CN109661240B - 抗体制剂 - Google Patents

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Abstract

公开了能够稳定长期储存的高浓度抗体制剂。

Description

抗体制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年7月5日提交的美国临时专利申请No.62/358,404的权益。本申请还要求2016年8月30日提交的欧洲专利申请No.16306090.8的权益。这些申请各自通过提述以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及在玻璃容器中具有延长的储存稳定性的抗体制剂。
背景技术
CXCR5，也称为伯基特淋巴瘤受体(Burkitt lymphoma receptor,BLR1)，CD185，MDR15和MGC117347，其是作为CXC趋化因子受体家族成员的G蛋白偶联受体。CXCR5影响B细胞迁移和组织定位，如缺乏外周淋巴结的CXCR5敲除小鼠所证明的，具有较少的派伊尔斑(Peyer's patches)，并且具有降低的B细胞水平。CXCL13也称为BLC，是CXCR5的配体。CXCL13是一种B细胞化学引诱物。抗CXCR5结合剂在治疗上是相关的，并且它们已被配制成药物产品，所述药物产品可以施用于受试者(特别是人受试者)用于治疗炎性疾病。
含有抗CXCR5结合剂的适合于静脉内或皮下施用的药物制剂必须是高度浓缩的(约20mg/mL至约100-150mg/mL，甚至高达250mg/mL或更高)。然而，此类药物制剂的许多问题可能在高浓度处发生，包括增加的粘度，pH漂移和溶液颜色变化。此外，在高粘合剂浓度处，形成可见和亚可见(sub-visible)颗粒、结合剂聚集体和/或结合剂半分子的可能性是增加的。此外，在高粘合剂浓度处，药物制剂与其储存容器之间的相互作用机会是增加的。因此，仍然需要改进的药物制剂以避免这些限制。
发明内容
本发明提供了在玻璃储存容器中具有增加的储存稳定性的抗CXCR5抗体药物制剂。
在第一个方面，本发明提供适于对患者皮下施用的抗体制剂。所述制剂包括约50至约250mg/mL的抗CXCR5抗体；柠檬酸盐缓冲剂；大于约0.01％(w/v)表面活性剂；大于约50mM氨基酸；和大于约1％蔗糖。制剂的pH是约pH 6。
在第一个方面的一个实施方案中，抗CXCR5抗体或其片段包括：(a)包含SEQ IDNO:11的氨基酸序列的轻链可变域，和包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变域；(b)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)、RMSNLAS(SEQ ID NO:59)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)、GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)、和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(c)包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变域，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变域；(d)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)、RLSNLAS(SEQ ID NO:64)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)、GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)、和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(e)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)、RLSSNLAS(SEQ ID NO:65)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)、GFSLIDYGVN(SEQID NO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)、和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(f)包含SEQID NO:17、SEQ ID NO:19、或SEQ ID NO:21的氨基酸的可变轻链(VL)，和包含SEQ ID NO:23的氨基酸的可变重链(VH)；(g)包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、或SEQ ID NO:32的氨基酸的可变轻链，和包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸的可变重链；(h)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)、RMSNLA(SEQ ID NO:66)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)、GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID N:62)、和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(i)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)、RLSNLA(SEQ ID NO:67)、MQHLEYPYT(SEQ IDNO:60)、GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)、和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(j)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)、RLSSLA(SEQ ID NO:68)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)、GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)、和IVY(SEQ IDNO:63)的氨基酸序列；(k)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的可变轻链，和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的可变重链；(l)包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、或SEQ ID NO:43的氨基酸序列的可变轻链，和包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链；(m)包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的可变轻链，和包含SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57的氨基酸序列的可变重链；或(n)RSSKSLLHSSGKTYLYW(SEQ ID NO:69)、RMSNLA(SEQ ID NO:66)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)、GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)、和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列。
在第一个方面的另一个实施方案中，所述氨基酸是精氨酸或甲硫氨酸。
在第一个方面的一个实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯(polysorbate)。
在第二个方面，本发明提供适于对患者皮下施用的抗体制剂。所述制剂包括约100至约175mg/mL的抗体；约10mM柠檬酸盐缓冲剂；约0.1％(w/v)表面活性剂；约200mM精氨酸；和约4.5-9％蔗糖。制剂的pH是约pH 6。
在第二个方面的一个实施方案中，抗体是完全人抗CXCR5抗体。
在第二个方面的另一个实施方案中，抗体包括重链和轻链，所述重链包含SEQ IDNO:33的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在第二个方面的进一步的实施方案中，抗体包含单链Fv。
在第二个方面的另一个实施方案中，抗体是特异性结合至人CXCR5的胞外结构域的分离抗体或其片段。
在第二个方面的一个实施方案中，所述分离抗体或其片段包含RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)、RLSSLA(SEQ ID NO:68)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)、GFSLIDYGVN(SEQ IDNO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)、和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列。
在第二个方面的一个实施方案中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯。
在第二个方面的一个实施方案中，所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
在第三个方面，本发明提供一种抗体制剂，其包括约175mg/mL的人源化IgG4抗CXCR5抗体；约10mM柠檬酸盐缓冲剂；约1.0mg/mL聚山梨醇酯80；约200mM精氨酸HCl；和约45mg/mL蔗糖。所述制剂的pH是约pH 6。
在第三个方面的一个实施方案中，所述人源化IgG4抗CXCR5抗体包括重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
在第四个方面，本发明提供一种容器，所述容器包含前述任一方面的抗体制剂。
在第四个方面的一个实施方案中，所述容器是预填的注射器、小瓶或自动注射器。
在第四个方面的另一个实施方案中，容器包含权利要求呈冻干形式的前述任一方面的抗体制剂。
在第五个方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第四方面及其任何实施方案的容器，和用于施用和使用所述抗体制剂的标签或说明。
在第五个方面的一个实施方案中，施用通过注射进行。
在第六个方面，本发明提供前述任一方面或实施方案的抗体制剂，其用于治疗或诊断人体或动物体的方法中。
在第七个方面，本发明提供一种用于治疗类风湿性关节炎的方法，其包括将前述任一方面或实施方案的抗体制剂施用于对其有需要的受试者。
在第八个方面，本发明提供前述任一方面或实施方案的抗体制剂的冻干形式。
附图简述
图1是第一抗CXCR5抗体制剂安慰剂过滤后的纤维素过滤器的显微照片。放大倍率为50倍。
图2是第二抗CXCR5抗体制剂安慰剂过滤后的纤维素过滤器的显微照片。放大倍率为50倍。
图3是第三抗CXCR5抗体制剂安慰剂过滤后的纤维素过滤器的显微照片。放大倍率为50倍。
图4是存储在Nalgene瓶中的第一抗CXCR5抗体药物产品(DP；SAR113244)过滤后的纤维素过滤器的显微照片。放大倍率为50倍。
图5是图4的纤维素滤器在200X放大倍率的显微照片。
图6是第二抗CXCR5抗体DP过滤后的纤维素过滤器的显微照片。放大倍率为50倍。
图7是第一对照抗CXCR5抗体DP过滤后的纤维素过滤器的显微照片。放大倍率为50倍。第一对照抗CXCR5抗体DP是一种“无星尘(Stardust free)”对照制剂(SAR252067)，其显示了与第一抗CXCR5抗体DP类似的颗粒形成，但没有星尘颗粒。这种情况证明了星尘颗粒分析的困难。
图8是图7的纤维素过滤器在200X放大倍率的显微照片。
图9是SAR341403DP过滤后的纤维素过滤器的显微照片。放大倍率为50倍。
图10是图9的纤维素过滤器在200X放大倍率的显微照片。
图11是第二对照抗CXCR5抗体DP(SAR341403)过滤后的纤维素过滤器的显微照片。放大倍率为50倍。第二对照抗CXCR5抗体DP是另一种“无星尘”对照制剂，其显示了与第一抗CXCR5抗体DP类似的颗粒形成，并进一步证明了星尘颗粒分析的困难。
图12是图11的纤维素过滤器在200X放大倍率的显微照片。
图13是存储在塑料瓶中的DP SAR113244溶液(无星尘溶液)的DLS测量尺寸分布图。
图14是存储在玻璃小瓶中的DP溶液(含星尘溶液)的DLS测量尺寸分布图。
图15显示了来自样品的颗粒(顶部轨迹)的FT-IR光谱；底部轨迹指示蛋白质的谱作为比较；分别位于3300cm-1处的宽谱带和1650cm-1，1520cm-1处的两个酰胺谱带对于蛋白质是典型的。
图16是鉴定为蛋白质的颗粒的拉曼(Raman)光谱；第一轨迹指示来自样品的颗粒的光谱；第二轨迹指示具有减除(subtracted)背景的来自样品的颗粒的光谱；第三轨迹指示来自数据库(蛋白质)的最佳匹配的比较。
图17是鉴定为蛋白质的颗粒的FT-IR光谱。第一轨迹指示来自样品的颗粒的FT-IR光谱；第二轨迹指示与数据库(聚乙烯)的最佳匹配；第三轨迹指示作为比较的蛋白质的谱；分别位于3300cm-1处的宽谱带和1650cm-1，1520cm-1处的两个酰胺谱带对于蛋白质是典型的。
图18是鉴定为蛋白质的颗粒的拉曼光谱。第一轨迹指示来自样品的颗粒的光谱；第二轨迹指示具有减除背景的来自样品的颗粒的光谱；第三轨迹指示来自鉴定为聚乙烯的数据库的最佳匹配的比较。
图19示出了机械应力研究期间颗粒形成的结果；深灰色＝可见颗粒，浅灰色＝1-2个颗粒，散点白色＝大部分澄清溶液，白色＝无颗粒溶液；柱形从左到右指示：制剂A，H，B，C和D(参见表1)。
图20示出了机械应力研究期间颗粒形成的结果；深灰色＝可见颗粒，方格图案＝星尘或星尘样颗粒，浅灰色＝1-2个颗粒，散点白色＝大部分澄清溶液，白色＝无颗粒溶液；柱形从左到右表示：制剂A，H，E，F和G(参见表1)。
发明详述
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
应当注意，如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”也包括复数引用，除非上下文另有明确规定。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”表示在给定值或范围的10％内，例如5％(或1％或更小)以内。
