CN109661404A - 改造丝心蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种改造丝心蛋白，其为包含式1：[(A)n基序‑REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，其中，结构域序列具有包含局部疏水性指数大的区域的氨基酸序列，该氨基酸序列是与天然来源的丝心蛋白相比相当于REP中的一个或两个以上氨基酸残基被置换成疏水性指数大的氨基酸残基、和/或在REP中插入了一个或两个以上疏水性指数大的氨基酸残基的氨基酸序列。式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序等彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。

Description

改造丝心蛋白
技术领域
本发明涉及改造丝心蛋白。更具体而言，本发明涉及具有局部疏水性指数大的氨基酸序列的改造丝心蛋白。另外，本发明还涉及编码改造丝心蛋白的核酸、包含该核酸序列的表达载体、利用该表达载体进行了转化的宿主和由改造丝心蛋白制造的产品。
背景技术
丝心蛋白为纤维状蛋白质中的一种，其含有最多达90％的与β折叠片层的形成相关的甘氨酸残基、丙氨酸残基和丝氨酸残基(非专利文献1)。作为丝心蛋白，已知有构成昆虫和蜘蛛类产生的丝的蛋白质(蚕丝蛋白、蜂丝蛋白、蛛丝蛋白)等。
蚕丝蛋白具有优良的机械特性、吸湿特性和除臭特性，是广泛作为衣服原料使用的原材料。另外，蚕丝为免疫耐受的天然纤维，生物亲和性高，因此也用于手术用缝合线等用途。
蜘蛛中存在最多达7种的丝腺，分别产生性质不同的丝心蛋白(蛛丝蛋白)。蛛丝蛋白根据其来源的器官被命名为具有高韧性的大壶状腺丝蛋白(major ampullate spiderprotein、MaSp)、具有高度伸长力的小壶状腺丝蛋白(minor ampullate spider protein、MiSp)、以及鞭状腺(flagelliform(Flag))、管状腺(tubuliform)、聚状腺(aggregate)、葡萄状腺(aciniform)和梨状腺(pyriform)的各蛛丝蛋白。特别是对由于具有优良的强度和伸度而具有高韧性的大壶状腺丝蛋白，集中进行了结构的研究(专利文献1和专利文献2)。
作为丝心蛋白的特异性结构之一，已知有分类为GPGXX、富含丙氨酸残基的伸长区域((A)n或(GA)n)、GGX和间隔区的氨基酸基序重复而成的结构(非专利文献2)。另外，据报道，通过用(A)n基序置换(GA)n基序，伸度减小，但拉伸强度增加；通过增加GPGXX基序的数量，伸度增加；通过用(A)n基序置换若干个GPGXX基序，拉伸强度增加(专利文献2)。另外，认为GGX和GPGXX基序呈对丝赋予弹性的挠性螺旋结构(专利文献3)。
利用一些杂蛋白生产系统产生了重组蛛丝蛋白和重组蚕丝蛋白。例如，利用了转基因山羊、转基因蚕、或者重组植物或哺乳类细胞(非专利文献3)。但是，这些生产系统的生产速度慢，不适合与商业水平相应的大量生产(专利文献4和5)。作为能够进行大量生产的生产系统，也报道了很多利用酵母、霉菌、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌等生物进行的重组丝心蛋白生产并取得了一定的成果，但尚未达到能够在工业上大量生产伸度和拉伸强度优良的重组丝心蛋白的程度(专利文献5)。
已知将蛛丝蛋白成形为各种形状而成的成形体。例如，在专利文献6中公开了使用蛛丝蛋白的膜。另外，在专利文献7中公开了来源于蛛丝蛋白的多肽颗粒。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-55269号公报
专利文献2：日本特表2005-502347号公报
专利文献3：日本特表2009-505668号公报
专利文献4：日本特表2014-502140号公报
专利文献5：国际公开第2015/042164号
专利文献6：日本特表2008-507260号公报
专利文献7：国际公开第2014/61043号
非专利文献
非专利文献1：Asakura等,Encyclopedia of Agricultural Science,AcademicPress:New York,NY,1994年,Vol.4,pp.1-11
非专利文献：Microbial Cell Factories,2004年,3：14
非专利文献3：Science,2002年,295卷,pp.472-476
发明内容
发明所要解决的课题
丝心蛋白由于其优良的特性，作为医疗、航空、衣料等各种产业领域中的新材料而受到关注。另外，丝心蛋白也能够应用于以往主要由石油来源的材料形成的膜等成形体，作为这些材料的代替材料(生物塑料)也受到关注。但是，为了实现与商业水平相应的生产量，需要进一步提高丝心蛋白的生产率。
本发明的目的在于提供在制成模压成形体时的弯曲强度提高、并且生产率提高的改造丝心蛋白。
用于解决课题的方法
本发明人对能够在工业上进行大量生产的方法进行了各种研究，结果发现，通过改造成具有局部疏水性指数大的氨基酸序列的丝心蛋白，生产率提高，并且由该丝心蛋白制作的模压成形体的弯曲强度提高。本发明以该新发现为基础。
即，本发明涉及例如下述各发明。
[1]一种改造丝心蛋白，其为包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，其中，
上述结构域序列具有包含局部疏水性指数大的区域的氨基酸序列，上述氨基酸序列是与天然来源的丝心蛋白相比相当于REP中的一个或两个以上氨基酸残基被置换成疏水性指数大的氨基酸残基、和/或在REP中插入了一个或两个以上疏水性指数大的氨基酸残基的氨基酸序列。
[式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
[2]如[1]所述的改造丝心蛋白，其中，上述局部疏水性指数大的区域由连续的2～4个氨基酸残基构成。
[3]如[1]或[2]所述的改造丝心蛋白，其中，上述疏水性指数大的氨基酸残基选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)。
[4]一种改造丝心蛋白，其为包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，
将从上述结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至上述结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的全部REP中连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中含有的氨基酸残基的总数设为x、将从上述结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至上述结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的氨基酸残基的总数设为y时，x/y为6.2％以上。
[式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
[5]如[1]～[4]中任一项所述的改造丝心蛋白，其具有与天然来源的丝心蛋白相比除了相当于REP中的一个或两个以上氨基酸残基被置换成疏水性指数大的氨基酸残基、和/或在REP中插入了一个或两个以上疏水性指数大的氨基酸残基以外，还相当于进一步置换、缺失、插入和/或添加了一个或两个以上氨基酸残基的氨基酸序列。
[6]如[5]所述的改造丝心蛋白，其中，上述天然来源的丝心蛋白为昆虫或蜘蛛类来源的丝心蛋白。
[7]如[5]所述的改造丝心蛋白，其中，上述天然来源的丝心蛋白为蜘蛛类的大壶状腺丝蛋白质(MaSp)或小壶状腺丝蛋白质(MiSp)。
[8]一种改造丝心蛋白，其包含序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列、或者与序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的改造丝心蛋白，其中，进一步在N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。
[10]如[9]所述的改造丝心蛋白，其中，上述标签序列包含序列号6所表示的氨基酸序列。
[11]一种改造丝心蛋白，其包含序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列、或者与序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。
[12]一种核酸，其编码[1]～[11]中任一项所述的改造丝心蛋白。
[13]一种核酸，其在严格条件下与[12]所述的核酸的互补链杂交，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白。
[式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
[14]一种核酸，其与[13]所述的核酸具有90％以上的序列一致性，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白。
[式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
[15]一种表达载体，其具有[12]～[14]中任一项所述的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列。
[16]如[15]所述的表达载体，其为质粒载体或病毒载体。
[17]一种宿主，其是利用[15]或[16]所述的表达载体进行了转化而得到的。
[18]如[17]所述的宿主，其为原核生物。
[19]如[18]所述的宿主，其中，上述原核生物为属于选自由埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属组成的组中的属的微生物。
[20]如[17]所述的宿主，其为真核生物。
[21]如[20]所述的宿主，其中，上述真核生物为酵母、丝状真菌或昆虫细胞。
[22]如[21]所述的宿主，其中，上述酵母为属于选自由酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、丝孢酵母属、许旺酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属和汉逊酵母属组成的组中的属的酵母。
[23]如[22]所述的宿主，其中，属于上述酵母属的酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，属于上述裂殖酵母属的酵母为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，属于上述克鲁维酵母属的酵母为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，属于上述丝孢酵母属的酵母为丛生丝孢酵母(Trichosporonpullulans)，属于上述许旺酵母属的酵母为河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)，属于上述毕赤酵母属的酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，属于上述假丝酵母属的酵母为白假丝酵母(Candida albicans)，属于上述耶氏酵母属的酵母为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，属于上述汉逊酵母属的酵母为多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。
[24]如[21]所述的宿主，其中，上述丝状真菌为属于选自由曲霉属、青霉属和毛霉属组成的组中的属的丝状真菌。
[25]如[24]所述的宿主，其中，属于上述曲霉属的丝状真菌为米曲霉，属于上述青霉属的丝状真菌为产黄青霉，属于上述毛霉属的丝状真菌为易脆毛霉。
[26]如[21]所述的宿主，其中，上述昆虫细胞为鱗翅类的昆虫细胞。
[27]如[26]所述的宿主，其中，上述昆虫细胞为草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)来源的昆虫细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)来源的昆虫细胞。
[28]一种产品，其包含[1]～[11]中任一项所述的改造丝心蛋白，并选自由纤维、丝、长丝、膜、发泡体、球体、纳米纤丝、水凝胶、树脂及其等效物组成的组。
发明效果
根据本发明，能够提供制成模压成形体时的弯曲强度提高、并且生产率提高的改造丝心蛋白。
附图说明
图1是示出改造丝心蛋白的结构域序列的示意图。
图2是示出天然来源的丝心蛋白的x/y(％)的值的分布的图。
图3是示出模压成形体的制造中使用的加压成形机的一个实施方式的示意性截面图。
图4是示意性地示出模压成形体的制造方法的一个实施方式的工序图。
具体实施方式
以下，对本具体实施方式详细进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
[改造丝心蛋白]
本发明的改造丝心蛋白为包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质。改造丝心蛋白可以在结构域序列的N末端侧和C末端侧中的任意一个末端侧或两个末端侧进一步附加有氨基酸序列(N末端序列和C末端序列)。N末端序列和C末端序列典型地为不具有丝心蛋白所特有的重复氨基酸基序的区域，由约100个残基的氨基酸构成，但不限于此。
本说明书中，“改造丝心蛋白”是指其结构域序列与天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列不同的丝心蛋白。另外，本说明书中所说的“天然来源的丝心蛋白”也是包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质。
“改造丝心蛋白”只要具有本发明中特别指定的氨基酸序列即可，可以为依据天然来源的丝心蛋白对其氨基酸序列进行改造而得到的丝心蛋白(例如，通过对克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列进行改造来改造氨基酸序列而得到的丝心蛋白)，另外也可以为不依赖于天然来源的丝心蛋白而人为地设计和合成的丝心蛋白(例如，通过化学合成出编码所设计的氨基酸序列的核酸而具有所期望的氨基酸序列的丝心蛋白)。
本说明书中，“结构域序列”为生成丝心蛋白特有的结晶区(典型地，相当于氨基酸序列的(A)n基序)和非晶区(典型地，相当于氨基酸序列的REP)的氨基酸序列，是指式1：[(A)n基序-REP]m所表示的氨基酸序列。在此，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。
关于(A)n基序，只要(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上即可，优选为86％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步更优选为100％(是指仅由丙氨酸残基构成的情况)。在结构域序列中两个以上存在的(A)n基序中优选至少7个仅由丙氨酸残基构成。仅由丙氨酸残基构成是指(A)n基序具有(A)n(A表示丙氨酸残基，n表示4～20的整数、优选表示4～16的整数)所表示的氨基酸序列。REP的氨基酸序列中，优选包含选自GGX和GPGXX(其中，X表示甘氨酸残基以外的氨基酸残基)中的至少一个基序。通过使REP包含这些基序，能够提高丝心蛋白的伸度。
