10重量份的小麦芽置于40-50℃下烘烤10-20min后，加入0.1-0.2重量份的酵母菌混合均匀，再置于常温下遮光放置4-6h后，加入4-6重量份的壳聚糖搅拌混合均匀即得。
优选的是，所述的具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，所述蕉科植物萃取液的制备方法如下：取20-40重量份的香蕉树皮或树茎或树叶清洗干净后，置于40-50℃下干燥4-8h，再粉碎后过10-20目筛，得粉碎料，向所述粉碎料中加入50-70重量份的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，并置于40-50℃下20-40kHz的超声波中处理40-60min后，于4000-6000r/min下离心25-40min，取上层液体，得第一离心液，在所述第一离心液中加入25-35重量份的质量分数为4％的氯化钠溶液，并置于10-20℃下20-40kHz的超声波中处理40-60min后，于4000-6000r/min下离心25-40min，取上层液体，得第二离心液，将所述第二离心液过80-100目筛，浓缩10倍，即得。
优选的是，所述的具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，所述桔梗、所述银杏和所述绞股蓝在使用之前均研磨成粉末，并分别过40-100目筛。
本发明至少包括以下有益效果：
第一，本发明中含有黄花蒿、银杏、桔梗、姜黄、绞股蓝、葡萄、蜂蜜、蕉科植物萃取液和桃胶多种组分，富含多种营养物质，对人体具有良好的营养供给作用。
第二、本发明中在黄花蒿的提取过程中加入桔梗，桔梗中含有皂苷而有效的避免了黄花蒿提取物在提取过程中发生氧化，从而提高了黄花蒿提取物的产率。
第三、本发明中利用发酵后葡萄对银杏和绞股蓝进行提取，既避免了使用乙醇后后续的除乙醇操作，又在混合液和混合物中混入了葡萄中的营养成分，赋予了混合液和混合物独特的风味和口感。
第四、本发明中将所述黄花蒿提取物、所述混合物、姜黄、桃胶和所述浓缩液混合后，压制成球型药丸，再在所述药丸外部浇注蜂蜜和蕉科植物萃取液，使外部的蜂蜜和蕉科植物萃取液层为内部的药丸提供了一个密封而抗菌的环境，延长了药丸的保质期，而且外部的蜂蜜和蕉科植物萃取液具有良好的口感和营养，提高了药丸的食用性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
具有调节EGFR作用的组合物，其按重量份计包括：黄花蒿8份、银杏5份、桔梗7份、姜黄2份、绞股蓝2份、葡萄20份、蜂蜜5份、蕉科植物萃取液1份和桃胶5份。
<实施例2>
具有调节EGFR作用的组合物，其按重量份计包括：黄花蒿12份、银杏10份、桔梗10份、姜黄4份、绞股蓝4份、葡萄30份、蜂蜜8份、蕉科植物萃取液2份和桃胶10份。
<实施例3>
具有调节EGFR作用的组合物，其按重量份计包括：黄花蒿10份、银杏8份、桔梗8份、姜黄3份、绞股蓝3份、葡萄25份、蜂蜜6份、蕉科植物萃取液1份和桃胶7份。
<实施例4>
在实施例3的基础上，具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，包括以下步骤：
S1、取10重量份的黄花蒿清洗、干燥并粉碎后，加入25重量份的丙酮和8重量份的桔梗，并置于2℃下放置36h，再置于30kHz的超声波中处理25min后，置于45℃的旋转蒸发器中50min，得黄花蒿提取物；
S2、取25份重量份的葡萄清洗、表面干燥后压碎，再于常温下放入26kHz的超声波中处理6min后，置于常温下避光放置2d，然后移入7℃下密封并避光放置6d，再加入8重量份的银杏和3重量份的绞股蓝混合均匀后，移入常温下300r/min的摇床中振荡60min，再过滤，得混合液和混合物，将所述混合液浓缩10倍后得浓缩液；
S3、分别取3重量份的姜黄、7重量份的桃胶、所述黄花蒿提取物和所述混合物干燥后粉碎，再加入所述浓缩液混合均匀，置于50℃下熬制25min后，压制成球型药丸；
S4、在所述药丸的外部浇注6重量份的蜂蜜，置于45℃下干燥，得组合物，其中，所述蜂蜜中还有1重量份的蕉科植物萃取液。
<实施例5>
在实施例4的基础上，所述混合液在浓缩之前加入了1重量份的烟草花蛋白，所述烟草花蛋白的提取方法如下：