术语“施用(administer)”或“施用(administration)”是指注射或以其他方式物理递送存在于患者体外物质(例如本发明的制剂)的行为，例如通过粘膜，皮内，静脉内，皮下，肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当治疗疾病或其症状时，该物质的施用通常在疾病或其症状发作之后发生。当预防疾病或其症状时，该物质的施用通常发生在疾病或其症状发作之前。
在多肽的上下文中，术语“类似物”是指多肽，其与CXCR5多肽，CXCR5多肽的片段，CXCR5表位，或抗CXCR5抗体具有相似或相同的功能，但其不一定包含与CXCR5多肽，CXCR5多肽的片段，CXCR5表位或抗CXCR5抗体相似或相同的氨基酸序列；或具有与CXCR5多肽，CXCR5多肽的片段，CXCR5表位，或抗CXCR5抗体相似或相同的结构。
具有相似氨基酸序列的多肽是指满足如下至少一项的多肽：(a)具有与本文所述的CXCR5多肽、CXCR5多肽的片段、CXCR5表位、或抗CXCR5抗体的氨基酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同的氨基酸序列的多肽；(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在严格条件下与编码本文所述的CXCR5多肽、CXCR5多肽的片段、CXCR5表位、或抗CXCR5抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列杂交至少5个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少125个氨基酸残基、或至少150个氨基酸残基(参见例如Sambrook等(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Maniatis等(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.)；及(c)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列与编码本文所述的CXCR5多肽、CXCR5多肽的片段、CXCR5表位、或抗CXCR5抗体(或其VH或VL区)的核苷酸序列至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同。具有与CXCR5多肽、CXCR5多肽的片段、CXCR5表位、或抗CXCR5抗体相似结构的多肽是指多肽，其具有与CXCR5多肽，CXCR5多肽的片段，CXCR5表位或CXCR5抗体相似的二级、三级或四级结构。多肽的结构可以通过本领域技术人员已知的方法测定，包括但不限于X射线晶体学、核磁共振和晶体电子显微术。
“拮抗剂”或“抑制剂”是指能够抑制靶分子的一种或多种生物活性的分子。拮抗剂可以通过使配体活化的细胞丧失能力或杀死细胞，和/或通过干扰受体或配体激活(例如酪氨酸激酶激活)或配体与受体结合后的信号转导来干扰受体对配体的结合，反之亦然。拮抗剂可以完全阻断受体-配体相互作用或可以显著减少这种相互作用。出于本发明的目的，拮抗剂的所有这些干预点应被视为等同的。
例如，CXCR5的“拮抗剂”或“抑制剂”是指能够抑制CXCR5的一种或多种生物活性(如信号传输)的分子。因此，包括在本发明范围内的是结合CXCR5的拮抗剂(例如中和抗体)，CXCL13或CXCR5的其他配体，CXCR5及其配体(如CXCL13)的复合物；CXCR5或CXCL13的氨基酸序列变体或衍生物，其拮抗CXCR5与配体如CXCL13之间的相互作用；可溶性CXCR5，其任选地融合至异源分子如免疫球蛋白区域(例如免疫粘附素)；包含与另一种受体或生物分子缔合的CXCR5的复合物；与CXCR5结合的合成或天然序列肽；等等。
术语“抗体”，“免疫球蛋白”或“Ig”在本文中可以互换使用。术语抗体包括但不限于合成抗体，单克隆抗体，重组产生的抗体，多特异性抗体(包括双特异性抗体)，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，胞内抗体，单链Fv(scFv)(例如包括单特异性，双特异性等)，骆驼化(camelized)抗体，Fab片段，F(ab′)片段，二硫键连接的Fv(sdFv)，抗独特型(抗Id)抗体和任何上述任一者的表位结合片段。具体而言，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有与CXCR5抗原特异性结合的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如抗CXCR5抗体的一个或多个互补决定区(CDR))。抗CXCR5抗体可以是任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，任何类型(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、和IgA2)，或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)的免疫球蛋白分子。在一些实施方案中，抗CXCR5抗体是人源化的，如人源化单克隆抗CXCR5抗体。在一些实施方案中，抗CXCR5抗体是IgG抗体，具体而言是人源化IgG4抗体。
如本文所用，术语“抗CXCR5抗体”是指与本文定义的人CXCR5特异性结合的抗体或其衍生出的多肽(衍生物)，包括但不限于抑制或显著降低CXCR5对其配体的结合和/或抑制CXCR5活性的分子。例如，涵盖的抗CXCR5抗体包括特异性结合人CXCR5胞外结构域的分离抗体或其片段，例如美国专利No.8,647,622中所公开的那些，其通过提述并入本文用于所有目的。具体而言，本发明的涵盖抗CXCR5抗体具有美国专利No.8,647,622的包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变轻链和包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的可变重链。在另一个实施方案中，特异性结合人CXCR5胞外结构域的分离抗体或其片段包括美国专利No.8,647,622的RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)、RLSSLA(SEQ ID NO:68)、MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)、GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)、VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)、和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列。
术语“B细胞活性”意指高于正常的B细胞水平，其可以是局部的，或B细胞的生物学表现或功能的证据，如抗体表达，Bruton's酪氨酸激酶存在或活性，CD19的表达或存在，B细胞活化因子的表达或存在等。
术语“结合剂”是指与CXCR5结合或特异性结合的任何分子，如抗体，siRNA，核酸，适体，蛋白质或小分子有机化合物,或其变体或其片段。
术语“副产物”包括不期望的产物，其降低或减小给定制剂中治疗/预防性结合剂(如抗体)的比例。例如，典型的副产物包括抗体的聚集体，抗体的片段，例如通过脱酰胺或水解作用降解抗体产生的片段，或其混合物。通常，聚集体是具有大于单体抗体的分子量的复合物。抗体降解产物可以包括例如抗体的片段，例如通过脱酰胺或水解作用产生的。通常，降解产物是具有小于单体抗体的分子量的复合物。在IgG抗体的情况下，这种降解产物小于约150kD。
术语“组合物”和“制剂”意在涵盖含有任选地指定量的指定成分(例如抗CXCR5抗体)的产品，以及直接或间接由指定成分的组合(任选地以指定量)产生的任何产品。
术语“恒定区”和“恒定域”是指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如与Fc受体的相互作用。该术语是指相对于免疫球蛋白的其他部分(含有抗原结合位点的可变域)具有更保守的氨基酸序列的免疫球蛋白分子的部分。恒定域包含重链的CH1，CH2和CH3域和轻链的CHL域。
术语“CXCR5”涉及在淋巴细胞、尤其是B细胞、特别是原初
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B细胞中天然存在的已知分子；涉及从这些细胞分离出的分子；涉及使用已知材料和方法并使用编码CXCR5的核酸经重组制备的分子；以及涉及CXCR5的某些部分，例如胞外(EC)结构域，其保留了与实施本发明有关的特点和性质，例如结合CXCL13。可溶的CXCR5分子可基本上由CXCR5的EC域组成，一般包括该分子的大约前60个氨基酸，即CXCR5的氨基末端部分。
CXCR5是非混杂受体。CXCL13是CXCR5的配体，在基底细胞例如滤泡树突状细胞和淋巴组织中为组成型表达。CXCL13特异吸引B细胞和一个T细胞的小亚组(其称为B辅助性滤泡T细胞(TFH))。考虑到免疫系统中的T细胞和B细胞群体之间有许多互相作用，这可不是预料不到的。而且，活化的T细胞诱导或上调CXCR5表达。已发现淋巴细胞浸润到三级异位生发中心(GC)与预先具有这类非典型的淋巴结样结构的某些病症中的病情加重和耐受崩溃充分相关。使用体内鼠模型，如CXCR5-/-和CXCL13-/-小鼠，受体或配体的缺失导致GC精细结构由于T细胞和B细胞定位改变和可能的互相作用而发生变化。这些小鼠还可受到保护，防止发生严重的胶原诱导的关节炎(CIA)。由于CXCR5选择性地在与RA发病相关的成熟B细胞上表达，阻断该受体可调节受累个体的致关节炎的反应。使用生物制品(即抗TNFα和抗CD20抗体，利妥昔单抗)治疗类风湿性关节炎已显示为临床有效，具体而言，接受B细胞导向疗法的患者的临床体征和症状已显示长期改善。选择性地靶向于仅在成熟B细胞和B辅助性T细胞上表达的CXCR5，不会影响B细胞的发育或使患者免疫力受损。与利妥昔单抗不同的是，本发明抗体是不介导细胞毒性的中和抗体。
“CXCR5疾病”是一种疾病、病症、病况、异常等，其特征或诱因是CXCL13或其它CXCR5的配体过表达或水平升高、B细胞水平升高、B细胞活性水平升高、CXCR5水平升高或CXCR5代谢或活性异常。
术语“表位”是指抗原(例如CXCR5多肽或CXCR5多肽片段)表面上能够结合至结合剂(例如抗体)的一个或多个抗原结合区的局部区，并且其在能够引发免疫响应的动物如哺乳动物例如人中具有抗原性或免疫原性活性。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体应答的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是抗体特异性结合的多肽的一部分，通过本领域熟知的任何方法，例如免疫测定法确定的。抗原表位不一定是免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面分子组成，例如氨基酸或糖侧链，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。参与形成表位的多肽的区域可以是多肽的连续氨基酸，或表位可以从多肽的两个或更多个非连续区域聚集而成。表位可以是或可以不是抗原的三维表面特征。抗CXCR5抗体可以特异性结合CXCR5的单体(变性)形式的表位，CXCR5的三聚体(天然)形式的表位，或者CXCR5的单体(变性)形式和三聚体(天然的)形式二者。
术语“赋形剂”是指通对于药物常用作稀释剂，载剂，防腐剂，粘合剂，稳定剂等的惰性物质，包括但不限于蛋白质(例如血清白蛋白等)，氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，组氨酸等)，脂肪酸和磷脂(例如烷基磺酸酯，辛酸酯等)，表面活性剂(例如SDS，聚山梨醇酯，非离子表面活性剂等)，糖类(例如蔗糖，麦芽糖，海藻糖等)和多元醇(例如甘露醇，山梨醇等)。另见Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)MackPublishing Co.,Easton,Pa.，其通过提述以其整体并入本文用于所有目的。
在肽或多肽的上下文中，术语“片段”是指包含小于全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可以例如来自氨基末端的截短，羧基末端的截短和/或氨基酸序列的内部残基缺失。片段可以由于可变RNA剪接或来自体内蛋白酶活性而产生。在一些实施方案中，hCXCR5片段包括这样的多肽，所述多肽包含CXCR5多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基，至少10个连续氨基酸残基，至少15个连续氨基酸残基，至少20个连续氨基酸残基，至少25个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽，至少40个连续的氨基酸残基，至少50个连续氨基酸残基，至少60个连续氨基残基，至少70个连续氨基酸残基，至少80个连续氨基酸残基，至少90个连续氨基酸残基，至少连续的100个氨基酸残基至少125个连续的氨基酸残基，至少150个连续氨基酸残基，至少175个连续氨基酸残基，至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基，或特异性结合CXCR5多肽的抗体。在一个具体实施方案中，CXCR5多肽的片段或特异性结合CXCR5抗原的抗体保留所述多肽或抗体的至少1个，至少2个，或至少3个功能。
术语“完全人抗体”或“人抗体”在本文中可互换使用，并且是指包含人可变区且可能包含人恒定区的抗体。在具体实施方案中，术语是指包含人来源的恒定区和可变区的抗体。在具体实施方案中，抗体是完全人抗体。术语“完全人抗体”包括具有对应于人种系免疫球蛋白序列的恒定区和可变区的抗体，如Kabat等(见Kabat等(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生与公众服务部，NIH出版号91-3242)。产生完全人抗体的方法是本领域已知的。
短语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组组合人抗体文库分离的抗体，从用于人免疫球蛋白基因的转基因和/或转染色体的动物(例如小鼠或牛)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式来制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体可以具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat等，1991)。然而，在一些实施方案中，对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者当使用针对人Ig序列的转基因动物，体内体细胞诱变时)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是可以不天然存在于体内的人体抗体种系库中的序列，虽然其源自人种系VH和VL序列并与之相关。