一个实施方式的改造丝心蛋白中，其结构域序列可以具有包含局部疏水性指数大的区域的氨基酸序列，该氨基酸序列是与天然来源的丝心蛋白相比相当于REP中的一个或两个以上氨基酸残基被置换成疏水性指数大的氨基酸残基、和/或在REP中插入了一个或两个以上疏水性指数大的氨基酸残基的氨基酸序列。
本实施方式的改造丝心蛋白中，优选局部疏水性指数大的区域由连续的2～4个氨基酸残基构成。由此，可更显著地发挥由本发明产生的效果。
本实施方式的改造丝心蛋白中，更优选上述的疏水性指数大的氨基酸残基为选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)中的氨基酸残基。由此，能够更稳定地发挥下述的由本发明产生的效果：能够提高在重组蛋白生产系统中的生产率，并且在由该丝心蛋白制作的模压成形体中能够显著提高弯曲强度。
本实施方式的改造丝心蛋白中，除了具有与天然来源的丝心蛋白相比相当于REP中的一个或两个以上氨基酸残基被置换成疏水性指数大的氨基酸残基、和/或在REP中插入了一个或两个以上疏水性指数大的氨基酸残基的改造以外，还可以进一步具有与天然来源的丝心蛋白相比相当于置换、缺失、插入和/或添加了一个或两个以上氨基酸残基的氨基酸序列的改造。
本实施方式的改造丝心蛋白例如可以通过由克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列将REP中的一个或两个以上亲水性氨基酸残基(例如，疏水性指数为负的氨基酸残基)置换成疏水性氨基酸残基(例如，疏水性指数为正的氨基酸残基)、和/或在REP中插入一个或两个以上疏水性氨基酸残基而得到。另外，例如也可以通过设计出相当于由天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列将REP中的一个或两个以上亲水性氨基酸残基置换成疏水性氨基酸残基、和/或在REP中插入一个或两个以上疏水性氨基酸残基的氨基酸序列，并化学合成出编码所设计的氨基酸序列的核酸而得到。在任意一种情况下，都可以在相当于由天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列将REP中的一个或两个以上亲水性氨基酸残基置换成疏水性氨基酸残基、和/或在REP中插入一个或两个以上疏水性氨基酸残基的改造的基础上，进一步进行相当于置换、缺失、插入和/或添加一个或两个以上氨基酸残基的氨基酸序列的改造。氨基酸残基的置换、缺失、插入和/或添加可以利用定点诱变法等本领域技术人员公知的方法进行。具体而言，可以依据Nucleic Acid Res.10,6487(1982)、Methods in Enzymology,100,448(1983)等文献中记载的方法进行。
天然来源的丝心蛋白为包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质，具体而言，可以列举例如昆虫或蜘蛛类产生的丝心蛋白。
作为昆虫产生的丝心蛋白，可以列举例如家蚕(Bombyx mori)、野桑蚕(Bombyxmandarina)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Anteraea pernyi)、枫蚕(Eriogynapyretorum)、蓖麻蚕(Pilosamia Cynthia ricini)、樗蚕(Samia cynthia)、双黑目天蚕蛾(Caligura japonica)、印度柞蚕(Antheraea mylitta)、琥珀蚕(Antheraea assama)等蚕产生的蚕丝蛋白、雀蜂(Vespa simillima xanthoptera)的幼虫吐出的蜂丝蛋白。
作为昆虫产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如蚕·丝心蛋白L链(GenBank登记号M76430(碱基序列)、AAA27840.1(氨基酸序列))。
作为蜘蛛类产生的丝心蛋白，可以列举例如鬼蛛、十字园蛛、肥胖园蛛、五纹园蛛和Araneus nojimai(マメオニグモ)等属于园蛛属(Araneus属)的蜘蛛、青新园蛛、嗜水新园蛛、灌木新园蛛和类青新园蛛等属于新园蛛属(Neoscona属)的蜘蛛、棕类岬蛛等属于类岬蛛属(Pronus属)的蜘蛛、蟾蜍曲腹蛛和对称曲腹蛛等属于曲腹蛛属(Cyrtarachne属)的蜘蛛、库氏棘腹蛛和乳突棘腹蛛等属于棘腹蛛属(Gasteracantha属)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛和六刺瘤腹蛛等属于瘤腹蛛属(Ordgarius属)的蜘蛛、悦目金蛛、小悦目金蛛和横纹金蛛等属于金蛛属(Argiope属)的蜘蛛、双峰尾园蛛等属于尾园蛛属(Arachnura属)的蜘蛛、褐吊叶蛛等属于吊叶蛛属(Acusilas属)的蜘蛛、摩鹿加云斑蛛、方格云斑蛛和全色云斑蛛等属于云斑蛛属(Cytophora属)的蜘蛛、丑锥头蛛等属于锥头蛛属(Poltys属)的蜘蛛、八疣尘蛛、四突尘蛛、圆腹尘蛛和黑尾尘蛛等属于尘蛛属(Cyclosa属)的蜘蛛和日本壮头蛛等属于壮头蛛属(Chorizopes属)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白、以及前齿肖峭、锥腹肖峭、直伸肖峭和鳞纹肖峭等属于肖峭属(Tetragnatha属)的蜘蛛、纵条银鳞蛛、肩斑银鳞蛛和小肩斑银鳞蛛等属于银鳞蛛属(Leucauge属)的蜘蛛、棒络新妇和斑络新妇等属于络新妇属(Nephila属)的蜘蛛、美丽麦蛛等属于麦蛛属(Menosira属)的蜘蛛、柔弱粗螯蛛等属于锯螯蛛属(Dyschiriognatha属)的蜘蛛、黑寡妇蜘蛛、红背蜘蛛、几何寇蛛和间斑寇蛛等属于寇蛛属(Latrodectus属)的蜘蛛、以及属于Euprosthenops属的蜘蛛等属于肖蛸科(Tetragnathidae科)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白。作为蛛丝蛋白，可以列举例如MaSp(MaSp1和MaSp2)、ADF(ADF3和ADF4)等拖丝蛋白、MiSp(MiSp1和MiSp2)等。
作为蜘蛛类产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如丝心蛋白-3(fibroin-3，adf-3)[十字园蛛(Araneus diadematus)来源](GenBank登记号AAC47010(氨基酸序列)、U47855(碱基序列))、丝心蛋白-4(adf-4)[十字园蛛来源](GenBank登记号AAC47011(氨基酸序列)、U47856(碱基序列))、蜘蛛拖丝蛋白1(dragline silk proteinspidroin 1)[棒络新妇蛛(Nephila clavipes)来源](GenBank登记号AAC04504(氨基酸序列)、U37520(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1(major angu11ate spidroin 1)[黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)来源](GenBank登记号ABR68856(氨基酸序列)、EF595246(碱基序列))、蜘蛛拖丝蛋白2(dragline silk protein spidroin 2)[棒络新妇(Nephilaclavata)来源](GenBank登记号AAL32472(氨基酸序列)、AF441245(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1(major anpullate spidroin 1)[Euprosthenops australis来源](GenBank登记号CAJ00428(氨基酸序列)、AJ973155(碱基序列))和大壶状腺蛛丝蛋白2(majorampullate spidroin 2)[Euprosthenops australis](GenBank登记号CAM32249.1(氨基酸序列)、AM490169(碱基序列))、小壶状腺丝蛋白1(minor ampullate silk protein 1)[棒络新妇蛛](GenBank登记号AAC14589.1(氨基酸序列))、小壶状腺丝蛋白2(minorampullate silk protein 2)[棒络新妇蛛](GenBank登记号AAC14591.1(氨基酸序列))、小壶状腺蛛丝样蛋白(minor ampullate spidroin-like protein)[近络新妇属蛛Nephilengys cruentata](GenBank登记号ABR37278.1(氨基酸序列)等。
作为天然来源的丝心蛋白的更具体的示例，可以进一步列举在NCBI GenBank中登记了序列信息的丝心蛋白。例如，可以通过在NCBI GenBank中登记的序列信息中从包含INV作为分类码(DIVISION)的序列中提取出在定义(DEFINITION)中记载了蛛丝蛋白(spidroin)、壶状腺(ampullate)、丝心蛋白(fibroin)、“丝(silk)和多肽(polypeptide)”或“丝(silk)和蛋白(protein)”作为关键词的序列、从CDS提取出记载了指定产物(product)的字符串的序列、从来源(SOURCE)提取出在组织类型(TISSUE TYPE)中记载了指定字符串的序列来确认。
另一实施方式的改造丝心蛋白包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列，并具有下述氨基酸序列：将从上述结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至上述结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的全部REP中连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中含有的氨基酸残基的总数设为x、将从上述结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至上述结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的氨基酸残基的总数设为y时，x/y为6.2％以上。
关于氨基酸残基的疏水性指数，使用公知的指数(Hydropathy index:Kyte J,&Doolittle R(1982)“A simple method for displaying the hydropathic character ofa protein”,J.Mol.Biol.,157,pp.105-132)。具体而言，各氨基酸的疏水性指数(hydropathy index、以下也记为“HI”)如下述表1所示。
[表1]
氨基酸 HI 氨基酸 HI
异亮氨酸(Ile) 4.5 色氨酸(Trp) -0.9
缬氨酸(Val) 4.2 酪氨酸(Tyr) -1.3
亮氨酸(Leu) 3.8 脯氨酸(Pro) -1.6
苯丙氨酸(Phe) 2.8 组氨酸(His) -3.2
半胱氨酸(Cys) 2.5 天冬酰胺(Asn) -3.5
蛋氨酸(Met) 1.9 天冬氨酸(Asp) -3.5
丙氨酸(Ala) 1.8 谷氨酰胺(Gln) -3.5
甘氨酸(Gly) -0.4 谷氨酸(Glu) -3.5
苏氨酸(Thr) -0.7 赖氨酸(Lys) -3.9
丝氨酸(Ser) -0.8 精氨酸(Arg) -4.5
进一步详细地说明x/y的计算方法。计算中，使用从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列(以下作为“序列A”)。首先，算出序列A中含有的全部REP中连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值。疏水性指数的平均值用连续的4个氨基酸残基中含有的各氨基酸残基的HI的总和除以4(氨基酸残基数)而求出。对全部的连续的4个氨基酸残基求出疏水性指数的平均值(各氨基酸残基被用于1～4次平均值的计算)。接着，指定出连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域。即使在某一氨基酸残基对应于两个以上“疏水性指数的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”的情况下，在区域中也作为1个氨基酸残基而含有。并且，该区域中含有的氨基酸残基的总数为x。另外，序列A中含有的氨基酸残基的总数为y。
例如，在提取到20处“疏水性指数的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”的情况下(无重复)，在连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中含有20处连续的4个氨基酸残基(无重复)，x为20×4＝80。另外，例如，在2处“疏水性指数的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”仅有1个氨基酸残基重复存在的情况下，在连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中含有7个氨基酸残基(x＝2×4-1＝7。“-1”为重复部分的扣除)。例如在图1所示的结构域序列的情况下，“疏水性指数的平均值为2.6以上的连续的4个氨基酸残基”不重复地存在7处，因此x为7×4＝28。另外，例如在图1所示的结构域序列的情况下，y为4+50+4+40+4+10+4+20+4+30＝170(不包括存在于C末端侧的最后的(A)n基序)。接着，用x除以y，由此能够算出x/y(％)。图1的情况下，28/170＝16.47％。
在此，对天然来源的丝心蛋白中的x/y进行说明。首先，如上所述，利用例示出在NCBI GenBank中登记了氨基酸序列信息的丝心蛋白的方法进行确认，结果提取出663种丝心蛋白(其中，蜘蛛类来源的丝心蛋白为415种)。对于所提取的全部丝心蛋白中包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的天然来源的丝心蛋白，利用上述计算方法算出x/y。将其结果示于图2。图2的横轴表示x/y(％)，纵轴表示频率。由图2表明，天然来源的丝心蛋白中的x/y均小于6.2％(最高为6.12％)。
本实施方式的改造丝心蛋白中，x/y优选为6.2％以上，更优选为7％以上，进一步优选为10％以上，进一步更优选为20％以上，进一步更优选为30％以上。x/y的上限没有特别限制，例如可以为45％以下。
本实施方式的改造丝心蛋白例如可以通过如下方法得到：对于克隆出的天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列，将REP中的一个或两个以上亲水性氨基酸残基(例如，疏水性指数为负的氨基酸残基)置换成疏水性氨基酸残基(例如，疏水性指数为正的氨基酸残基)、和/或在REP中插入一个或两个以上疏水性氨基酸残基，以使其满足上述x/y的条件，由此改造成包含局部疏水性指数大的区域的氨基酸序列。另外，例如也可以通过由天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列设计出满足上述x/y的条件的氨基酸序列，并化学合成出编码所设计的氨基酸序列的核酸而得到。在任意一种情况下，都可以在与天然来源的丝心蛋白相比相当于REP中的一个或两个以上氨基酸残基被置换成疏水性指数大的氨基酸残基、和/或在REP中插入了一个或两个以上疏水性指数大的氨基酸残基的改造的基础上，进一步进行相当于置换、缺失、插入和/或添加一个或两个以上氨基酸残基的改造。
作为疏水性指数大的氨基酸残基，没有特别限制，优选异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)，更优选缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)。