Y1、取6重量份的烟草花清洗、干燥后，用液氮研磨至粉末，再加入25重量份的质量分数为10％的TCA丙酮溶液并振荡均匀后，置于4℃下以11000r/min离心6min，弃去上清液，得第一沉淀物，向所述第一沉淀物中加入22重量份的质量分数为80％的乙醇溶液，再次置于4℃下以11000r/min离心6min，弃去上清液，得第二沉淀物；
Y2、向第二沉淀物中加入20-30重量份的丙酮溶液，置于摇床中于300r/min处理15min，再次置于4℃下以11000r/min离心6min后，弃去上清液，得第三沉淀物，再将所述第三沉淀物置于室温下干燥15min后，再加入22重量份的质量分数为60％的乙醇溶液，置于-20℃下放置15min，再置于4℃下以11000r/min离心6min，弃去上清液，得第四沉淀物，用无水乙醇洗涤3次所述第四沉淀物后干燥，得烟草花蛋白。
<实施例6>
在实施例5的基础上，S4中所述蜂蜜中还含有11重量份的搅拌物，所述搅拌物的制备方法如下：取9重量份的小麦芽置于45℃下烘烤15min后，加入0.1重量份的酵母菌混合均匀，再置于常温下遮光放置5h后，加入5重量份的壳聚糖搅拌混合均匀即得。
<实施例7>
在实施例6的基础上，所述蕉科植物萃取液的制备方法如下：取30重量份的香蕉树皮或树茎或树叶清洗干净后，置于45℃下干燥4-8h，再粉碎后过15目筛，得粉碎料，向所述粉碎料中加入60重量份的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，并置于45℃下30kHz的超声波中处理50min后，于5000r/min下离心30min，取上层液体，得第一离心液，在所述第一离心液中加入30重量份的质量分数为4％的氯化钠溶液，并置于15℃下30kHz的超声波中处理50min后，于5000r/min下离心30min，取上层液体，得第二离心液，将所述第二离心液过90目筛，浓缩10倍，即得。
<实施例8>
在实施例7的基础上，所述桔梗、所述银杏和所述绞股蓝在使用之前均研磨成粉末，并分别过70目筛。
<对比例1>
在实施例8的基础上，所述蜂蜜中不含1重量份的蕉科植物萃取液。
<对比例2>
在实施例8的基础上，所述搅拌物的制备方法如下：取9重量份的小麦芽置于45℃下烘烤15min后，加入5重量份的壳聚糖搅拌混合均匀即得。
<对比例3>
在实施例8的基础上，所述蕉科植物萃取液的制备方法如下：取30重量份的香蕉树皮或树茎或树叶清洗干净后，置于45℃下干燥4-8h，再粉碎后过15目筛，得粉碎料，向所述粉碎料中加入60重量份的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，并置于45℃下30kHz的超声波中处理50min后，于5000r/min下离心30min，取上层液体，得第一离心液，将所述第一离心液过90目筛，浓缩10倍，即得。
<对比例4>
在实施例8的基础上，S1中取10重量份的黄花蒿清洗、干燥并粉碎后，加入25重量份的丙酮，并置于2℃下放置36h，再置于30kHz的超声波中处理25min后，置于45℃的旋转蒸发器中50min，得黄花蒿提取物。
<结果分析>
1、将对比例1-4和实施例8所得的组合物进行品质和得率比较，其中，组合物的得率＝m’/m，m’为组合物重量，m为黄花蒿、银杏、桔梗、姜黄、绞股蓝、葡萄、蜂蜜、蕉科植物萃取液和桃胶的重量和，结果见表1。
表1组合物的感官和得率
从表1中可知，相比于对比例1-2和对比例4，对比例3和实施例8所得的组合物的得率较高，而对比例4的得率最低，为58.8％，这是由于对比例4中未加入桔梗，黄花蒿在提取过程中发生氧化，产生的黄花蒿提取物少，故而得到的组合物也变少，而且使得组合物的滋味相对于对比例1-3和实施例8要甜一些；对比例1中未加入蕉科植物萃取液，使得组合物表面的抗菌性降低，容易滋生细菌，故光泽度降低；对比例2中组合物表面凹凸不平，这是由于小麦芽在烘烤后未加入酵母菌充分发酵，未充分结合在一起，颗粒性大，出现为混匀情况；对比例3中的蕉科植物萃取液由第一离心液浓缩而来，得到的组合物最高，但是由于蕉科植物萃取液提取液提取不充分，蕉科植物萃取液的抗菌效果不佳，组合物表面容易受细菌侵染而无光泽，极度影响组合物的美观和保质期。故相比于对比例1-4，实施例8具有较高的得率和较好的感观。