“IgG4结合剂”或“包含IgG4 Fc区的至少一部分的结合剂”均指本文所述的至少包含IgG4Fc的片段的结合剂。在一些实施方案中，该片段包含IgG4 Fc区的10、20、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210或220个氨基酸。在其它实施方案中，片段包含IgG4 Fc区的10-50、50-100、100-150或150-200个氨基酸。在其它实施方案中，IgG4 Fc区的部分可以与IgG4 Fc区具有一定的同源性。例如，IgG4结合剂可包括与IgG4 Fc区具有大于50、60、70、80、90、93、95、96、97、98、99、或100％同源性的蛋白质的一部分。IgG4的例示性Fc区描述于整个说明书中。
当用于指称抗体时，术语“重链”是指五种不同种类，称为alpha(α)，delta(Δ)，epsilon(ε)，gamma(γ)和mu(μ)，其基于重链恒定域的氨基酸序列。这些不同类型的重链是本领域熟知的，分别产生五类抗体，IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，包括IgG的四个亚型，即IgG1，IgG1，IgG3和IgG4。在一些实施方案中，重链是人重链。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或其它靶标结合亚序列)，与人抗体相比，其含有源自非人免疫球蛋白的序列。一般而言，所述人源化抗体基本包括一个、通常为两个的所有可变区，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，以及所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白模板序列的FR区。所述人源化抗体还可包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是所选择的人免疫球蛋白模板的恒定区。一般而言，目的是拥有在人体内免疫原性最低的抗体分子。因此，有可能一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸也可被变化成在人宿主体内免疫原性更低的氨基酸，但基本不降低所述一个或多个CDR对CXCR5或CXCL13的特异结合功能。或者，FR可为非人的，但免疫原性最强的氨基酸被替换为免疫原性较低的氨基酸。但是，上文所讨论的CDR移植并非是获得人源化抗体的唯一途径。例如，仅修饰CDR区可能不够充分，因为框架区残基参与确定CDR环的三维结构以及抗体与其配体的总亲和力的情况并不少见。因此，可实施任何方法以使非人亲代抗体分子被修饰为对人免疫原性更低的抗体分子，而且与人抗体的全域序列同一性并非总是必需的。因此，也可通过例如仅取代数个残基实现人源化，尤其是取代暴露在抗体分子外且没有被包埋在该分子内部从而不易接近宿主免疫系统的残基。本文在取代抗体分子上的“活动”或“柔性”残基方面教导了该方法，其目标是降低或减少所得分子的免疫原性，却不损害所述抗体对其表位或决定簇的特异性。参见例如Studnicka等，Prot Eng 7(6)805-814,1994；Lazar等,MolImmunol.2007Mar；44(8):1986-98(2007)；Sims等,J Immunol 151:2296(1993)；Chothia等,J Mol Biol 196:901(1987)；Carter等,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285(1992)；Presta等,J Immunol 151:2623(1993)，WO2006/042333和美国专利No.5,869,619。
“分离”或“纯化”的结合剂(如抗体)基本上不含细胞物质或来自细胞或组织来源或源自蛋白的培养基的其它污染蛋白，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化合物。例如，“基本上不含细胞物质”这一语言包括抗体的制备物，其中抗体与细胞的细胞组分分开，所述抗体从细胞中分离或以重组方式产生。因此，基本上不含细胞物质的抗体包括抗体的制备物，其具有小于约30％、20％、10％、或5％(干重)的异源蛋白(也称为污染蛋白)。当抗体是以重组产生时，理想的是基本上不含培养基，即，培养基占小于约20％、10％、或5％的蛋白制备物的体积。当抗体是通过化学合成产生时，在一些实施方案中，其基本上不含化学前体或其它化学物质，即其与化学前体或涉及蛋白合成的其它化学物质是分开的。因此，这些抗体制备物具有小于约30％、20％、10％、或5％(干重)的目的抗体以外的化合物或化学前体。在一些实施方案中，抗CXCR5抗体是分离或纯化的。
术语“人CXCR5”，“hCXCR5”或“hCXCR5多肽”和类似术语是指在美国专利No.8,647,622中公开、并合成或从合适的细胞源分离的多肽(“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用)，以及相关多肽，包括其SNP变体。相关多肽包括等位变体(例如SNP变体)；剪接变体；片段；衍生物；取代，缺失和插入变体；融合多肽；和种间同源物，在一些实施方案中，其保留CXCR5活性和/或足以产生抗CXCR5免疫响应。还涵盖CXCR5的可溶形式，其足以产生抗CXCR5免疫响应。如本领域技术人员会理解的，抗CXCR5结合剂(如抗体)可以结合CXCR5多肽，多肽片段，抗原和/或表位，因为表位是较大抗原的一部分，所述较大抗原是较大多肽片段的一部分，所述较大多肽片段又是较大多肽的一部分。
术语“Kabat编号”和类似术语是本领域中公认的，并且是指比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变)氨基酸残基的编号系统。(参见Kabat等(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391和Kabat等(1991))。
当指称抗体时，术语“轻链”是指基于恒定域的氨基酸序列的两种不同类型，称为kappa(κ)或lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域公知的。在一些实施方案中，轻链是人轻链。
术语“管理(manage)”，“管理(managing)”和“管理(management)”是指受试者从治疗(例如预防或治疗剂)获得的有益效果，其不会导致感染的治愈。在一些实施方案中，对受试者施用一种或多种治疗(例如预防或治疗剂，例如本发明的制剂)以“管理”CXCR5介导的疾病(例如类风湿性关节炎)或其一种或多种症状，以防止疾病的进展或恶化。
术语“单克隆抗体”是指从同质或基本上同质的抗体的群体获得的抗体，并且每个单克隆抗体通常会识别抗原上的单一表位。在一些实施方案中，“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体。术语“单克隆”不限于制备抗体的任何具体方法。例如，单克隆抗体可以通过如Kohler等；Nature,256:495(1975)所述的杂交瘤方法制备或可以从噬菌体文库中分离出来。制备克隆细胞系和由其表达的单克隆抗体的其它方法是本领域中已知的(参见例如Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第五版；Ausubel等编，JohnWiley and Sons，New York的第11章)。
术语“药学上可接受的”指由联邦或州政府的管理机构批准，或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出用于在动物，尤其是在人中使用的。
“药学上可接受的赋形剂”是指与活性分子如单克隆抗体组合用于制备接受的或方便的剂型的任何惰性物质。“药学上可接受的赋形剂”是所采用的剂量和浓度对受体无毒，并且与包含单克隆抗体的制剂的其它成分相容的赋形剂。
术语“预防(prevent)”，“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指由施用或本文提供的治疗或治疗组合(例如预防或治疗剂(如本发明的制剂)的组合)引起的CXCR5介导的疾病和/或与之相关的症状的进展、复发、发作或扩散的全部或部分抑制。
术语“预防剂”是指可以完全或部分抑制受试者中CXCR5介导的疾病和/或与之相关的症状的进展、复发、发作或扩散的任何试剂。在一些实施方案中，术语“预防剂”是指本发明的制剂。在一些其它实施方案中，术语“预防剂”是指除本发明制剂外的试剂。在一些实施方案中，预防剂是已知可用于或已经或正在用于预防CXCR5介导的疾病和/或与其相关的症状，或妨碍CXCR5介导的疾病和/或与其相关的症状的发作、发展、进展和/或严重程度的药剂。在具体实施方案中，预防剂是完全人抗体，如完全人单克隆抗体或人源化抗CXCR5抗体，如人源化抗CXCR5单克隆抗体。
术语“CXCR5抗原”是指结合剂(如抗体)特异性结合CXCR5多肽的部分。CXCR5抗原还指结合剂(如抗体)特异性结合的CXCR5多肽或其片段的类似物或衍生物。对表位有贡献的CXCR5多肽的区可以是多肽的连续氨基酸，或者表位可以由多肽的两个或更多个非连续区聚集而成。表位可以是或可以不是抗原的三维表面特征。能够引起免疫响应的CXCR5抗原的表面上的局部区是CXCR5表位。表位可以是或可以不是抗原的三维表面特征。
术语“CXCR5介导的疾病”和“CXCR5介导的病症”可互换使用，且是指完全或部分由CXCR5引起或作为CXCR5的结果的任何疾病。在一些实施方案中，CXCR5在细胞表面上异常(例如高度)表达。在一些实施方案中，CXCR5可在特定细胞类型上异常上调。在其他实施方案中，正常、异常或过量的细胞信号传导由CXCR5与CXCR5配体的结合引起。在一些实施方案中，CXCR5的配体是CXCL13。在一些实施方案中，CXCR5介导的疾病是类风湿性关节炎(RA)。
术语“糖”是指作为多元醇的衍生物的一类分子。糖通常被称为碳水化合物，并且可以含有不同量的糖(糖)单元，例如单糖，二糖和多糖。
术语“特异性结合”或“特异性结合”表示特异性结合抗原或其片段而不特异性结合其他抗原。例如，特异性结合抗原的抗体可以以较低亲和力结合至其它肽或多肽，如通过例如放射免疫测定(RIA)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，
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或本领域已知的其它测定法确定的。特异性结合抗原的抗体或其变体或片段可以与相关抗原交叉反应。在一些实施方案中，与抗原特异性结合的抗体或其变体或片段不与其他抗原交叉反应。特异性结合CXCR5抗原的抗体或其变体或其片段可以例如通过免疫测定法，
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或本领域技术人员已知的其它技术来鉴定。通常，特异性或选择性反应为至少两倍背景信号或噪声，更通常为多于10倍背景。关于抗体特异性的讨论参见例如Paul编,1989,FundamentalImmunology第二版,Raven Press,New York，第332-336页。
“稳定”或“稳定化”制剂是其中结合剂(如抗体)在其中基本上保留其存储时的物理稳定性，同一性，完整性和/或化学稳定性，身份(identity)，完整性和/或生物学活性的制剂。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域是可获得的，并综述于例如Peptideand Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee编,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中。稳定性可以在选择的温度和其他储存条件下于一段选择的时间段测量。稳定性可以通过选自由下列组成之群组的方法的至少一项来确定：目测，SDS-PAGE，IEF，HPSEC，RFFIT和κ/λELISA的方法中的至少一种来确定。例如，如果在目视检查颜色和/或透明度时，或者通过UV光散射、SDS-PAGE或通过(高压)大小排阻色谱(HPSEC)测量，其没有显示出聚集、沉淀和/或变性的迹象，则抗体“保留其物理稳定性”。在一些实施方案中，当使用本发明的制剂时，5％或更少，通常为4％或更少，通常为3％或更少，更通常为2％或更少，特别是1％或更少的抗体形成聚集体，如通过HPSEC或用于测量聚集形成的任何其它合适的方法所测量的。例如，如果抗体单体在特定制剂中于某些储存条件下经过一定的预定时间后具有约90％，通常约95％，特别是约98％的纯度，则认为抗体在特定制剂中是稳定的。化学稳定性可通过检测和定量化学改变形式的蛋白质来评估。化学改变可能涉及尺寸修饰(例如剪切)，其可以使用例如(HP)SEC，SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间(time-of-flight)质谱(MALDI/TOFMS)来评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如，作为脱酰胺的结果出现)，其可以通过例如离子交换色谱法进行评估。例如，如果抗体在给定时间的生物活性是制备抗体制剂之时所显示的生物活性的至少约90％(在测定误差内)，如在抗原结合测定法或病毒中和测定法中确定的，则抗体在给定时间在药物制剂中“保留其生物学活性”。
在一个具体实施方案中，抗体制剂可以是“稳定抵抗星尘颗粒形成的(stableagainst Stardust particle formation)”，其是指当在加速条件下在玻璃容器中储存6个月的时期时不会形成星尘颗粒的抗体制剂。
术语“受试者”和“患者”可以互换使用。如本文所用，受试者通常是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如牛，猪，马，猫，狗，大鼠等)或灵长类(例如猴和人)，并且在一些实施方案中是人。在一个实施方案中，受试者是具有CXCR5介导的疾病的哺乳动物，如人。在另一个实施方案中，受试者是处于发生CXCR5介导的疾病的风险的哺乳动物，如人。
术语“治疗有效量”是指足以降低和/或改善给定疾病和/或与其相关的症状的严重程度和/或持续时间的治疗(例如本发明的制剂)的量。该术语还包括降低或改善给定疾病的发展或进展，降低或改善给定疾病的复发、发展或发作和/或改进或增强另一疗法的预防或治疗效果(例如除本发明的制剂之外的治疗)所必需的量。在一些实施方案中，本发明的抗体的治疗有效量为约0.1mg/kg(受试者每千克体重的毫克抗体)至约100mg/kg。在一些实施方案中，其中提供的抗体的治疗有效量是约0.1mg/kg，约0.5mg/kg，约1mg/kg，3mg/kg，5mg/kg，约10mg/kg，约15mg/kg，约20mg/kg，约25mg/kg，约30mg/kg，约35mg/kg，约40mg/kg，约45mg/kg，约50mg/kg，约60mg/kg，约70mg/kg，约80mg/kg，约90mg/kg或约100mg/kg(或其中的范围)。在一些实施方案中，本文所用的“治疗有效量”也指实现特定结果(例如抑制细胞的CXCR5生物学活性，例如结合CXCL13)的本发明抗体的量。