作为本发明的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举(i)包含序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白、或者(ii)包含与序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
对(i)的改造丝心蛋白进行说明。序列号1所表示的氨基酸序列是使天然来源的丝心蛋白的(A)n基序中的丙氨酸残基连续而成的氨基酸序列发生缺失以使丙氨酸残基的连续数变为5个而得到的氨基酸序列。序列号2所表示的氨基酸序列是对序列号1所表示的氨基酸序列每隔一个REP分别在2处插入由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI)、并且使N末端侧的一部分氨基酸缺失以使其与序列号1所表示的氨基酸序列的分子量大致相同而得到的氨基酸序列。序列号3所表示的氨基酸序列是对序列号1所表示的氨基酸序列在各(A)n基序的C末端侧插入2个丙氨酸残基、进一步将一部分谷氨酰胺(Q)残基置换成丝氨酸(S)残基、并且使N末端侧的一部分氨基酸发生缺失以使其与序列号1所表示的氨基酸序列的分子量大致相同而得到的氨基酸序列。序列号4所表示的氨基酸序列是对序列号3所表示的氨基酸序列每隔一个REP分别在1处插入由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI)而得到的氨基酸序列。序列号5所表示的氨基酸序列是对序列号3所表示的氨基酸序列每隔一个REP分别在2处插入由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI)而得到的氨基酸序列。
(i)的改造丝心蛋白可以由序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列构成。
(ii)的改造丝心蛋白包含与序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。另外，(ii)的改造丝心蛋白也是包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
(ii)的改造丝心蛋白优选：与序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性，并且将从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的全部REP中连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中含有的氨基酸残基的总数设为x、从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的氨基酸残基的总数设为y时，x/y为6.2％以上。
上述改造丝心蛋白可以在N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。由此，能够进行改造丝心蛋白的分离、固定化、检测和可见化等。
作为标签序列，可以列举例如利用与其他分子的特异性亲和性(结合性、affinity)的亲和性标签。作为亲和性标签的具体例，可以列举组氨酸标签(His标签)。His标签是由约4至10个组氨酸残基排列而成的短肽，具有与镍等的金属离子特异性地结合的性质，因此能够用于通过金属螯合层析(chelating metal chromatography)进行的改造丝心蛋白的分离。作为标签序列的具体例，可以列举例如序列号5所表示的氨基酸序列(包含His标签的氨基酸序列)。
另外，也可以利用与谷胱甘肽特异性地结合的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、与麦芽糖特异性地结合的麦芽糖结合蛋白(MBP)等标签序列。
此外，也可以使用利用抗原抗体反应的“表位标签”。通过附加显示出抗原性的肽(表位)作为标签序列，能够结合针对该表位的抗体。作为表位标签，可以列举HA(流感病毒的血凝素的肽序列)标签、myc标签、FLAG标签等。通过利用表位标签，能够以高特异性容易地对改造丝心蛋白进行纯化。
可以使用进一步利用特定的蛋白酶将标签序列切除而得到的改造丝心蛋白。也可以通过对借助该标签序列吸附的蛋白进行蛋白酶处理而回收切除了标签序列后的改造丝心蛋白。
作为包含标签序列的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举(iii)包含序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白、或者(iv)包含与序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
序列号8、10和11所表示的氨基酸序列是分别在序列号2、4和5所表示的氨基酸序列的N末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(包含His标签)而得到的氨基酸序列。
(iii)的改造丝心蛋白可以由序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列构成。
(iv)的改造丝心蛋白包含与序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。另外，(iv)的改造丝心蛋白也是包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
(iv)的改造丝心蛋白优选：与序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性，并且将从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的全部REP中连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中含有的氨基酸残基的总数设为x、将从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的氨基酸残基的总数设为y时，x/y为6.2％以上。
上述改造丝心蛋白可以包含用于将在重组蛋白生产系统中生产的蛋白质释放到宿主的外部的分泌信号。分泌信号的序列可以根据宿主的种类适当设定。
[核酸]
本发明的核酸编码本发明的改造丝心蛋白。作为核酸的具体例，可以列举编码包含序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白、或者在这些氨基酸序列的N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端结合有序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列)的蛋白等的核酸等。
一个实施方式的核酸为下述核酸：在严格条件下与编码本发明的改造丝心蛋白的核酸的互补链杂交，并且编码下述改造丝心蛋白，该改造丝心蛋白包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列，将从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的全部REP中连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中含有的氨基酸残基的总数设为x、将从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的氨基酸残基的总数设为y时，x/y为6.2％以上。
“严格条件”是指所有的形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。“严格条件”可以为低严格条件、中严格条件和高严格条件中的任意一种。低严格条件是指仅在序列间存在至少85％以上的一致性时发生杂交，可以列举例如使用含有0.5％SDS的5×SSC在42℃下进行杂交的条件。中严格条件是指仅在序列间存在至少90％以上的一致性时发生杂交，可以列举例如使用含有0.5％SDS的5×SSC在50℃下进行杂交的条件。高严格条件是指仅在序列间存在至少95％以上的一致性时发生杂交，可以列举例如使用含有0.5％SDS的5×SSC在60℃下进行杂交的条件。
[宿主和表达载体]
本发明的表达载体具有本发明的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列。调节序列是对宿主中的重组蛋白的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、粘粒载体、福斯粘粒(fosmid)载体、人工染色体载体等。
本发明的宿主是利用本发明的表达载体进行转化而得到的。作为宿主，原核生物、以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物均可以适当使用。
作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够整合到宿主的染色体中、且在能够对本发明的核酸进行转录的位置含有启动子的表达载体。
在使用细菌等原核生物作为宿主的情况下，本发明的表达载体优选为在原核生物中能够自主复制的同时包含启动子、核糖体结合序列、本发明的核酸和转录终止序列的载体。也可以包含对启动子进行调控的基因。
作为原核生物，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属等的微生物。
作为属于埃希氏菌属的微生物，可以列举例如大肠杆菌BL21(Novagen公司)、大肠杆菌BL21(DE3)(Life Technologies公司)、大肠杆菌BLR(DE3)(默克密理博公司)、大肠杆菌DH1、大肠杆菌GI698、大肠杆菌HB101、大肠杆菌JM109、大肠杆菌K5(ATCC 23506)、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌MG1655(ATCC47076)、大肠杆菌No.49、大肠杆菌Rosetta(DE3)(Novagen公司)、大肠杆菌TB1、大肠杆菌Tuner(Novagen公司)、大肠杆菌Tuner(DE3)(Novagen公司)、大肠杆菌W1485、大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue等。
作为属于短芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如土壤短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、居湖短芽孢杆菌、副短短芽孢杆菌、茹氏短芽孢杆、热红短芽孢杆菌、短短芽孢杆菌47(FERM BP-1223)、短短芽孢杆菌47K(FERM BP-2308)、短短芽孢杆菌47-5(FERM BP-1664)、短短芽孢杆菌47-5Q(JCM8975)、桥石短芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)、桥石短芽孢杆菌HPD31-S(FERM BP-6623)、桥石短芽孢杆菌HPD31-OK(FERM BP-4573)、桥石短芽孢杆菌SP3株(Takara公司制)等。
作为属于沙雷氏菌属的微生物，可以列举例如液化沙雷氏菌(Serratialiquefacience)ATCC14460、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、格氏沙雷氏菌(Serratiagrimesii)、变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)、气味沙雷氏菌(Serratiaodorifera)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)等。
作为属于芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。
作为属于微杆菌属的微生物，可以列举例如嗜氨微杆菌ATCC15354等。
作为属于短杆菌属的微生物，可以列举例如叉开短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020、黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌ATCC14067)ATCC13826、ATCC14067、Brevibacteriumimmariophilum ATCC14068、乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)ATCC13665、ATCC13869、玫瑰色短杆菌ATCC13825、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC14066、生硫短杆菌ATCC19240、白色短杆菌ATCC15111、蜡状短杆菌ATCC15112等。
作为属于棒杆菌属的微生物，可以列举例如产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC6871、ATCC6872、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、醋谷棒杆菌ATCC15806、解烷棒杆菌ATCC21511、帚石南棒杆菌ATCC15991、谷氨酸棒杆菌ATCC13020，ATCC13032，ATCC13060、百合棒杆菌ATCC15990、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、嗜热产氨棒杆菌AJ12340(FERMBP-1539)、力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)ATCC13868等。
作为属于假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物，可以列举例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)和假单胞菌属菌(Pseudomonas sp.)D-0110等。
作为表达载体向上述宿主细胞中的导入方法，只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法则均可以使用。可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394)、或Gene,17,107(1982)、Molecular&General Genetics,168,111(1979)中记载的方法等。
属于短芽孢杆菌属的微生物的转化可以利用例如Takahashi等的方法(J.Bacteriol.,1983,156:1130-1134)、Takagi等的方法(Agric.Biol.Chem.,1989,53:3099-3100)、或Okamoto等的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1997,61:202-203)来实施。
作为导入本发明的核酸的载体(以下简称为“载体”)，可以列举例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由Boehringer Mannheim公司销售)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM B-400)制备、日本特开昭60-221091]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备、日本特开昭60-221091]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制)、pET系统(Novagen公司制)等。