2、动物毒理学实验，选用18-22克SPF级昆明种小鼠180只，雌雄各半，并随机分为6组，每组30只，分别标记为1组、2组、3组、4组、5组和空白组，且每组内又分为A、B、C小组，其中，1组、2组、3组、4组、5组分别灌胃对比例1-4和实施例8所得的组合物，其中，A、B、C小组分别对应灌胃量为2.5g/次、5g/次和7.5g/次，每天2次，2次灌胃中间间隔12h，灌胃7天，空白组灌胃等量的饭粒，实验前各组小鼠均禁食12h，灌胃后连续观察10天，实验结果表明：与空白组对比，1组、2组、3组、4组、5组中对应的A、B、C小组的小鼠的饮食、体重增长、饮水等均未见明显差异，且停止灌胃后液未表现出饮食、体重增长、饮水等均未见明显差异。因此本发明对比例1-4和实施例8所得的组合物的急性毒性低，临床用药安全。
3、抑瘤实验(MTT法)。取Hepa1-6/HBx小鼠肝癌细胞株，培养于含10％灭活胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，于37℃，5％CO2培养箱及饱和湿度条件下培养，3-4天传代一次。将对数生长期Hep-B3肝癌细胞用胰酶消化后配制成浓度为3×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔酶标板，每孔加200μL细胞悬液，24h后换不含血清培养液使细胞同步化生长，每孔200μL。共接种108个孔，每18个孔为1组，共6组。其中5组分别加入对比例1-4和实施例8所得的组合物，余下一组作为对照组。第三天向孔中加入用水配置成的组合物药液50μL；另设对照组：每孔加水50μL。加组合物的每组分别设0.01，0.1，1，10，100，1000μg/mL6个浓度，每个浓度设3个平行孔，于37℃下培养24h后，每孔加无血清无酚红培养液新鲜配制的0.5mg/mL的MTT100μL，继续培养4h，然后，每孔加100μLDMSO溶解MTT甲臜颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定光密度值(OD)，实验重复三次，取平均值。以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，由OD值计算抑制率，公式为：细胞生长抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD×100％，结果见表2。
表2组合物对肿瘤细胞株的抑制率
由表2可知，与对比例1-4相比，实施例8具有较高的肝癌细胞抑制率，为63.4％，且对比例1-4均具有一定的肝癌细胞抑制率，说明本发明制备的组合物对肝癌细胞活性具有一定的抑制效果。
3、检测EGFR的突变率。EGFR广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。正常的EGFR基因对控制多种细胞生长不可或缺，对表皮生长非常重要，如果没有EGFR信号，我们皮肤受伤后就无法愈合。但在通常情况下EGFR的作用都是短暂的且受到严密的控制，它在完成功能(比如促进伤口愈合后)就会被关闭。但在肝癌患者中EGFR由于种种原因产生突变，导致它不能被关闭，开始无休止地刺激细胞生长，最终导致癌症的发生，乃至转移。判断EGFR基因第18、19、20、21外显子突变区域是EGFR基因突变检测的标准。
将2.5×106个Hepa1-6/HBx小鼠肝癌细胞接种于18-22克SPF级昆明种小鼠的右侧韧皮下，当肿瘤直径达3mm时，随机分为6组，每组10只，并分别标记为1组、2组、3组、4组、5组和空白组，其中，1组、2组、3组、4组、5组分别灌胃对比例1-4和实施例8所得的组合物，空白组灌胃等量的饭粒，其中，每组的灌胃量为2.5g/次、每天2次，2次灌胃中间间隔12h，灌胃7天，灌胃后连续观察30天后将各组小鼠颈椎脱臼处死，取肿瘤组织、癌性胸腔积液以及外周血等样品，在提取样品的DNA，并用PCR技术对提取的DNA进行扩增后进行测序，判断EGFR基因是否突变，突变率＝(EGFR突变基因数)/EGFR总基因数×100％结果见表3。
表3组合物对EGFR基因的突变率的影响
由表3可知，相比于对照组，对比例1-4和实施例8的EGFR基因的突变率均有所降低，说明本发明制备的组合物对EGFR基因的突变具有一定的抑制效果，且1组、2组、3组、4组、5组的肿瘤直径相比于对照组也有所减小，也说明了EGFR基因的突变直接影响肝癌细胞的生长情况，说明本发明所得的组合物是从基因上调控癌细胞的生长变化，从而对癌症进行抑制。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (6)