术语“治疗剂”是指可用于治疗、管理或改善CXCR5介导的疾病和/或与其相关的症状的任何药剂。在一些实施方案中，术语“治疗剂”是指本发明的制剂。在某些其它实施方案中，术语“治疗剂”是指除本发明的制剂之外的药剂。在一些实施方案中，治疗剂是已知可用于或已经或正在用于治疗、管理或改善CXCR5介导的疾病或与其相关的一种或多种症状的药剂。
术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病(例如IBD或GVHD)或CXCR5介导的疾病(例如类风湿性关节炎)的任何方案、方法和/或药剂。在一些实施方案中，术语“疗法(therapies)”和“疗法(therapy)”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善本领域的技术人员(如医务人员)已知的CXCR5介导的疾病的生物疗法、支持性治疗和/或其他疗法。
术语“治疗(treat)”，“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指由施用一种或多种治疗(包括但不限于施用一种或多种预防或治疗剂，如本发明的制剂)所产生的CXCR5介导的疾病(例如，类风湿性关节炎)的进展、严重程度和/或持续时间的减少或改善。在CXCR5的具体实施方案中，此类术语是指CXCR5与CXCL13的结合的减少或抑制，和/或与CXCR5介导的疾病(如类风湿性关节炎)相关的一种或多种症状的抑制或减少。
术语“可变区”或“可变域”是指轻链和重链的一部分，通常是重链中的氨基末端约120至130个氨基酸和轻链中约100至110个氨基酸，其序列在抗体之间广泛不同，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列中的变异性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变域中更高度保守的区域称为框架区(FR)。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。氨基酸位置的编号根据EU标引，如Kabat等(1991)Sequences of proteins of immunological interest.(美国卫生与公众服务部，Washington,D.C.)第5版。(“Kabat等”)。在一些实施方案中，可变区是人可变区。
如本文所使用的，术语“星尘”和“星尘颗粒”可以互换使用，以指在容器内存在抗体制剂的情况下在玻璃容器中存在的颗粒。
B.制剂
本公开的制剂可以呈包含抗CXCR5结合剂的液体和冻干粉末的形式。此外，此类制剂可包括缓冲剂、表面活性剂、张力剂、氨基酸和其它赋形剂。
结合剂
在本发明的一些实施方案中，抗CXCR5抗体是人源化或完全人抗体。人源化和完全人抗体同种型的实例包括IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。在一些实施方案中，抗CXCR5抗体是IgG抗体。有四种形式的IgG。在一些实施方案中，抗CXCR5抗体是IgG4抗体。在本发明的一些实施方案中，抗CXCR5抗体是人源化IgG4抗体。
本发明制剂的一些实施方案还包括抗CXCR5结合剂的变体，例如抗体。抗CXCR5抗体的变体由于其相似性高而可以具有相似的物理化学性质，因此也包括在本发明的范围内。变体被定义为具有与抗CXCR5抗体至少95％，至少97％，例如至少98％或99％同源的氨基酸序列的抗体，并且能够竞争结合CXCR5多肽，CXCR5多肽片段或CXCR5表位。在一些实施方案中，这些变体会改善、中和或以其他方式抑制CXCR5生物活性(例如CXCL13与CXCR5的结合)。确定与靶标结合的竞争可以通过本领域技术人员已知的常规方法进行。在一些实施方案中，变体是人抗体，且在一些实施方案中是IgG4分子。在一些实施方案中，变体与本文公开的涵盖的抗体在氨基酸序列方面至少95％，96％，97％，98％或99％相同。术语“变体”是指与抗CXCR5抗体的氨基酸序列相比，包含被一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列的抗体。该变体可以具有保守的序列修饰，包括氨基酸取代、修饰、添加和/或缺失。
修饰的实例包括但不限于糖基化，乙酰化，聚乙二醇化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封闭基团的衍生化，蛋白水解切割和与细胞配体或其他蛋白质的连接。氨基酸修饰可以通过本领域已知的标准技术引入编码抗体的核酸中，所述标准技术如定点诱变、分子克隆、寡核苷酸定向诱变和随机PCR介导的诱变。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似结构或化学性质的氨基酸残基取代的那些取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，非极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸)。本领域技术人员清楚的是，还可以采用除上述使用的以外的氨基酸残基家族的分类。此外，变体可以具有非保守氨基酸取代，例如用具有不同结构或化学性质的氨基酸残基取代某一氨基酸。类似的微小变化还可包括氨基酸缺失或插入，或二者。可以使用本领域熟知的计算机程序来找到用于确定哪些氨基酸残基可被取代、修饰、插入或缺失而不消除免疫活性的指导。可使用本领域技术人员已知的计算机算法，例如Gap或Bestfit，来最佳地比对待比较的氨基酸序列并定义相似或相同的氨基酸残基。变体可以具有与抗CXCR5抗体相同或不同(较高或较低)的结合亲和力，但仍然能够特异性结合CXCR5，并且可以具有与抗CXCR5抗体相同、更高的或更低的生物学活性。
本发明的实施方案还包括抗CXCR5结合剂(如抗体)的抗原结合片段。术语“抗原结合域”，“抗原结合区”，“抗原结合片段”和类似术语是指包含与抗原相互作用并赋予结合剂对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基的抗体部分(例如互补决定区(CDR))。抗原结合区可以来源于任何动物物种，例如啮齿动物(例如兔、大鼠或仓鼠)和人。在一些实施方案中，抗原结合区域源自人。抗原结合片段的非限制性实例包括：Fab片段，F(ab')2片段，Fd片段，Fv片段，单链Fv(scFv)分子，dAb片段和由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。
在本发明的一些实施方案中，抗CXCR5结合剂(或其变体或其抗原结合片段)会改善、中和或以其它方式抑制体内CXCR5生物活性(例如CXCL13与CXCR5的结合)。
在本发明的一些实施方案中，抗CXCR5结合剂(或其变体或其抗原结合片段)是改善、中和或以其它方式抑制体内CXCR5生物活性(例如CXCL13与CXCR5的结合)的拮抗剂结合剂。
在一些实施方案中，抗CXCR5结合剂(或其变体或其抗原结合片段)以约50至约500mg/mL、约25至约400mg/mL、约50至约250mg/mL、约5mg/mL至约280mg/mL、约5mg/mL至约200mg/mL、约5mg/mL至约125mg/mL、约5mg/mL至约75mg/mL、约5mg/mL至约50mg/mL、和约5mg/mL至约25mg/mL的量存在于制剂中。例如，抗CXCR5结合剂可以约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL、约100mg/mL、约105mg/mL、约110mg/mL、约115mg/mL、约120mg/mL、约125mg/mL、约130mg/mL、约135mg/mL、约140mg/mL、约145mg/mL、约150mg/mL、约155mg/mL、约160mg/mL、约165mg/mL、约170mg/mL、约175mg/mL、约180mg/mL、约185mg/mL、约190mg/mL、约195mg/mL、约200mg/mL、约205mg/mL、约210mg/mL、约215mg/mL、约220mg/mL、约225mg/mL、约230mg/mL、约235mg/mL、约240mg/mL、约245mg/mL、约250mg/mL、约255mg/mL、约260mg/mL、约265mg/mL、约270mg/mL、约275mg/mL、或约280mg/mL的量存在于制剂中。
在可供选择实施方案中，抗CXCR5结合剂可以以约5至约25mg/mL、约26至约50mg/mL、约51至约75mg/mL、约76至约100mg/mL、约101至约125mg/mL、约126至约150mg/mL、约151至约175mg/mL、约176至约200mg/mL、约201mg/mL至约225mg/mL、约226mg/mL至约250mg/mL、约251至约280mg/mL、约5至约25mg/mL、约40至约60mg/mL、约75至约85mg/mL、或约90至约110mg/mL的量存在于制剂中。
在第一个具体实施方案中，涵盖的抗体是特异性结合人CXCR5的细胞外结构域的分离的抗体或其片段。抗体或其片段可以包括：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的轻链可变域，和包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链可变域；(b)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ IDNO:58)，RMSNLAS(SEQ ID NO:59)，MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)，GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)，VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)，和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(c)包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、或SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链可变域，和包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变域；(d)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)，RLSNLAS(SEQ ID NO:64)，MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)，GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)，VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)，和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(e)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)，RLSSNLAS(SEQID NO:65)，MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)，GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)，VIWGDGTTY(SEQ IDNO:62)，和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(f)包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、或SEQID NO:21的氨基酸序列的可变轻链(VL)，和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的可变重链(VH)；(g)包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、或SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变轻链，和包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重链；(h)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQID NO:58)，RMSNLA(SEQ ID NO:66)，MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)，GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)，VIWGDGTTY(SEQ ID N:62)，和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(i)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)，RLSNLA(SEQ ID NO:67)，MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)，GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)，VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)，和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(j)RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)，RLSSLA(SEQ ID NO:68)，MQHLEYPYT(SEQ IDNO:60)，GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)，VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)，和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列；(k)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的可变轻链，和包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的可变重链；(l)包含SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、或SEQ ID NO:43的氨基酸序列的可变轻链，和包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47的氨基酸序列的可变重链；(m)包含SEQID NO:55的氨基酸序列的可变轻链，和包含SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:57的氨基酸序列的可变重链；或(n)RSSKSLLHSSGKTYLYW(SEQ ID NO:69)，RMSNLA(SEQ ID NO:66)，MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)，GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)，VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)，和IVY(SEQ IDNO:63)的氨基酸序列。