在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可以列举pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold等作为优选的载体。
作为属于短芽孢杆菌属的微生物的优选载体的具体例，可以列举作为枯草杆菌载体公知的pUB110、或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pHY4831(J.Bacteriol.,1987,1239-1245)、pNU200(鹈高重三、日本农艺化学会志1987,61:669-676)、pNU100(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,30:75-80)、pNU211(J.Biochem.,1992,112:488-491)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pNH301(Appl.Environ.Microbiol.,1992,58:525-531)、pNH326、pNH400(J.Bacteriol.,1995,177:745-749)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)、pHT110R2L5(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1994,42:358-363)、或大肠杆菌与属于短芽孢杆菌属的微生物的穿梭载体pNCO2(日本特开2002-238569号公报)等。
作为启动子，只要在宿主细胞中发挥功能则没有限制。可以列举例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将两个Ptrp串联而成的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子这样人为地进行了设计改造的启动子等。
优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。在本发明的表达载体中，本发明的核酸的表达不一定需要转录终止序列，但优选紧挨在结构基因的下游配置转录终止序列。
作为真核生物的宿主，可以列举例如酵母、丝状真菌(霉菌等)和昆虫细胞。
作为酵母，可以列举例如属于酵母(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、许旺酵母(Schwanniomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、耶氏酵母属和汉逊酵母属等的酵母。更具体而言，可以列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、多形毕赤酵母(Pichia polymorpha)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等。
使用酵母作为宿主细胞的情况下的表达载体通常优选包含复制起点(需要在宿主中扩增的情况下)和用于在大肠杆菌中的载体的增殖的筛选标志物、用于在酵母中的重组蛋白表达的启动子和终止子、以及用于酵母的筛选标志物。
在表达载体为非整合载体的情况下，优选进一步包含自主复制序列(ARS)。由此，能够提高表达载体在细胞内的稳定性(Myers、A.M.、et al.(1986)Gene 45:299-310)。
作为使用酵母作为宿主的情况下的载体，可以列举例如YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、YIp、pHS19、pHS15、pA0804、pHIL3Ol、pHIL-S1、pPIC9K、pPICZα、pGAPZα、pPICZ B等。
作为启动子，只要能够在酵母中表达则没有限制。可以列举例如己糖激酶等糖酵解系统的基因的启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP 1启动子、pGAP启动子、pGCW14启动子、AOX1启动子、MOX启动子等。
作为表达载体向酵母中的导入方法，只要是将DNA导入酵母中的方法则均可以使用，可以列举例如电穿孔法(Methods Enzymol.,194,182(1990))、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984))、乙酸锂法(J.Bacteriol.,153,163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)记载的方法等。
作为丝状真菌，可以列举例如属于顶孢霉(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、黑粉菌(Ustilago)属、木霉(Trichoderma)属、链孢霉(Neurospora)属、镰孢霉(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、青霉(Penicillium)属、毁丝霉(Myceliophtora)属、灰霉(Botryts)属、稻瘟菌(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、绿僵菌(Metarhizium)属、红曲霉(Monascus)属、根霉(Rhizopus)属和根毛霉属的菌等。
作为丝状真菌的具体例，可以列举亚拉巴马枝顶孢霉(Acremonium alabamense)、解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、清酒曲霉(Aspergillussake)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)、无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、海枣曲霉(Aspergillus phoeicus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉(Trichoderma reseei)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热子囊菌(Thermoascus)、孢子丝菌(Sporotrichum)、嗜纤维素侧孢霉(Sporotrichum cellulophilum)、篮状菌(Talaromyces)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、梭孢壳霉(Thielavia)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、尖孢镰孢霉(Fusarium oxysporus)、禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)、镶片镰孢霉(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、卡门培尔青霉(Penicillium camemberti)、灰白青霉(Penicilliumcanescens)、埃默森青霉(Penicillium emersonii)、绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)、灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、娄地青霉(Penicillium roqueforti)、嗜热毁丝霉(Myceliophtaorathermophilum)、不明毛霉(Mucor ambiguus)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、易脆毛霉(Mucor fragilis)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)、不等孢毛霉(Mucor inaequisporus)、椭圆毛霉(Mucor oblongiellipticus)、总状毛霉(Mucor racemosus)、反屈毛霉(Mucorrecurvus)、土星状毛霉(Mocor saturninus)、Mocor subtilissmus、Ogataea polymorpha、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)等。
作为宿主为丝状真菌的情况下的启动子，可以为参与糖酵解系统的基因、参与构成性表达的基因、参与水解的酶基因等的任意一种，具体而言，可以列举amyB、glaA、agdA、glaB、TEF1、xynF1tannasegene、No.8AN、gpdA、pgkA、enoA、melO、sodM、catA、catB等。
表达载体向丝状真菌中的导入可以使用现有公知的方法进行。可以列举例如Cohen等的方法(氯化钙法)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972)]、原生质体法[Mol.Gen.Genet.,168:111(1979)]、感受态细胞法[J.Mol.Biol.,56:209(1971)]、电穿孔法等。
作为昆虫细胞，可以列举例如鳞翅类的昆虫细胞，更具体而言，可以列举Sf9和Sf21等草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)来源的昆虫细胞、以及High 5等粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)来源的昆虫细胞等。
作为使用昆虫细胞作为宿主的情况下的载体，可以列举例如作为感染夜蛾科昆虫的病毒的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus)等杆状病毒(Baculovirus Expression Vectors,A LaboratoryManual(杆状病毒表达载体实验室手册),W.H.Freeman and Company,纽约(1992))。
在使用昆虫细胞作为宿主的情况下，可以利用例如Current protocols inmolecular biology(分子生物学现行规范)；Baculovirus Expression Vectors,ALaboratory Manual(杆状病毒表达载体实验室手册),W.H.Freeman and Company,纽约(1992)；Bio/Technology,6,47(1988)等中记载的方法对多肽进行表达。即，可以将重组基因导入载体和杆状病毒共导入昆虫细胞中，在昆虫细胞培养上清中得到重组病毒(表达载体)后，进一步使重组病毒感染昆虫细胞，使多肽进行表达。作为该方法中使用的基因导入载体，可以列举例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均为Invitorogen公司制)等。
作为用于制备重组病毒的、重组基因导入载体和杆状病毒向昆虫细胞中的共导入方法，可以列举例如磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)、脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987))等。
本发明的重组载体优选进一步含有用于转化体选择的选择标志物基因。例如，在大肠杆菌中，作为选择标志物基因，可以使用针对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等各种药剂的抗性基因。也可以使用能够与营养缺陷型相关的基因变异互补的隐性的选择标志物。在酵母中，作为选择标志物基因，可以使用针对遗传霉素的抗性基因，也可以使用与营养缺陷型相关的基因变异互补的基因、LEU2、URA3、TRP1、HIS3等选择标志物。在丝状真菌中，作为选择标志物基因，可以列举选自由niaD(Biosci.Biotechnol.Biochem.,59,1795-1797(1995))、argB(Enzyme Microbiol Technol,6,386-389,(1984))、sC(Gene,84,329-334,(1989))、ptrA(BiosciBiotechnol Biochem,64,1416-1421,(2000))、pyrG(BiochemBiophys Res Commun,112,284-289,(1983))，amdS(Gene,26,205-221,(1983))、金担子素抗性基因(Mol Gen Genet,261,290-296,(1999))、苯菌灵抗性基因(Proc NatlAcad Sci USA,83,4869-4873,(1986))和潮霉素抗性基因(Gene,57,21-26,(1987))组成的组中的标志物基因、亮氨酸缺陷型互补基因等。另外，在宿主为营养缺陷型变异株的情况下，也可以使用与该营养缺陷型互补的野生型基因作为选择标志物基因。
利用本发明的表达载体进行了转化的宿主的选择可以通过使用选择地与本发明的核酸结合的探针的噬菌斑杂交和菌落杂交等来进行。作为该探针，可以使用将基于本发明的核酸的序列信息利用PCR法扩增的部分DNA片段用放射性同位素或地高辛进行修饰而得到的探针。
[改造丝心蛋白的生产]
通过使本发明的核酸在利用本发明的表达载体进行了转化的宿主中表达，能够生产本发明的改造丝心蛋白。作为表达方法，除了直接表达以外，还可以依据分子克隆第2版中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白表达等。在利用酵母、动物细胞、昆虫细胞进行表达的情况下，可以以附加有糖或糖链的多肽的形式得到改造丝心蛋白。
本发明的改造丝心蛋白例如可以通过将利用本发明的表达载体进行了转化的宿主在培养用培养基中进行培养，使本发明的改造丝心蛋白在培养用培养基中生成蓄积，并从该培养用培养基中收集来进行制造。将本发明的宿主在培养用培养基中进行培养的方法可以按照宿主的培养中通常使用的方法来进行。
在本发明的宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为本发明的宿主的培养用培养基，只要是含有该宿主可同化的碳源、氮源和无机盐类等、能够高效地进行该宿主的培养的培养基，则天然培养基、合成培养基均可以使用。
作为碳源，只要是该宿主可同化的碳源即可，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物等碳水化合物、乙酸和丙酸等有机酸、以及乙醇和丙醇等醇类。
作为氮源，可以使用例如氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。
作为无机盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的pH优选保持于3.0～9.0。培养用培养基的pH的调节可以使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙和氨等进行。