1.具有调节EGFR作用的组合物，其特征在于，其按重量份计包括：黄花蒿8-12份、银杏5-10份、桔梗7-10份、姜黄2-4份、绞股蓝2-4份、葡萄20-30份、蜂蜜5-8份、蕉科植物萃取液1-2份和桃胶5-10份。
2.具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取8-12重量份的黄花蒿清洗、干燥并粉碎后，加入20-30重量份的丙酮和7-10重量份的桔梗，并置于0-4℃下放置24-48h，再置于30kHz的超声波中处理20-30min后，置于40-50℃的旋转蒸发器中40-60min，得黄花蒿提取物；
S2、取20-30份重量份的葡萄清洗、表面干燥后压碎，再于常温下放入25-28kHz的超声波中处理5-8min后，置于常温下避光放置1-2d，然后移入5-10℃下密封并避光放置5-8d，再加入5-10重量份的银杏和2-4重量份的绞股蓝混合均匀后，移入常温下200-400r/min的摇床中振荡40-80min，再过滤，得混合液和混合物，将所述混合液浓缩10倍后得浓缩液；
S3、分别取2-4重量份的姜黄、5-10重量份的桃胶、所述黄花蒿提取物和所述混合物干燥后粉碎，再加入所述浓缩液混合均匀，置于40-60℃下熬制20-30min后，压制成球型药丸；
S4、在所述药丸的外部浇注5-8重量份的蜂蜜，置于40-50℃下干燥，得组合物，其中，所述蜂蜜中还有1-2重量份的蕉科植物萃取液。
3.如权利要求2中所述的具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，其特征在于，所述混合液在浓缩之前加入了1-2重量份的烟草花蛋白，所述烟草花蛋白的提取方法如下：
Y1、取5-8重量份的烟草花清洗、干燥后，用液氮研磨至粉末，再加入20-30重量份的质量分数为10％的TCA丙酮溶液并振荡均匀后，置于4℃下以10000-12000r/min离心5-8min，弃去上清液，得第一沉淀物，向所述第一沉淀物中加入15-30重量份的质量分数为80％的乙醇溶液，再次置于4℃下以10000-12000r/min离心5-8min，弃去上清液，得第二沉淀物；
Y2、向第二沉淀物中加入20-30重量份的丙酮溶液，置于摇床中于200-400r/min处理10-20min，再次置于4℃下以10000-12000r/min离心5-8min后，弃去上清液，得第三沉淀物，再将所述第三沉淀物置于室温下干燥10-20min后，再加入15-30重量份的质量分数为60％的乙醇溶液，置于-20℃下放置10-20min，再置于4℃下以10000-12000r/min离心5-8min，弃去上清液，得第四沉淀物，用无水乙醇洗涤3次所述第四沉淀物后干燥，得烟草花蛋白。
4.如权利要求2中所述的具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，其特征在于，S4中所述蜂蜜中还含有10-12重量份的搅拌物，所述搅拌物的制备方法如下：取8-10重量份的小麦芽置于40-50℃下烘烤10-20min后，加入0.1-0.2重量份的酵母菌混合均匀，再置于常温下遮光放置4-6h后，加入4-6重量份的壳聚糖搅拌混合均匀即得。
5.如权利要求2中所述的具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，其特征在于，所述蕉科植物萃取液的制备方法如下：取20-40重量份的香蕉树皮或树茎或树叶清洗干净后，置于40-50℃下干燥4-8h，再粉碎后过10-20目筛，得粉碎料，向所述粉碎料中加入50-70重量份的质量分数为0.9％的氯化钠溶液，并置于40-50℃下20-40kHz的超声波中处理40-60min后，于4000-6000r/min下离心25-40min，取上层液体，得第一离心液，在所述第一离心液中加入25-35重量份的质量分数为4％的氯化钠溶液，并置于10-20℃下20-40kHz的超声波中处理40-60min后，于4000-6000r/min下离心25-40min，取上层液体，得第二离心液，将所述第二离心液过80-100目筛，浓缩10倍，即得。
6.如权利要求2中所述的具有调节EGFR作用的组合物的制备方法，其特征在于，所述桔梗、所述银杏和所述绞股蓝在使用之前均研磨成粉末，并分别过40-100目筛。
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