在第二个具体实施方案中，涵盖的抗体是特异性结合人CXCR5的细胞外结构域的分离抗体或其片段。抗体或其片段包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列，所述可变重链包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列。
在第三个具体实施方案中，涵盖的抗体是特异性结合人CXCR5细胞外结构域的分离的抗体或其片段。抗体或其片段包含RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO:58)，RLSSLA(SEQ IDNO:68)，MQHLEYPYT(SEQ ID NO:60)，GFSLIDYGVN(SEQ ID NO:61)，VIWGDGTTY(SEQ ID NO:62)，和IVY(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列。
在上述第一、第二或第三具体实施方案中的任一个中，抗体或其片段可进一步包括一个或多个恒定区。所述一个或多个恒定域可以由CH1，CH2，CH3和/或CL组成。所述一个或多个恒定区可来自IgG抗体，其可为例如IgG4抗体。
在上述第一、第二或第三具体实施方案中的任一个中，抗体或其片段可以是单链Fv。
在一个实施方案中，涵盖了医药组合物，其包含治疗有效量的上述第一、第二或第三具体实施方案中的任一个的抗体或其片段和药学上可接受的载体。
缓冲剂
本发明的制剂可以包括柠檬酸盐缓冲剂作为缓冲剂。也可以使用其它缓冲液。缓冲剂维持生理适宜的pH。此外，缓冲剂增强制剂的等渗性和化学稳定性。在一些实施方案中，柠檬酸盐缓冲液以约0.5mM至约50mM，例如约5mM至约15mM的浓度存在于制剂中。例如，柠檬酸盐缓冲液可以以约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约23mM、约24mM、约25mM、约26mM、约27mM、约28mM、约29mM、约30mM、约31mM、约32mM、约33mM、约34mM、约35mM、约36mM、约37mM、约38mM、约39mM、约40mM、约41mM、约42mM、约43mM、约44mM、约45mM、约46mM、约47mM、约48mM、约49mM、或约50mM的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，柠檬酸盐缓冲液以约7mM至约13mM，如约9mM至约11mM的浓度存在于制剂中。在一些实施方案中，柠檬酸盐缓冲液以约10mM的浓度存在。
在一些实施方案中，本发明的制剂具有pH6以下的pH值。在一些实施方案中，制剂的pH范围为约5.0至约6.0。例如，制剂的pH可为约5.0，约5.1，约5.2，约5.3，约5.4，约5.5，约5.6，约5.7，约5.8，约5.9和约6.0。在一些实施方案中，制剂的pH范围可为约5.5至约6.0。在一些实施方案中，pH值是约5.5或约6.0。制剂的pH可以通过本领域技术人员已知的任何手段测量。用于测量pH的手段是使用带有微电极的pH计。可以使用本领域已知的任何方法调节制剂的pH。用于改变制剂的pH的例示性化学品是盐酸(HCl)和氢氧化钠(NaOH)。
在一些实施方案中，本发明的制剂具有等于或低于结合剂(如抗体)的等电点(pI)的pH。等电点是特定分子或表面不带有净电荷的pH。抗CXCR5结合剂的pI可以通过本领域技术人员已知的任何方法来确定。在一些实施方案中，抗CXCR5抗体的pI由变性等电聚焦来确定。本文涵盖的完全人IgG4抗体的pI范围可为约6.9至约9.1。
例如，涵盖的制剂包括抗CXCR5结合剂和柠檬酸盐缓冲剂，其中制剂的pH等于或低于约pH 6和结合剂的等电点(pI)。本发明的制剂相对于常规的IgG4结合剂制剂(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)制剂)提供显著的改进，后者在增加制剂中结合剂浓度时会形成不需要的副产物。特别地，本发明的制剂具有减少的量的聚集体，半分子，降解产物，低分子量蛋白质(LMWP)，高分子量蛋白质(HMWP)以及制剂中的结合剂的酸性、碱性和中性同种型的重排。
表面活性剂
本发明的制剂可以任选地还包含表面活性剂，其也称为稳定剂。表面活性剂/稳定剂是在制剂中相互作用并稳定生物分子和/或一般药物赋形剂的化学化合物。在一些实施方案中，表面活性剂可以连同较低温度的储存一起使用。表面活性剂通常保护结合剂免受空气/溶液界面诱导的应力和溶液/表面诱导的应力，否则可能导致蛋白质聚集。表面活性剂可以包括但不限于聚山梨醇酯，甘油，二羧酸，草酸，琥珀酸，富马酸，邻苯二甲酸及其组合。本领域技术人员知晓，可以使用其它表面活性剂，例如非离子或离子型洗涤剂，只要它们是药学上可接受的，即适于施用于受试者的。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯。聚山梨醇酯的实例包括聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60，聚山梨醇酯65和聚山梨醇酯80。
在示例性实施方案中，表面活性剂以约0.001％至约0.1％(w/v)的量存在于制剂中。例如，表面活性剂可以以约0.001％(w/v)、约0.002％(w/v)、约0.003％(w/v)、约0.004％(w/v)、约0.005％(w/v)、约0.006％(w/v)、约0.007％(w/v)、约0.008％(w/v)、约0.009％(w/v)、约0.01％(w/v)、约0.02％(w/v)、约0.03％(w/v)、约0.04％(w/v)、约0.05％(w/v)、约0.06％(w/v)、约0.07％(w/v)、约0.08％(w/v)、约0.09％(w/v)、和约0.1％(w/v)的量存在于制剂中。在具体实施方案中，表面活性剂以约0.003％至约0.05％(w/v)、约0.004％至约0.025％(w/v)、或约0.005％至约0.02％(w/v)，例如约0.005％(w/v)的量存在于制剂中。例如，聚山梨醇酯20可以以约0.001％至约0.1％(w/v)、约0.002％至约0.01％(w/v)、约0.003％至约0.008％(w/v)、和约0.004％至约0.006％(w/v)，例如约0.005％(w/v)的量存在。在可选择的实施方案中，聚山梨醇酯20以约0.001％至约0.1％(w/v)、约0.005％至约0.05％(w/v)、和约0.0075％至约0.025％(w/v)，例如约0.01％(w/v)的量存在。在其他可选择的实施方案中，聚山梨醇酯20以约0.001％至约0.1％(w/v)、约0.005％至约0.05％(w/v)、和约0.01％至约0.03％(w/v)，例如约0.02％(w/v)的量存在。
张力剂
本发明的制剂可以任选地进一步包含张力剂。通常，张力剂用于调节或维持制剂的重量摩尔渗透压浓度，以使其更接近体液(例如血液或血浆)的渗透压。张力剂也可以维持制剂中的结合剂水平。部分地，张力剂有助于保持制剂中存在的治疗活性粘合剂的水平、比率或比例。如本文所用，术语“张力”是指生物组分在流体环境或溶液中的行为。等张溶液具有与血浆相同的渗透压，并且可以静脉内输注到受试者中而不改变受试者血浆的渗透压。实际上，在本发明的一些实施方案中，张力剂以足以使制剂适合静脉输注的量存在。通常，张力剂也用作填充剂或稳定剂。因此，张力剂可以允许结合剂克服各种应力，例如冷冻和剪切。张力剂可以包括但不限于糖类，糖类，甘油，山梨醇，甘露醇，氯化钠，氯化钾，氯化镁和其它无机盐。本领域技术人员知晓可以使用其它张力剂，只要它们是药学上可接受的，即适于施用于受试者的。
在一些实施方案中，张力剂以约0.1％至10％(w/v)的量存在于制剂中。例如，张力剂可以以约0.1％(w/v)、约0.2％(w/v)、约0.3％(w/v)、约0.4％(w/v)、约0.5％(w/v)、约0.6％(w/v)、约0.7％(w/v)、约0.8％(w/v)、约0.9％(w/v)、约1％(w/v)、约2％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、约4.5％(w/v)、约5％(w/v)、约5.5％(w/v)、约6％(w/v)、约7％(w/v)、约8％(w/v)、约9％(w/v)、和约10％(w/v)的量存在于制剂中。或者，张力剂可以以约2％至约8％(w/v)、约3％至约7％(w/v)、和约4％至约6％(w/v)的量存在于制剂中。在另外的可选择的实施方案中，张力剂可以以约0.1％至约1％，约0.1％至约0.5％，约0.1至约0.3％和约0.2％的量存在于制剂中。
在一些示例性实施方案中，张力剂是糖。糖的实例包括葡萄糖，蔗糖(其也称为蔗糖)，麦芽糖，海藻糖，右旋糖，木糖醇，果糖和甘露醇。例如，甘露醇可以以约1％至约10％(w/v)，约2％至约8％(w/v)或约3％至约5％(w/v)，例如约4％(w/v)的量存在。或者，蔗糖(其也称为蔗糖)可以以约1％至约10％(w/v)，约3％至约8％(w/v)或约4％至约6％(w/v)，例如约4.5、5、5.5或6％(w/v)的量存在。
在一些其它的示例性实施方案中，张力剂是氯化钠。例如，氯化钠可以以约0.1％(w/v)，约0.2％(w/v)，约0.3％(w/v)，约0.4％(w/v)，约0.5约0.6％(w/v)，约0.7％(w/v)，约0.8％(w/v)，约0.9％(w/v)和约1％(w/v)的量存在。或者，氯化钠可以以约0.1％至约1％，约0.1％至约0.5％，约0.1至约0.3％和约0.2％的量存在于制剂中。
在另外的示例性实施方案中，制剂可以包含一种或多种张力剂。例如，制剂可以包含上述浓度的一种或多种上述张力剂。在一些具体实施方案中，制剂可以包含蔗糖和氯化钠，其中蔗糖和氯化钠浓度各自为约0.1％至约10％(w/v)。在一些实施方案中，蔗糖浓度约为6％，氯化钠浓度约为0.2％。或者，蔗糖浓度为约4.5％，氯化钠浓度为约0.2％。
在本发明的某些实施方案中，制剂的重量摩尔渗透压浓度范围为约200mOsm/kg至约350mOsm/kg，约270mOsm/kg至约330mOsm/kg，约280mOsm/kg至约320mOsm/kg，或约290mOsm/kg至约310mOsm/kg，例如约300mOsm/kg。换言之，一些实施方案中，本发明的制剂在基本上是等张的，即具有与人血液基本上相同的渗透压。重量摩尔渗透压浓度可以通过本领域技术人员已知的任何方法测量，例如使用蒸汽压力或冰冻型渗透压计。本发明制剂的重量摩尔渗透压浓度可以例如由本文所述的一种或多种张力剂调节。
氨基酸
本发明的制剂任选还可包含氨基酸。氨基酸的实例包括但不限于甘氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，赖氨酸，丝氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，甲硫氨酸，精氨酸和脯氨酸。在示例性实施方案中，氨基酸以约0.1％至5％(w/v)的量存在于制剂中。例如，氨基酸可以以约0.1％(w/v)、约0.2％(w/v)、约0.3％(w/v)、约0.4％(w/v)、约0.5％(w/v)、约0.6％(w/v)、约0.7％(w/v)、约0.8％(w/v)、约0.9％(w/v)、约1.0％(w/v)、约1.1％(w/v)、约1.2％(w/v)、约1.3％(w/v)、约1.4％(w/v)、约1.5％(w/v)、约1.6％(w/v)、约1.7％(w/v)、约1.8％(w/v)、约1.9％(w/v)、约2.0％(w/v)、约3％(w/v)、约4％(w/v)、和约5％(w/v)的量存在于制剂中。或者，氨基酸以约1.3％至约1.8％(w/v)或约1.4％至约1.6％(w/v)，例如约1.5％(w/v)的量存在于制剂中。在另外的可选择的实施方案中，氨基酸以约0.5％至约1.5％(w/v)，或约0.8％至约1.2％(w/v)，例如约1.0％(w/v)的量存在于制剂中。示例性的氨基酸是脯氨酸或精氨酸。例如，脯氨酸可以以约1％至约2％(w/v)，约1.3％至约1.8％(w/v)，约1.4％至约1.6％(w/v)，例如约1.5％(w/v)的量存在于制剂中。或者，精氨酸可以以约0.5％至约1.5％(w/v)或约0.8％至约1.2％(w/v)，例如约1.0％(w/v)的量存在于制剂中。
其他赋形剂
此外，本发明的制剂可以包含其它赋形剂，包括但不限于注射用水，稀释剂，增溶剂，舒缓剂，额外的缓冲剂，无机或有机盐，抗氧化剂等。然而，在一些实施方案中，除了上述那些之外，本发明的制剂不包括其它赋形剂。其它药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.Ed.(1980)中所述的那些可以包括在制剂中，条件是它们不会不利地影响制剂的期望特征。在一个具体实施方案中，制剂基本上不含防腐剂，但是在可选择的实施方案中，可根据需要加入防腐剂。例如，冻干制剂中可以包括冷冻保护剂或冻干保护剂。
液体或冻干制剂
本发明的制剂可以是液体制剂或冻干制剂。在一些实施方案中，液体配方可即用于注射，也可以在注射前加以稀释。或者，制剂可以是冻干粉末。在一些实施方案中，冻干粉末准备与多种溶剂体积中的一种组合以恰好在施用之前达到期望的浓度。
示例性的制剂
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了适用于皮下施用的稳定液体抗体制剂，该制剂包含：
a)大于约100mg/mL，例如约100至约175mg/mL的完全人抗CXCR5抗体，其包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链；
b)约10mM柠檬酸盐缓冲剂；
c)约0.1％(w/v)聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；和
d)约200mM精氨酸；
e)约4.5-9％蔗糖，
其中所述制剂的pH是约pH 6.0。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了稳定的抗体制剂，其包含：