另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。在对利用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等；在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为昆虫细胞的培养用培养基，可以使用通常使用的TNM-FH培养基(Pharmingen公司制)、Sf-900II SFM培养基(Life Technologies公司制)、ExCell400、ExCell405(均为JRH Biosciences公司制)、Grace昆虫培养基(Nature,195,788(1962))等。
昆虫细胞的培养例如可以在培养用培养基的pH为6～7、培养温度为25～30℃等条件下使培养时间为1～5天来进行。另外，培养中可以根据需要在培养用培养基中添加庆大霉素等抗生素。
在宿主为植物细胞的情况下，转化后的植物细胞可以直接进行培养，另外也可以分化为植物的器官而进行培养。作为培养该植物细胞的培养基，可以使用通常使用的Murashige&Skoog(MS)培养基、怀特(White)培养基、或者在这些培养基中添加生长素、细胞分裂素等植物激素而得到的培养基等。
动物细胞的培养例如可以在培养用培养基的pH为5～9、培养温度为20～40℃等条件下使培养时间为3～60天来进行。另外，培养中可以根据需要在培养基中添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。
作为使用利用本发明的表达载体进行了转化的宿主来生产改造丝心蛋白的方法，有下述方法：在宿主细胞内生产该改造丝心蛋白的方法；使该改造丝心蛋白分泌到宿主细胞外的方法；和在宿主细胞外膜上生产该改造丝心蛋白的方法。可以通过改变所使用的宿主细胞和所生产的改造丝心蛋白的结构来选择这些各方法。
例如，在改造丝心蛋白生产于宿主细胞内或宿主细胞外膜上的情况下，可以通过应用鲍尔森等的方法(J.Biol.Chem.，264，17619(1989))、Row等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990))、或日本特开平5-336963号公报、国际公开第94/23021号等中记载的方法来进行变更，以使改造丝心蛋白主动地分泌到宿主细胞外。即，使用基因重组的方法，以在包含改造丝心蛋白的活性部位的多肽上附加有信号肽的形式进行表达，由此能够使改造丝心蛋白主动地分泌到宿主细胞外。
由利用本发明的表达载体进行了转化的宿主生产的改造丝心蛋白可以利用蛋白的分离纯化中通常使用的方法进行分离和纯化。例如，在改造丝心蛋白以溶解状态表达于细胞内的情况下，在培养结束后，通过离心分离回收宿主细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、Manton-Gaulin均质器和戴诺研磨机(DYNO-MILL)等将宿主细胞破碎，得到无细胞提取液。从通过将该无细胞提取液离心分离而得到的上清中，单独或组合使用蛋白的分离纯化中通常使用的方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化成公司制)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-琼脂糖FF(Pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。
作为上述层析法，优选使用采用苯基-TOYOPEARL(东曹)、DEAE-TOYOPEARL(东曹)、Sephadex G-150(Pharmacia Biotech)的柱层析。
另外，在改造丝心蛋白在细胞内形成不溶体而进行表达的情况下，同样在回收宿主细胞后将其破碎并进行离心分离，由此以沉淀级分的形式回收改造丝心蛋白的不溶体。回收的改造丝心蛋白的不溶体可以利用蛋白变性剂进行可溶化。该操作后，利用与上述同样的分离纯化法能够得到改造丝心蛋白的纯化制备品。
在改造丝心蛋白或在改造丝心蛋白上附加有糖链的衍生物被分泌到细胞外的情况下，可以从培养上清中回收改造丝心蛋白或其衍生物。即，利用离心分离等方法对培养物进行处理，由此获得培养上清，通过使用与上述同样的分离纯化法，能够从该培养上清中得到纯化制备品。
[模压成形体的制造方法]
本实施方式的模压成形体可以使用加压成形机由包含本实施方式的改造丝心蛋白的成形用组合物来制造。图3是示出模压成形体的制造中使用的加压成形机的一个实施方式的示意性截面图。图3所示的加压成形机10具备形成有贯通孔且可加温的模具2、以及能够在模具2的贯通孔内上下移动的上侧销4和下侧销6。向在模具2中插入上侧销4或下侧销6而产生的空隙内导入包含改造丝心蛋白的成形用组合物，一边对模具2进行加温，一边利用上侧销4和下侧销6对组合物进行压缩，由此能够得到模压成形体。
图4是示意性地示出模压成形体的制造方法的一个实施方式的工序图。图4(a)是导入组合物之前的加压成形机的示意性截面图，图4(b)是刚导入组合物后的加压成形机的示意性截面图，图4(c)是正在对组合物进行加热和加压的状态、或者加热和加压后的加压成形机的示意性截面图。如图4(a)所示，在模具2的贯通孔中仅插入有下侧销6的状态下向贯通孔内导入组合物，如图4(b)所示，在模具2的贯通孔中插入上侧销4并使其下降，开始模具2的加热，将加热加压前的组合物8a在贯通孔内进行加热加压。使上侧销4下降至达到预先规定的加压力为止，在图4(c)所示的状态下继续加热和加压，直至组合物达到规定的温度为止，得到加热加压后的组合物8b。然后，使用冷却器(例如点式冷却器)使模具2的温度下降，在组合物8b达到规定温度的时刻，从模具2中拔去上侧销4或下侧销6，取出内容物，得到模压成形体。关于加压，可以在固定下侧销6的状态下使上侧销4下降来实施，也可以同时实施上侧销4的下降和下侧销6的上升。
加热优选在80～300℃下进行，更优选在100～180℃下进行，进一步优选在100～130℃下进行。加压优选以5kN以上进行，更优选以10kN以上进行，进一步优选以20kN以上进行。另外，在达到规定的加热加压条件后，继续在该条件下进行处理的时间(保温条件)优选为0～100分钟，更优选为1～50分钟，进一步优选为5～30分钟。
包含改造丝心蛋白的成形用组合物可以仅包含改造丝心蛋白，另外也可以进一步包含任选的添加剂。通过包含添加剂，能够制造具有各种不同物性的成形用组合物。作为添加剂，可以列举例如软化剂、结晶成核剂、发泡剂、耐候剂、耐水解剂、还原剂、着色剂、改性剂、稳定剂、润滑剂、填充剂、阻燃剂、强化剂、脱模剂、抗静电剂、防氧化剂等。
作为软化剂，可以列举例如甘油、聚乙二醇等高分子量醇、淀粉等糖类、水、表面活性剂等。
作为结晶成核剂，可以列举例如高岭土、滑石、蒙脱石、氧化镁、氧化铝、其他种类的聚酰胺等。
作为发泡剂，可以列举例如在碳酸氢钠中添加酸或碱而成的发泡剂、在铝粉末中添加酸而成的发泡剂、在异氰酸酯中添加水而成的发泡剂等。
作为耐候剂，可以列举例如苯并三唑、二苯甲酮、三嗪等。
作为耐水解剂，可以列举例如环氧试剂、碳二亚胺、异氰酸酯、唑啉等。
[产品]
由本发明的改造丝心蛋白形成的丝心蛋白纤维可以以纤维或丝的形式应用于机织物、针织物、编结物、无纺布等。另外，也可以应用于绳、手术用缝合线、电气部件用挠性把手、以及移植用生理活性材料(例如人工韧带和主动脉带)等高强度用途。
另外，本发明的改造丝心蛋白也可以应用于长丝、膜、发泡体、球体、纳米纤丝、水凝胶、树脂及其等效物，这些可以依照日本特开2009-505668号公报、日本特开2009-505668号公报、日本专利第5678283号公报、日本专利第4638735号公报等中记载的方法进行制造。
实施例
以下，基于实施例更具体地对本发明进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。
[(1)编码改造丝心蛋白的核酸的合成和表达载体的构建]
基于作为天然来源的丝心蛋白的棒络新妇蛛(Nephila clavipes)(GenBank登记号：P46804.1、GI：1174415)的碱基序列和氨基酸序列，设计出具有序列号1～5和7～11所表示的氨基酸序列的丝心蛋白和改造丝心蛋白。
序列号1所表示的氨基酸序列是使上述天然来源的丝心蛋白的(A)n基序中的丙氨酸残基连续而成的氨基酸序列发生缺失以使丙氨酸残基的连续数变为5个而得到的氨基酸序列。序列号7所表示的氨基酸序列是在序列号1所表示的氨基酸序列的N末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列(比较例1)。
序列号2所表示的氨基酸序列是对序列号1所表示的氨基酸序列每隔一个REP分别在2处插入由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI)、并且使N末端侧的一部分氨基酸发生缺失以使其与序列号1所表示的氨基酸序列的分子量大致相同而得到的氨基酸序列。序列号8所表示的氨基酸序列是在序列号2所表示的氨基酸序列的N末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列(实施例1)。
序列号3所表示的氨基酸序列是对序列号1所表示的氨基酸序列在各(A)n基序的C末端侧插入两个丙氨酸残基、进一步将一部分谷氨酰胺(Q)残基置换成丝氨酸(S)残基、并且使N末端侧的一部分氨基酸发生缺失以使其与序列号1所表示的氨基酸序列的分子量大致相同而得到的氨基酸序列。序列号9所表示的氨基酸序列是在序列号2所表示的氨基酸序列的N末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列(比较例2)。
序列号4所表示的氨基酸序列是对序列号3所表示的氨基酸序列每隔一个REP分别在1处插入由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI)而得到的氨基酸序列。序列号10所表示的氨基酸序列是在序列号4所表示的氨基酸序列的N末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列(实施例2)。
序列号5所表示的氨基酸序列是对序列号3所表示的氨基酸序列每隔一个REP分别在2处插入由3个氨基酸残基构成的氨基酸序列(VLI)而得到的氨基酸序列。序列号11所表示的氨基酸序列是在序列号5所表示的氨基酸序列的N末端附加序列号6所表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)而得到的氨基酸序列(实施例3)。
分别合成编码具有在所设计的序列号1～5所表示的氨基酸序列各自的N末端附加有His标签序列和铰链序列(序列号6)的序列号7～11所表示的氨基酸序列的蛋白质的核酸。该核酸中在5’末端附加有NdeI位点、在终止密码子下游附加有EcoRI位点。将这5种核酸克隆至克隆载体(pUC118)中。然后，利用NdeI和EcoRI对该核酸进行限制酶处理并将其切出后，重组到蛋白表达载体pET-22b(+)中，得到表达载体。
[(2)蛋白质的表达]
利用包含编码具有序列号7～11所表示的氨基酸序列的蛋白质的核酸的pET22b(+)表达载体对大肠杆菌BLR(DE3)进行转化。将该转化大肠杆菌在含有氨苄青霉素的2mLLB培养基中培养15小时。将该培养液添加到含有氨苄青霉素的100mL种子培养用培养基(表2)中，使OD 600为0.005。将培养液温度保持于30℃，进行烧瓶培养直至OD600为5(约15小时)，得到种子培养液。
[表2]
将该种子培养液添加到添加有500ml生产培养基(表3)的发酵罐中，使OD600为0.05，接种转化大肠杆菌。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％。
[表3]
在生产培养基中的葡萄糖被完全消耗后，立即以1ml/分钟的速度添加补料液(葡萄糖455g/1L、酵母提取物120g/1L)。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持为溶解氧饱和浓度的20％，进行20小时培养。然后，对培养液添加1M的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使终浓度为1mM，诱导表达目的蛋白。在添加IPTG后经过20小时的时刻，离心分离培养液，回收菌体。使用由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液制备的菌体进行SDS-PAGE，根据依赖于IPTG添加的目的蛋白大小的条带的出现，确认到目的蛋白的表达。
[(3)蛋白质的纯化]
将添加IPTG后2小时后回收的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)进行清洗。使清洗后的菌体悬浮在包含约1mM的PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，利用高压均质器(GEA Niro Soavi公司)将细胞破碎。将破碎的细胞离心分离，得到沉淀物。利用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)清洗所得到的沉淀物，直至达到高纯度为止。将清洗后的沉淀物以100mg/mL的浓度悬浮在8M胍缓冲液(8M盐酸胍、10mM磷酸二氢钠、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)中，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)在水中进行透析。通过离心分离回收透析后得到的白色凝集蛋白，利用冷冻干燥机除去水分，回收冷冻干燥粉末。
所得到的冷冻干燥粉末中的目的蛋白的纯化度通过使用Totallab(nonlineardynamics ltd.)对粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果进行图像分析来确认。其结果，任一蛋白质的纯化度均为约85％。将由冷冻干燥粉末的重量计算出的各目的蛋白的生产量以设GEN495(序列号7：比较例1)的值为100时的相对值示于表4和表5。
[(4)模压成形体的制造]
分别称取1.35g上述[(3)蛋白质的纯化]中得到的冷冻干燥粉末(以下称为“样品”)，将该样品导入到图3所示的加压成形机10的模具2(圆柱形的模具，截面具有35mm×15mm的长方形的贯通孔)的贯通孔内。此时，以厚度均等的方式加入样品。导入全部样品后，开始模具2的加热，同时使用带式压机(NPa System株式会社制、NT-100H-V09)将上侧销4和下侧销6插入到贯通孔内，由此进行样品的加压。此时，以样品的加压条件为40kN的方式进行控制。在样品的温度达到200℃的时刻，中止加热，利用点式冷却器(TRUSCO NAKAYAMA株式会社制、TS-25EP-1)进行冷却。在样品的温度达到50℃的时刻取出，进行去毛刺，得到35mm×15mm×2mm的长方体形的模压成形体。
[(5)弯曲强度的测定]
将所得到的模压成形体在恒温恒湿槽(espec公司制、LHL-113)内在20℃、65％的条件下静置1天后，使用Autograph(岛津制作所株式会社制、AG-Xplus)和篮型夹具，进行三点弯曲试验。作为负荷传感器，使用额定容量50kN的负荷传感器。此时，将三点弯曲的支点间距离固定为27mm，使测定速度为1mm/分钟。另外，利用微型游标卡尺测定模压成形体的尺寸。将弯曲强度测定试验的结果以设GEN495(序列号7：比较例1)的值为100时的相对值示于表4。
[表4]
[表5]
具有在REP中包含局部疏水性指数大的区域的氨基酸序列的改造丝心蛋白的生产率显著提高(实施例1～3)，由该改造丝心蛋白制造的模压成形体的弯曲强度显著提高(实施例1)。
标号说明
2…模具、4…上侧销、6…下侧销、8a…加热加压前的组合物、8b…加热加压后的组合物、10…加压成形机。
序列表
<110> 丝芭博株式会社（Spiber Inc.）
小岛冲压工业株式会社（KOJIMA INDUSTRIES CORPORATION）
<120> 改造丝心蛋白（Altered Fibroin）
<130> FP17-0358-00
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Met-GEN495