a)约150至约175mg/mL的人源化IgG4抗CXCR5抗体，其包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链；
b)约10mM柠檬酸盐缓冲剂；
c)约0.1％(w/v)聚山梨醇酯80；和
d)约200mM精氨酸；
e)约4.5％蔗糖，
其中所述制剂的pH是约pH 6.0。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明提供了稳定的抗体制剂，其包含：
a)175mg/mL的人源化IgG4抗CXCR5抗体，其包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链；
b)约10mM柠檬酸盐缓冲剂；
c)约0.1％聚山梨醇酯80；和
d)约200mM精氨酸；
e)约4.5％蔗糖，
其中所述制剂的pH是约pH 6.0。
稳定性
涵盖的制剂在5℃稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长，通常至少约12、18或24个月或更长。在示例性实施方案中，它们在5℃稳定至少约6个月或更长时间。在其它示例性实施方案中，它们在5℃稳定至少约9个月。在进一步的示例性实施方案中，它们在5℃稳定至少约1年或更长，并且通常大于约2年或大于约4年。
施用模式
在本发明的一些实施方案中，所述制剂适合于胃肠外，静脉内，肌内，皮内，皮下或其组合的施用。本发明的制剂适合于通过各种技术的递送。
剂量和剂型
本发明制剂的有效剂量取决于许多不同的因素而变化，包括施用手段，靶位点，受试者的生理状态，受试者是人类还是动物，施用的其他药物，以及治疗是预防性还是治疗性的。通常，受试者是人，但也可以治疗非人哺乳动物包括转基因哺乳动物。治疗剂量可能需要滴定以优化安全性和功效。
本发明的制剂可以多次施用。单次施用之间的间隔可以是每日，每周，每两周，每月或每年。间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调节剂量以实现某种血浆结合剂例如抗体浓度。剂量和频率将根据受试者中抗CXCR5结合剂(例如抗体)的半衰期而变化。通常，人抗体显示最长的半衰期，然后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。
在进一步的实施方案中，本发明提供了包含治疗有效量的本发明制剂的药物单位剂型，其用于通过向受试者施用剂型来治疗受试者中的一种或多种疾病。在一些实施方案中，所述受试者是人。人可以是成年人或可以是婴儿。术语“药物单位剂型”是指适于作为待治疗受试者的统一单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的活性化合物，其经计算与所需柠檬酸盐缓冲液和pH相结合产生所期望的治疗/预防效果。
单位剂型可为包含制剂的容器。合适的容器包括但不限于密封的安瓿，小瓶，瓶，注射器和试管。容器可由各种材料(例如玻璃或塑料)形成，并且可以具有无菌进入口(例如容器可为具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。在一些实施方案中，容器是小瓶。通常，容器应保持制剂的无菌性和稳定性。
在具体实施方案中，将制剂包装在由透明、无色I型玻璃制成的4mL小瓶(2R ISO小瓶)中，并用带有法兰(聚丙烯)的翻转盖(flip-of cap)封闭的塞子(含氟聚合物涂覆的溴丁基)封闭。在一些实施方案中，将小瓶装有1.7mL制剂，使得小瓶具有每小瓶约0.2mL的过量体积，以及1.5mL的可提取体积。例如，这意味着抗体的剂量强度(例如175mg/mL)会包含在1.5mL溶液中。
在一个具体实施方案中，将制剂二次包装在保护小瓶不受光照的容器(例如纸板盒)中。
试剂盒
本发明的一些实施方案包括包含本发明制剂的试剂盒。试剂盒还可以包含一个或多个包含药学上可接受的赋形剂的容器，并且包括来自市场和用户的观点所需的其它材料(包括过滤器/针和注射器)。与试剂盒相关联的可以是通常包括在治疗、预防或诊断产品的商业包装中的说明书，其包含关于例如关于使用这种治疗、预防或诊断产品的适应症，用法，剂量，制造，施用，禁忌症和/或警告的信息。该试剂盒还可与标签相关联，所述标签可以是包含信息的任何种类的数据载体(例如传单，贴纸，芯片，打印物或条形码)。在一些实施方案中，上述指示等可包含在标签中或标签上。该试剂盒可进一步包括用于施用制剂的装置，特别是包含制剂的装置，即预填充装置，如但不限于预填充的注射器或预填充的自动注射器。试剂盒还可包含容器，所述容器包含制剂，即预填充的容器，如预填充的小瓶、药筒(cartouche)、小袋(sachet)或安瓿。
不同实施方案的组合
在本发明的上下文中，除非另有明确说明，否则本文描述的实施方案中的任一个可以与一个或多个本文描述的实施例组合。具体而言，本文所述的任何一种结合剂和抗体及其本文所述的制剂可以与任何试剂盒、预填充的装置或预填充的容器组合使用，或可用于治疗方法或医药用途，如本文所述与各抗体相关的(例如包含抗CXCR5抗体的稳定制剂可与本文所述的任何一种试剂盒、容器或装置组合)。任何本文所述的特异性结合抗原的结合剂(例如特异性结合CXCR5的结合剂)也可用于如本文所述与各抗体(即抗CXCR5)相关的治疗方法，反之亦然。
实施例
以下实施例阐述了本发明的具体实施方案。它们仅用于说明目的，而不应视为限制本发明。
实施例1：星尘颗粒形成的分析
A)导言
由Sanofi命名为SAR113244的药物产品(DP)是选择性结合人CXCR5的人源化IgG单克隆抗体(mAb)，并公开在U.S.8,647,622中。它是为胃肠外皮下投予而开发的，作为用于以100mg/mL的浓度注射的溶液。注射用DP溶液包装在2mL透明无色小瓶(I型玻璃)中，用塞子(含氟聚合物涂覆的溴丁基橡胶)和具有法兰(铝)的翻转盖(flip-off cap)(聚丙烯)封闭。
SAR113244单克隆抗体的制剂开发最终得到了用于I期临床研究的制剂，其含有10mg/mL的精氨酸，2mg/mL的NaCl，0.01％的聚山梨醇酯20和10mM的柠檬酸盐缓冲液，并具有6的pH(以下称为“DP溶液”)。该化合物在化学稳定性和亚可见颗粒方面是稳定的。然而，大约一年之后，当将制剂储存在玻璃主要包装材料(例如小瓶或预填充的注射器)中时，发生可见颗粒的形成。当主要包装材料是塑料(袋或瓶)时，不会发生可见颗粒的形成。
在针对阶段1临床研究计划的相容性研究期间，存储在2R ISO玻璃小瓶(Schott，Elmsford，NY)中的DP溶液中发现了可见颗粒。颗粒非常小，有光泽，悬浮，因此称为“星尘颗粒”。星尘颗粒的发现导致研究停止，并将DP溶液批次进行检疫(quarantine)。实施了立即行动计划，并对在线过滤方案进行了调查并应用于临床研究。这在修改文本中进行了总结，所述修改文本由卫生部门批准而无任何意见，研究可以重新启动。然而，对于进一步的临床研究，期望开发出没有星尘颗粒的制剂。在此，我们描述了一种制备不含星尘颗粒的含SAR113244的高度浓缩制剂的方法。
星尘颗粒不存在于存储在袋中或存储在
Figure BDA0001984263040000301
瓶中的DP溶液中。在制造过程后直接存储在玻璃小瓶中的DP溶液中也不存在星尘颗粒。据信玻璃小瓶中的星尘颗粒大约在储存一年后发生。检查了使用相同的设备、使用相同的填充线、使用相同的塞子、填充于相同种类的小瓶的其他产品(例如蛋白治疗剂)的颗粒，并且从未发生任何星尘颗粒。
使用
Figure BDA0001984263040000302
成像或DP溶液中的透光度进行的亚可视粒子的测量始终处于接受范围，而不管星尘颗粒是否存在。在稳定性研究中在制造后直接得到的样品和长期存储时间≥1年的样品的亚可见颗粒中未检测到差异。为了去除星尘颗粒，随后开发了一种新的、无星尘的制剂，用于II期临床试验。最终，该制剂显示在加速条件(40℃)下出在玻璃容器中稳定6个月，在2-8℃稳定12个月。
B)方法
DP溶液的目测：在完成DP批次之后，直接由受过训练的人员进行DP溶液的目测。通过如下来测试小瓶：倒置小瓶一次或两次，随后观察小瓶5至15秒(实验室1：LiquidInspection Viewer Apollo II；实验室2：Black Box(黑盒子))或观察无倒置的旋转小瓶(实验室3：带放大镜的Seidenader小瓶检验机)。光源为2000-3750Lux。
DP溶液容器中的玻璃分层：分析四个不同批次的玻璃分层(3个临床批次，一个技术批次)。为此，测试每批10mL的DP溶液，以确定渗入溶液中的玻璃元素(即Si，B，Ca和Al)的量。本研究使用了四组容器：SCHOTT I型加(涂覆SiO2的小瓶)，SCHOTT标准Fiolax，SCHOTTDC(分层控制)和BD预填充的注射器。将不同溶液储存在60℃，并在三个不同的时间点(1、4和12周后)进行分析。对于“片状(flake-like)”和/或“非片状”颗粒的存在，通过眼睛和放大摄像机进行目测。在每个时间点测试了十个容器。此外，使用具有扩展的焦点深度的立体显微镜对每个对照样品组的5个空容器进行了光学检查，以定性地确定是否有存在于容器内表面上的玻璃腐蚀或反应区的任何迹象。另外，通过具有扩展的焦点深度的立体显微镜分析了每个样品组的10个空的容器和抽出点(pull point)，以确定是否有存在于容器内表面上的玻璃腐蚀或反应区的任何迹象。在每组每个抽出点处的两个“最差”容器的内表面上，进行SEM横截面分析。总计，对每个样品组的每个抽出点处从容器汇集的10mL的安慰剂溶液(含有10mM柠檬酸盐缓冲液，2g/L NaCl，10g/L精氨酸-HCl，45g/L蔗糖(4.5％)和0.01％聚山梨醇酯20)进行了分析，以定量确定渗入溶液中的玻璃元素的量。
机械稳定性研究：为了确定机械应力是否有助于DP溶液中星尘颗粒的形成，进行了机械应力研究。在制造过程中，将DP溶液添加至混合容器中并加入赋形剂。将体积为10mL的8种不同制剂(参见下表1，每种组合物基于柠檬酸盐缓冲液)在200rpm搅拌30分钟或2小时。混合赋形剂后，检查溶液中是否存在可见颗粒。然后将溶液过滤并装入2R玻璃小瓶中。随后进行目测，溶液在40℃储存4周，每周检查。
表1：测试的制剂的概览
样品 组合物
A 柠檬酸盐缓冲液pH 6100mg/mL,无DP
B 100mg/mL DP，具有0.01％PS 20
C 100mg/mL DP，具有0.05％PS 20
D 100mg/mL DP，具有0.1％PS 20
E 100mg/mL DP，具有0.01％PS 80
F 100mg/mL DP，具有0.05％PS 80
G 100mg/mL DP，具有0.1％PS 80
H 100mg/mL DP，无PS
DP-药物产品(SAR113244)
RapID研究(过滤，拉曼(Raman)和FT-IR)：在本研究过程中，分析了5个DP溶液样品。首先对封闭容器中的DP溶液进行目测。将每个样品的溶液在具有直径为4mm的活动区域的单独的金涂覆的聚碳酸酯滤膜(孔径0.8μm)上过滤。将空的小瓶用2×2mL无颗粒水冲洗，并用1×2mL无颗粒水冲洗塞子。为了确保将所有颗粒转移到过滤器中，过滤设备内的漏斗用8mL无颗粒水冲洗。通过视频显微镜拍摄观察到的颗粒的照片。应用不同的光谱方法进一步分析一部分最大的颗粒(>50μm)。通过使用由rap.ID颗粒SystemsGmbH制造的单颗粒探测器(Single Particle Explorer,SPE)的图像分析手动进行拉曼光谱研究。该装置以532nm的激光波长运行。对于FT-IR和/或ATR光谱，使用由Bruker制造的FT-IR光谱仪LUMOS(序列号190)。通过由Bruker制造的扫描电子显微镜SEM-EDX(TM 3000)进一步研究分析的颗粒之一。
过滤-显微术：使用孔径为0.45μm的硝酸纤维素滤器从每批5瓶中分离颗粒。通过光学显微术分析所获得的颗粒。通过红外光谱术使用IR显微镜Hyperion 2000以15倍放大倍率进一步表征颗粒。
亚可见颗粒的测量：
1.光学粒子计数器：使用光学粒子计数器(HIAC，Hach)来测量蛋白质制剂中的亚可见颗粒的量。如药典(USP,Ph.Eur.)所要求的，研究了大于10μm和25μm的颗粒。通过光电检测器进行了颗粒的检测，该光电检测器检测由视体积中的颗粒引起的照明的光学干扰。
2.流式成像显微术：流式成像显微术(微流式成像(MFI)，蛋白样品))用于测量蛋白质制剂中的亚可见颗粒的量。如药典(USP,Ph.Eur.)所要求的，研究了大于10μm和25μm的颗粒。通过数码相机检测颗粒。
3.SEC：使用大小排阻色谱(SEC)测量纳米尺寸范围内的可溶性聚集体的相对量。此外，报道了单体的纯度或相对量。
4.DLS：使用动态光散射(DLS)(Zetasizer Nano-ZS，Malvern)测量纳米尺寸范围内的聚集体和颗粒的存在。测量流体动力学直径和多分散性。
C)结果与讨论:
过滤实验：
要理解星尘颗粒现象，我们尝试了从SAR113244药物产品(DP溶液)分离颗粒。悬浮液中颗粒的分离可以通过过滤或通过用移液器或抹刀(spatula)尝试取出颗粒来实现。然而，星尘颗粒的表征是非常具有挑战性的，因为它们无法被分离。在纤维素滤器上的过滤不分离星尘颗粒(参见表2和图1-3)。虽然过滤三个安慰剂溶液不导致过滤器上的任何颗粒，但来自Nalgene瓶的DP溶液显示出显著量的闪光颗粒(图4和5)。尽管滤器上的颗粒的绝对数量看起来低于“星尘”影响的样品，但外形和尺寸与之前分离的颗粒没有显著差异。因此，真空过滤以分离“星尘”颗粒的方法的有效性必须受到质疑，因为来自Nalgene瓶的DP溶液没有显示任何星尘颗粒。SAR113244的药物物质也在滤器上显示出颗粒(图6)，即使药物物质是无星尘颗粒的：药物物质存储在塑料袋中仅在柠檬酸盐缓冲液(来自第1阶段过程的旧药物物质)中，且当进行目测时不显示颗粒，但在过滤后，可在滤器上看到颗粒。
来自不同的基于蛋白质的治疗剂(SAR252067和SAR341403)的样品再次显示出滤器上颗粒的存在(图7-12)，尽管溶液已经澄清(无星尘颗粒)。这些发现显示，高度浓缩的抗体溶液的真空过滤具有溶液成分沉淀在滤器上的风险，并使得鉴定溶液中存在的可能的亚可见或可见颗粒成为不可能的。
表2.滤纸上的颗粒的存在
样品 蛋白制剂中星尘颗粒的存在 过滤后纤维素滤器上颗粒的存在
SAR113244 是 是
SAR252067 否 是
SAR341403 否 是
安慰剂溶液I 否 否
安慰剂溶液II 否 否
安慰剂溶液III 否 否
通过DLS测量：
通过动态光散射测量的蛋白质聚集体的测量结果确实显示DP溶液储存于塑料瓶没有星尘颗粒(图13)，具有比储存在玻璃小瓶中的含星尘的DP溶液更低的多分散指数(图14)。这可为SAR113244分子中的构象变化可能是星尘颗粒形成的潜在原因的指示。除了目测之外，这个结果指示玻璃容器在星尘形成中具有作用。
分层研究：
星尘颗粒形成的一个可能的原因是由玻璃小瓶发生的分层。因此，进行了分层研究。用含有10mM柠檬酸盐缓冲液，2g/L NaCl，10g/L精氨酸-HCl，45g/L(4.5％)蔗糖和0.01％聚山梨醇酯20的安慰剂溶液进行分层研究。将安慰剂溶液储存在表3中概述的不同种类的玻璃小瓶中。
表3.用于分层研究的主要包装
Figure BDA0001984263040000341
在加速条件(60℃)下在1、4或12周后没有发现分层(参见表4A和4B)。
表4A.