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly
145 150 155 160
Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro
165 170 175
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180 185 190
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Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser
325 330 335
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Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly
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565 570 575
Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser
580 585 590
<210> 2
<211> 612
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-GEN819
<400> 2
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1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly
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Gln Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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245 250 255
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260 265 270
Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly
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Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly
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Pro Tyr Val Leu Ile Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly
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Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-GEN514
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85 90 95
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Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly
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Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly
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Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser
195 200 205
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370 375 380
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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405 410 415
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro
450 455 460
Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly
465 470 475 480
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565
<210> 4
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-GEN767
<400> 4
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1 5 10 15
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Gly Ser Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly
35 40 45
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50 55 60
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Val Leu Ile
65 70 75 80
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Val Leu Ile Gly Pro
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195 200 205
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Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser
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305 310 315 320
Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln
325 330 335
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355 360 365
Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser
370 375 380
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
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Val Leu Ile Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala
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<211> 619
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-GEN765
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165 170 175
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
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195 200 205
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Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala
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275 280 285
Ser Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
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Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln
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Gln Val Leu Ile Gly Pro Tyr Val Leu Ile Gly Pro Gly Ala Ser Ala
340 345 350
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
355 360 365
Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr
370 375 380
Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly
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Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Tyr Val Leu Ile Gly Pro Gly
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420 425 430
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln
435 440 445
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
450 455 460
Pro Gly Gln Tyr Val Leu Ile Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly
465 470 475 480
Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser
485 490 495
Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Pro Gly
500 505 510
Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
515 520 525
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile
530 535 540
Gly Pro Tyr Val Leu Ile Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln
595 600 605
Val Leu Ile Gly Pro Gly Ala Ser Val Leu Ile
610 615
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His标签（HisTag）
<400> 6
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEN495
<400> 7
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln
20 25 30
Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly Gln Tyr
35 40 45
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
65 70 75 80
Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
85 90 95
Pro Gly Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
100 105 110
Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser
115 120 125
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly
130 135 140
Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro
180 185 190
Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly
195 200 205
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly
210 215 220
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro
225 230 235 240
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
260 265 270
Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln
275 280 285
Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln
290 295 300
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr
305 310 315 320
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly
325 330 335
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala
340 345 350
Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln
355 360 365
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
370 375 380
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr
385 390 395 400
Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly
405 410 415
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln
420 425 430
Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser
435 440 445
Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
450 455 460