Figure BDA0001984263040000342
表4B.玻璃腐蚀(玻璃侵蚀)和分层的概述
Figure BDA0001984263040000351
a确认的分层：锋利边缘或分层区域(SEM)；b早期指标：内表面的反应区(SEM)，通过目测观察到的着色不小于“弱”(SM)，Si/B浓度比率低于或等于5且Si浓度(ICP)高于10mg/mL(1mL多至2mL填充体积)；d其他：浅坑，浅丘，小孔，沉积物(SEM)，目测观察到的弱到中等散射(SM)，局部反应区(水平尺寸低于20μM)(SEM)。
然而，在长期储存(12周，60℃)在溶液中检测到玻璃组分(Al，Si，B，Ca)的浓度增加(参见表5)。
表5.在加速条件下溶解的玻璃元素的浓度(ICP分析)
Figure BDA0001984263040000361
基于这些观察结果，很可能的是玻璃组分(Al，Si，B，Ca)引发颗粒形成，因为当比较
Figure BDA0001984263040000362
瓶中的制剂相比小瓶中的mAb制剂时，这是观察到的仅有的差异。安慰剂研究显示没有分层，但是某些成分的沥取，也可以用于具有蛋白质的DP溶液。而且，这项研究确定了星尘颗粒不在没有蛋白质的情况下发生。
RapID-研究：这项研究的目的是确定星尘颗粒由何组成。以前的过滤研究不成功，是因为不可能在滤器上分离颗粒。RapID提供了具有金滤器的解决方案。在此，将DP溶液在金滤器上过滤，然后使用FT-IR(图15)和拉曼光谱术(图16)进行分析。结果显示，在5个小瓶中的3个中检测到蛋白质颗粒。在其他小瓶中，已经检测到聚乙烯(图17和18)。包含聚乙烯的样品最可能还含有作为典型吸收峰的蛋白质，因为3000cm-1以上的蛋白也见于FT-IR分析中(图17)。必须说明样品很旧(4年-保质期＝3年)。因此，需要对刚刚检测到星尘颗粒的样品进行其他研究。然而，据信蛋白质聚集至少部分地是星尘颗粒制剂的成因。因此，经设计以避免蛋白质聚集的新抗体制剂被认为能够避免星尘颗粒制剂。
此外，虽然在特定的抗CXCR5抗体的语境中发现和描述了星尘颗粒，但据信其他抗体可能表现出类似的储存问题，并因此能够潜在地从本文所述的所提出的抗体制剂中受益。
实施例2：无星尘颗粒制剂的开发
a)导言：
为了避免星尘颗粒的形成，必须开发新的制剂。在此过程中，化学稳定性和亚可见颗粒的不存在同样重要。
B)方法与结果：
为了获得不容易在长时间内聚集的稳固制剂，对各种实验样品进行机械应力研究。使用磁力搅拌器对样品施加应力，并在加速条件下在过滤和储存后测试样品关于星尘颗粒的形成(目测)。通过机械应力研究，可显示增加浓度的聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80减少抗体制剂中的颗粒的量。基于这些结果进行了稳定性研究，其中在玻璃小瓶和预填充的注射器中测试高达175mg/mL的高度浓缩的SAR113244制剂。当聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80浓度为0.1％时，对于任何SAR113244浓度都没有观察到星尘颗粒。即使在加速条件下(6个月，40℃)，不存在可见颗粒。因此，含有100-175mg/mL的高度浓缩的制剂具有稳定性，而不形成星尘颗粒。当制剂含有约100-175mg/mL SAR113244，约200mM精氨酸，约4.5-9％蔗糖，约0.1％聚山梨醇酯20或约0.1％聚山梨醇酯80和约10mM柠檬酸盐缓冲液时，实现了化学稳定性。
机械应力研究：首先将药物(SAR113244)添加至混合容器中随后加入赋形剂(见上表1)，来制备实验制剂。混合赋形剂后，将溶液过滤并添加至玻璃小瓶中。最后，目测检查最终配方。
如上所述对小瓶进行机械应力研究。结果示于图19和图20中。通过机械应力研究，显示在储存过程中即使在过滤后也有颗粒形成。然而，通过增加聚山梨醇酯浓度可减少甚至终止此可见颗粒形成过程。基于这些结果，推测可通过增加聚山梨醇酯浓度来得到无星尘颗粒制剂。而且，可以使用聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80来得到无星尘颗粒制剂。
稳定性研究：在含蛋白质的药物制剂中纳入表面活性剂是众所周知的，常见的表面活性剂是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80。氨基酸如精氨酸和甲硫氨酸用作稳定剂也是已知的。然而，本发明人观察到，对于SAR113244抗体，仅当主要包装材料由玻璃组成时，储存(12个月)后才发生颗粒形成。为了鉴定SAR113244的稳定制剂，制备了抗体的药物相关制剂，其聚山梨醇酯的浓度高于0.01％，氨基酸的浓度高于50mM(参见下表6)。将这些制剂储存在玻璃小瓶或玻璃注射器中，并在加速条件(40℃)下进行稳定性研究，并测量颗粒形成(参见表7)。
稳定性研究的结果显示，即使聚山梨醇酯含量为0.01％，大量的精氨酸(200mM)也能产生稳定6个月的、无星尘颗粒的制剂。理想的是得到甚至更高浓度的单克隆抗体并且得到长时间稳定的制剂。较早的结果显示，制剂中高浓度的精氨酸(表5)和大量的聚山梨醇酯(图19和20)是有益的。考虑了这些观察结果，并且使用大量的精氨酸和聚山梨醇酯进行了新的稳定性研究。
表6.测试6个月的制剂的组合物
Figure BDA0001984263040000381
将表6的样品在2R ISO小瓶中于不同温度(5℃，25℃，40℃和-20℃)储存2周(T0.5)，1个月(T1)，3个月(T3)和6个月(T6)，以使用实施例1中所述的方法确定其稳定性。还在第0天(T0)测量了对照组样品。结果示于表7。
表7.制剂124A-D在加速条件下的稳定性结果
Figure BDA0001984263040000382
Figure BDA0001984263040000391
Figure BDA0001984263040000401
在随后的测试中，制备基于具有甚至更高单克隆抗体浓度的制剂124D的新制剂，并如上所述测试其稳定性。此外，由于与表5相关的结果，还测试了增加的聚山梨醇酯浓度。新制剂描述在下表8中，其中制剂A和B储存在2R ISO小瓶中，制剂C和D储存在预填充的注射器(1mL Hypak BD)中。
表8.测试稳定性6个月的制剂的组合物
Figure BDA0001984263040000402
测试表8的制剂的稳定性，结果示于表9中。表9.制剂133A-D在加速条件下的稳定性
Figure BDA0001984263040000411
Figure BDA0001984263040000421
基于稳定性研究的结果，显示得到了高抗体浓度的制剂，无星尘颗粒的制备物。实际上，多至175mg/mL的抗体浓度在加速条件(40℃)下6个月是稳定的(参见例如制剂B)。当使用预填充的注射器作为主要包装材料时检测到的颗粒的量与2R ISO小瓶相比略有升高，但仍然远低于监管部门的接受标准。用具有如此高浓度的易于聚集的蛋白质的实验制剂在测试的加速条件下(40℃，6个月)实现几乎没有亚可见颗粒，是绝对预料不到的并且是建立高度稳定的高浓度抗体制剂方面的巨大突破。实际上，这种高抗体浓度制剂可允许使用自动注射器来投予抗体制剂。此外，这种抗体制剂对于以高浓度在玻璃容器中储存延长的时间的抗体能达到甚至更长的保质期。
已经详细并通过参考其具体实施方案描述了本发明，显而易见的是，在不背离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可进行修改和变化。更具体而言，尽管本发明的一些方面在本文中被认为是特别有利的，但是预期本发明不一定限制于本发明的这些具体方面。在可供选择的实施方案中，本文公开的百分比可从本文公开的值变化±10、20或30％的量。
序列表
Figure BDA0001984263040000431
Figure BDA0001984263040000441
Figure BDA0001984263040000451
Figure BDA0001984263040000461
Figure BDA0001984263040000471
Figure BDA0001984263040000481
Figure BDA0001984263040000491
Figure BDA0001984263040000501
Figure BDA0001984263040000511
序列表
<110> 赛诺菲(SANOFI)
<120> 抗体制剂
<130> US2016/011 US PCT; 15-2048-WO
<150> US 62/358,404
<151> 2016-07-05
<150> EP 16306090.8
<151> 2016-07-30
<160> 69
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 36
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Asn Tyr Pro Thr Leu Glu Met Asp Leu Glu Asn Leu Glu Asp Leu
1 5 10 15
Phe Trp Glu Leu Asp Arg Leu Asp Asn Tyr Asn Thr Ser Leu Val Glu
20 25 30
Asn His Leu Cys
35
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n是a, c, g,或 t
<400> 2
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tc 32
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n是a, c, g,或 t
<400> 3
cttccggaat tcsargtnma gctgsagsag tcwgg 35
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 4
ggaggatcca tagacagatg ggggtgtcgt tttggc 36
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 5
ggagctcgay attgtgmtsa cmcarwctmc a 31
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 6
tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 7
ccaagctgtg tcctrtcc 18
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 8
cgacaagtcg actagccctt gaccaggcat cc 32
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 9
wtctctrgag tcagtggg 18
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成引物
<400> 10
cgactagtcg actggtggga agatggatac ag 32
<210> 11
<211> 112
<212> PRT
<213> 鼠属物种(Mus sp.)