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
465 470 475 480
Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly
485 490 495
Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln
500 505 510
Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Ala Ala Ala Ala Ala
515 520 525
Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
530 535 540
Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln
545 550 555 560
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro
565 570 575
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
580 585 590
Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser
595 600
<210> 8
<211> 623
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEN819
<400> 8
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln
20 25 30
Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly Gln Tyr
35 40 45
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala
50 55 60
Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Val Leu Ile Gly Pro Gly Gln
65 70 75 80
Gln Val Leu Ile Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro
85 90 95
Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly
100 105 110
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala
115 120 125
Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Val Leu Ile Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu
130 135 140
Ile Gly Pro Tyr Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Gly Ser Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Gly Gln Tyr Val Leu Ile
195 200 205
Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ser Gly
210 215 220
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln
225 230 235 240
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala
245 250 255
Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Tyr Val Leu Ile Gly Pro
260 265 270
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Tyr Val Leu
325 330 335
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340 345 350
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly
355 360 365
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly
370 375 380
Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Tyr Val Leu Ile
385 390 395 400
Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly
405 410 415
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Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro
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Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Gly Gln
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Ile Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly
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610 615 620
<210> 9
<211> 576
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEN514
<400> 9
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1 5 10 15
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Gly Ser Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly
35 40 45
Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser
50 55 60
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly
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Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr
130 135 140
Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr
145 150 155 160
Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly
165 170 175
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
180 185 190
Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Ala Ser Ala
195 200 205
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln
210 215 220
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly
225 230 235 240
Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro
245 250 255
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala
260 265 270
Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly
275 280 285
Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro
290 295 300
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
305 310 315 320
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala
325 330 335
Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr
340 345 350
Gly Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
355 360 365
Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln
370 375 380
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
385 390 395 400
Gly Ser Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly
405 410 415
Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
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Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly
450 455 460
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Gly Ser Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala
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Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala
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Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser
565 570 575
<210> 10
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEN767
<400> 10
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1 5 10 15
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Ser Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly
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65 70 75 80
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser Ser Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Val Leu Ile Gly Pro
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Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser
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Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala
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Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro
195 200 205
Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
210 215 220
Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln
225 230 235 240
Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly
260 265 270
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305 310 315 320
Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln
325 330 335
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355 360 365
Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser
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Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
385 390 395 400
Val Leu Ile Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala
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420 425 430
Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Gly Pro
485 490 495
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Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala
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565 570 575
Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser
580 585 590
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595 600
<210> 11
<211> 630
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GEN765
<400> 11
Met His His His His His His Ser Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln
1 5 10 15
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Gly Ser Asn Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Ser Gly
35 40 45
Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ser
50 55 60
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Val Leu Ile
65 70 75 80
Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser
100 105 110
Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly
115 120 125
Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Val Leu
130 135 140
Ile Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Tyr Gly Ser Ala Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro
165 170 175
Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln
180 185 190
Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Gln
195 200 205
Gln Val Leu Ile Gly Pro Gly Gln Tyr Val Leu Ile Gly Pro Tyr Ala
210 215 220
Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly
225 230 235 240
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Ser Gly Gln Gln Gly
245 250 255
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
260 265 270
Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Tyr Val Leu Ile Gly Pro
275 280 285
Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly
290 295 300
Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly
305 310 315 320
Pro Gly Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Pro Ser
325 330 335
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly
340 345 350
Pro Tyr Val Leu Ile Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala
355 360 365
Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro
370 375 380
Gly Ser Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Val
405 410 415
Leu Ile Gly Pro Tyr Val Leu Ile Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala
420 425 430
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
435 440 445
Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro
450 455 460
Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Val
465 470 475 480
Leu Ile Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Ser Ala Ser Ala
485 490 495
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Gln Tyr
500 505 510
Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ser Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Gly
515 520 525
Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
530 535 540
Gly Ser Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro Tyr Val Leu
545 550 555 560
Ile Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
565 570 575
Ser Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ser
580 585 590
Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Pro Ser Ala Ala Ala
595 600 605
Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Gln Gln Val Leu Ile Gly Pro
610 615 620
Gly Ala Ser Val Leu Ile
625 630

Claims (28)

1.一种改造丝心蛋白，其为包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，其中，
所述结构域序列具有包含局部疏水性指数大的区域的氨基酸序列，所述氨基酸序列是与天然来源的丝心蛋白相比相当于REP中的一个或两个以上氨基酸残基被置换成疏水性指数大的氨基酸残基、和/或在REP中插入了一个或两个以上疏水性指数大的氨基酸残基的氨基酸序列，
式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上，REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列，m表示10～300的整数，两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列，两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的改造丝心蛋白，其中，所述局部疏水性指数大的区域由连续的2～4个氨基酸残基构成。
3.如权利要求1或2所述的改造丝心蛋白，其中，所述疏水性指数大的氨基酸残基选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)和丙氨酸(A)。
4.一种改造丝心蛋白，其为包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，其中，
将从所述结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至所述结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的全部REP中连续的4个氨基酸残基的疏水性指数的平均值为2.6以上的区域中含有的氨基酸残基的总数设为x、将从所述结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至所述结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的氨基酸残基的总数设为y时，x/y为6.2％以上，
式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上，REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列，m表示10～300的整数，两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列，两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。
5.如权利要求1～4中任一项所述的改造丝心蛋白，其具有与天然来源的丝心蛋白相比除了相当于REP中的一个或两个以上氨基酸残基被置换成疏水性指数大的氨基酸残基、和/或在REP中插入了一个或两个以上疏水性指数大的氨基酸残基以外、还相当于进一步置换、缺失、插入和/或添加了一个或两个以上氨基酸残基的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的改造丝心蛋白，其中，所述天然来源的丝心蛋白为昆虫或蜘蛛类来源的丝心蛋白。
7.如权利要求5所述的改造丝心蛋白，其中，所述天然来源的丝心蛋白为蜘蛛类的大壶状腺丝蛋白(MaSp)或小壶状腺丝蛋白(MiSp)。
8.一种改造丝心蛋白，其包含序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列、或者与序列号2、序列号4或序列号5所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。
9.如权利要求1～8中任一项所述的改造丝心蛋白，其中，进一步在N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。
10.如权利要求9所述的改造丝心蛋白，其中，所述标签序列包含序列号6所表示的氨基酸序列。
11.一种改造丝心蛋白，其包含序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列、或者与序列号8、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。
12.一种核酸，其编码权利要求1～11中任一项所述的改造丝心蛋白。
13.一种核酸，其在严格条件下与权利要求12所述的核酸的互补链杂交，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，
式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上，REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列，m表示10～300的整数，两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列，两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。
14.一种核酸，其与权利要求13所述的核酸具有90％以上的序列一致性，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，
式1中，(A)n基序表示由4～20个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数为83％以上，REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列，m表示10～300的整数，两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列，两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。
15.一种表达载体，其具有权利要求12～14中任一项所述的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列。
16.如权利要求15所述的表达载体，其为质粒载体或病毒载体。
17.一种宿主，其是利用权利要求15或16所述的表达载体进行了转化而得到的。
18.如权利要求17所述的宿主，其为原核生物。
19.如权利要求18所述的宿主，其中，所述原核生物为属于选自由埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属组成的组中的属的微生物。
20.如权利要求17所述的宿主，其为真核生物。
21.如权利要求20所述的宿主，其中，所述真核生物为酵母、丝状真菌或昆虫细胞。
22.如权利要求21所述的宿主，其中，所述酵母为属于选自由酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、丝孢酵母属、许旺酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、耶氏酵母属和汉逊酵母属组成的组中的属的酵母。
23.如权利要求22所述的宿主，其中，属于所述酵母属的酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，属于所述裂殖酵母属的酵母为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，属于所述克鲁维酵母属的酵母为乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，属于所述丝孢酵母属的酵母为丛生丝孢酵母(Trichosporonpullulans)，属于所述许旺酵母属的酵母为河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)，属于所述毕赤酵母属的酵母为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，属于所述假丝酵母属的酵母为白假丝酵母(Candida albicans)，属于所述耶氏酵母属的酵母为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，属于所述汉逊酵母属的酵母为多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)。
24.如权利要求21所述的宿主，其中，所述丝状真菌为属于选自由曲霉属、青霉属和毛霉属组成的组中的属的丝状真菌。
25.如权利要求24所述的宿主，其中，属于所述曲霉属的丝状真菌为米曲霉，属于所述青霉属的丝状真菌为产黄青霉，属于所述毛霉属的丝状真菌为易脆毛霉。
26.如权利要求21所述的宿主，其中，所述昆虫细胞为鳞翅类的昆虫细胞。
27.如权利要求26所述的宿主，其中，所述昆虫细胞为草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)来源的昆虫细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)来源的昆虫细胞。
28.一种产品，其包含权利要求1～11中任一项所述的改造丝心蛋白，并选自由纤维、丝、长丝、膜、发泡体、球体、纳米纤丝、水凝胶、树脂及其等效物组成的组。
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