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Thr Pro Arg
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> 鼠属物种(Mus sp.)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
85 90 95
His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 16
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Glu
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 17
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 17
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val
20 25 30
Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
35 40 45
Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 18
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 18
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagcgaca tcgtgatgac ccagagcgcc ctcagcgtgg ccgtgacccc cggcgagagc 120
gtgagcatca gctgccgcag cagcaagagc ctgctgcaca gcagcggcaa gacctacctg 180
tactggttcc tgcagcgccc cggccagagc ccccagctgc tgatctaccg catgagcaac 240
ctggccagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccgc cttcaccctg 300
aagatcagcc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgcatgca gcacctggag 360
tacccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggccgctcct 420
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 480
tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 540
ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 600
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 660
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 720
tgctgaagct t 731
<210> 19
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 19
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val
20 25 30
Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
35 40 45
Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 20
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 20
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagcgaca tcgtgatgac ccagagcgcc ctcagcgtgg ccgtgacccc cggcgagagc 120
gtgagcatca gctgccgcag cagcaagagc ctgctgcaca gcagcggcaa gacctacctg 180
tactggttcc tgcagcgccc cggccagagc ccccagctgc tgatctaccg cctgagcaac 240
ctggccagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccgc cttcaccctg 300
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tacccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggccgctcct 420
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 480
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ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 600
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 660
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 720
tgctgaagct t 731
<210> 21
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 21
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Ala Leu Ser Val Ala Val
20 25 30
Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
35 40 45
Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Ser Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 22
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 22
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagcgaca tcgtgatgac ccagagcgcc ctcagcgtgg ccgtgacccc cggcgagagc 120
gtgagcatca gctgccgcag cagcaagagc ctgctgcaca gcagcggcaa gacctacctg 180
tactggttcc tgcagcgccc cggccagagc ccccagctgc tgatctaccg cctgagcagc 240
ctggccagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccgc cttcaccctg 300
aagatcagcc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgcatgca gcacctggag 360
tacccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggccgctcct 420
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 480
tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 540
ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 600
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 660
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 720
tgctgaagct t 731
<210> 23
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 23
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Glu Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ile Asp Tyr Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
130 135 140
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
210 215 220
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450 455
<210> 24
<211> 1385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 24
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagccagg tgcagctgca ggagagcggc cccggcctgg tggcccccag cgagagcctg 120
agcatcacct gcaccgtgag cggcttcagc ctgatcgact acggcgtgaa ctggatccgc 180
cagccccccg gcaagggcct ggagtggctg ggcgtgatct ggggcgacgg caccacctac 240
tacaacccca gcctgaagag ccgcctgagc atctccaagg acaacagcaa gagccaggtg 300
ttcctgaaga tgaacagcct gaccgccgcc gacaccgcca tgtactactg cgcccgcatc 360
gtgtactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagcg ccagcaccaa gggcccttcc 420
gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ccaccgccgc tctgggctgc 480
ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc 540
tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 600
gtggtgaccg tgccttcctc ctccctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 660
aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgg gtggagtcca agtacggccc tccttgccct 720
tcctgccctg cccctgagtt cctgggcgga cctagcgtgt tcctgttccc tcctaagcct 780
aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct gaggtgacct gtgtggtggt ggacgtgtcc 840
caggaggacc ctgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 900
aagaccaagc ctcgggagga gcagttcaat tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc 960
gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gaatacaagt gtaaggtctc caacaagggc 1020
ctgccctcct ccatcgagaa aaccatctcc aaggccaagg gccagcctag ggagcctcag 1080
gtgtacaccc tgcctcctag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1140
ctggtgaagg gcttctaccc ttccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagcct 1200
gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1260
tccaggctga ccgtggacaa gtcccggtgg caggagggca acgtcttttc ctgctccgtg 1320
atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc tctgggctga 1380
agctt 1385
<210> 25
<211> 22
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 25
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg
1 5 10 15
Ala Thr Gly Ile Pro Ala
20
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 26
Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 27
Ser Glu Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
1 5 10
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 28
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Thr Pro Arg
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Gln Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 33
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Glu
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Val Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
100 105 110
<210> 34
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 34
Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Ala Pro Leu Lys
50 55 60
Gly Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 35
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 35
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val
20 25 30
Thr Pro Arg Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
35 40 45
Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
85 90 95
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 36
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 36
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagcgaca tcgtgatgac ccaggccgcc cccagcgtgg ccgtgacccc ccgcgagagc 120
gtgagcatca gctgccgcag cagcaagagc ctgctgcaca gcagcggcaa gacctacctg 180
tactggttcc tgcagcgccc cggccagagc ccccagctgc tgatctaccg catgagcaac 240
ctggccagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccgc cttcaccctg 300
cgcatcagcc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgcatgca gcacctggag 360
tacccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggccgctcct 420
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 480
tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 540
ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 600
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 660
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 720
tgctgaagct t 731
<210> 37
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 37
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ile Asp Tyr Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Gln Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
130 135 140
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
210 215 220
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450 455
<210> 38
<211> 1385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 38
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagccagg tgcagctgaa ggagagcggc cccggcctgg tggcccccag ccagagcctg 120
agcatcacct gcaccgtgag cggcttcagc ctgatcgact acggcgtgaa ctggatccgc 180
cagccccccg gcaagggcct ggagtggctg ggcgtgatct ggggcgacgg caccacctac 240
tacaacagcg ccctgaagag ccgcctgagc atccgcaagg acaacagcca gagccaggtg 300
ttcctgaaga tgaacagcct gcagaccgac gacaccgcca tgtactactg cgcccgcatc 360
gtgtactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcgccg ccagcaccaa gggcccttcc 420
gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ccaccgccgc tctgggctgc 480
ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc 540
tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 600
gtggtgaccg tgccttcctc ctccctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 660
aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgg gtggagtcca agtacggccc tccttgccct 720
tcctgccctg cccctgagtt cctgggcgga cctagcgtgt tcctgttccc tcctaagcct 780
aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct gaggtgacct gtgtggtggt ggacgtgtcc 840
caggaggacc ctgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 900
aagaccaagc ctcgggagga gcagttcaat tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc 960
gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gaatacaagt gtaaggtctc caacaagggc 1020
ctgccctcct ccatcgagaa aaccatctcc aaggccaagg gccagcctag ggagcctcag 1080
gtgtacaccc tgcctcctag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1140
ctggtgaagg gcttctaccc ttccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagcct 1200
gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1260
tccaggctga ccgtggacaa gtcccggtgg caggagggca acgtcttttc ctgctccgtg 1320
atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc tctgggctga 1380
agctt 1385
<210> 39
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 39
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val
20 25 30
Thr Pro Gly Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
35 40 45
Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
85 90 95
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 40
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 40
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagcgaca tcgtgatgac ccaggccgcc cccagcgtgg ccgtgacccc cggcgccagc 120
gtgagcatca gctgccgcag cagcaagagc ctgctgcaca gcagcggcaa gacctacctg 180
tactggttcc tgcagcgccc cggccagagc ccccagctgc tgatctaccg catgagcaac 240
ctggccagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccgc cttcaccctg 300
cgcatcagcc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgcatgca gcacctggag 360
tacccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggccgctcct 420
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 480
tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 540
ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 600
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 660
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 720
tgctgaagct t 731
<210> 41
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 41
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val
20 25 30
Thr Pro Gly Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
35 40 45
Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Asn Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
85 90 95
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 42
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 42
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagcgaca tcgtgatgac ccaggccgcc cccagcgtgg ccgtgacccc cggcgccagc 120
gtgagcatca gctgccgcag cagcaagagc ctgctgcaca gcagcggcaa gacctacctg 180
tactggttcc tgcagcgccc cggccagagc ccccagctgc tgatctaccg cctgagcaac 240
ctggccagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccgc cttcaccctg 300
cgcatcagcc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgcatgca gcacctggag 360
tacccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggccgctcct 420
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 480
tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 540
ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 600
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 660
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 720
tgctgaagct t 731
<210> 43
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 43
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val
20 25 30
Thr Pro Gly Ala Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu
35 40 45
Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Ser Leu Ala Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr
85 90 95
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 44
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 44
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagcgaca tcgtgatgac ccaggccgcc cccagcgtgg ccgtgacccc cggcgccagc 120
gtgagcatca gctgccgcag cagcaagagc ctgctgcaca gcagcggcaa gacctacctg 180
tactggttcc tgcagcgccc cggccagagc ccccagctgc tgatctaccg cctgagcagc 240
ctggccagcg gcgtgcccga ccgcttcagc ggcagcggca gcggcaccgc cttcaccctg 300
cgcatcagcc gcgtggaggc cgaggacgtg ggcgtgtact actgcatgca gcacctggag 360
tacccctaca ccttcggcgg cggcaccaag ctggagatca agcgtacggt ggccgctcct 420
tccgtgttca tcttccctcc ctccgacgag cagctgaagt ccggcaccgc ctccgtggtg 480
tgtctgctga acaacttcta ccctcgggag gccaaggtgc agtggaaggt ggacaacgcc 540
ctgcagtccg gcaactccca ggagtccgtc accgagcagg actccaagga cagcacctac 600
tccctgtcct ccaccctgac cctgtccaag gccgactacg agaagcacaa ggtgtacgcc 660
tgtgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cctgtgacca agtccttcaa ccggggcgag 720
tgctgaagct t 731
<210> 45
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 45
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Glu Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ile Asp Tyr Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro
65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Val Thr Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
130 135 140
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
210 215 220
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450 455
<210> 46
<211> 1385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 46
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagccagg tgcagctgaa ggagagcggc cccggcctgg tggcccccag cgagagcctg 120
agcatcacct gcaccgtgag cggcttcagc ctgatcgact acggcgtgaa ctggatccgc 180
cagccccccg gcaagggcct ggagtggctg ggcgtgatct ggggcgacgg caccacctac 240
tacaacccca gcctgaagag ccgcctgagc atcagcaagg acaacagcaa gagccaggtg 300
ttcctgaagg tgaccagcct gaccaccgac gacaccgcca tgtactactg cgcccgcatc 360
gtgtactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcgccg ccagcaccaa gggcccttcc 420
gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ccaccgccgc tctgggctgc 480
ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc 540
tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 600
gtggtgaccg tgccttcctc ctccctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 660
aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgg gtggagtcca agtacggccc tccttgccct 720
tcctgccctg cccctgagtt cctgggcgga cctagcgtgt tcctgttccc tcctaagcct 780
aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct gaggtgacct gtgtggtggt ggacgtgtcc 840
caggaggacc ctgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 900
aagaccaagc ctcgggagga gcagttcaat tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc 960
gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gaatacaagt gtaaggtctc caacaagggc 1020
ctgccctcct ccatcgagaa aaccatctcc aaggccaagg gccagcctag ggagcctcag 1080
gtgtacaccc tgcctcctag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1140
ctggtgaagg gcttctaccc ttccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagcct 1200
gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1260
tccaggctga ccgtggacaa gtcccggtgg caggagggca acgtcttttc ctgctccgtg 1320
atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc tctgggctga 1380
agctt 1385
<210> 47
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 47
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ile Asp Tyr Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Ala
65 70 75 80
Pro Leu Lys Gly Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
115 120 125
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
130 135 140
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
165 170 175
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
195 200 205
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
210 215 220
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
225 230 235 240
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
275 280 285
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
290 295 300
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
305 310 315 320
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
325 330 335
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
340 345 350
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
355 360 365
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
370 375 380
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
385 390 395 400
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
405 410 415
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
420 425 430
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
435 440 445
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450 455
<210> 48
<211> 1385
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多核苷酸
<400> 48
gctagcacca tgggctggag ctgcatcatc ctgttcctgg tggccaccgc caccggcgtg 60
cacagcgagg tgcagctgaa ggagagcggc cccggcctgg tggcccccgg cggcagcctg 120
agcatcacct gcaccgtgag cggcttcagc ctgatcgact acggcgtgaa ctggatccgc 180
cagccccccg gcaagggcct ggagtggctg ggcgtgatct ggggcgacgg caccacctac 240
tacaacgccc ccctgaaggg ccgcctgagc atcagcaagg acaacagcaa gagccaggtg 300
ttcctgcaga tgaacagcct gaagaccgac gacaccgcca tgtactactg cgcccgcatc 360
gtgtactggg gccagggcac cctggtgacc gtgagcagcg ccagcaccaa gggcccttcc 420
gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc acctccgagt ccaccgccgc tctgggctgc 480
ctggtgaagg actacttccc tgagcctgtg accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc 540
tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc 600
gtggtgaccg tgccttcctc ctccctgggc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac 660
aagccttcca acaccaaggt ggacaagcgg gtggagtcca agtacggccc tccttgccct 720
tcctgccctg cccctgagtt cctgggcgga cctagcgtgt tcctgttccc tcctaagcct 780
aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct gaggtgacct gtgtggtggt ggacgtgtcc 840
caggaggacc ctgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 900
aagaccaagc ctcgggagga gcagttcaat tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc 960
gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gaatacaagt gtaaggtctc caacaagggc 1020
ctgccctcct ccatcgagaa aaccatctcc aaggccaagg gccagcctag ggagcctcag 1080
gtgtacaccc tgcctcctag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt 1140
ctggtgaagg gcttctaccc ttccgacatc gccgtggagt gggagtccaa cggccagcct 1200
gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg ctggactccg acggctcctt cttcctgtac 1260
tccaggctga ccgtggacaa gtcccggtgg caggagggca acgtcttttc ctgctccgtg 1320
atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagtccc tgtccctgtc tctgggctga 1380
agctt 1385
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 49
Glu Leu Leu Gly Gly
1 5
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 50
Met Ile Ser Arg Thr
1 5
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成的6x His标签
<400> 51
His His His His His His
1 5
<210> 52
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 52
Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 53
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成肽
<400> 54
Ser Leu Ile Asp Tyr Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly
1 5 10 15
<210> 55
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 55
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ala Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln His Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Gly Val Gln Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85 90 95
Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 56
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
100 105 110
Lys
<210> 57
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述：合成多肽
<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ile Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
100 105 110
Lys
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 58
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 59
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 60
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 61
Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr Gly Val Asn
1 5 10
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 62
Val Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Tyr
1 5
<210> 63
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 63
Ile Val Tyr
1
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
Arg Leu Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 65
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 65
Arg Leu Ser Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 66
Arg Met Ser Asn Leu Ala
1 5
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 67
Arg Leu Ser Asn Leu Ala
1 5
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 68
Arg Leu Ser Ser Leu Ala
1 5
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 69
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
Trp

Claims (18)

1.一种适于对患者皮下施用的抗体制剂，该制剂包含：
a) 约100至约175 mg/mL的抗体；
b) 约10 mM柠檬酸盐缓冲剂；
c) 约0.1% (w/v)聚山梨醇酯；
d) 约200 mM精氨酸；和
e) 约4.5至9%蔗糖，
其中所述制剂的pH是约pH 6，其中所述抗体是完全人抗CXCR5抗体，而且其中所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体制剂，其中所述抗体包含单链Fv。
3.如权利要求1所述的抗体制剂，其中所述抗体是特异性结合至人CXCR5的胞外结构域的分离抗体或其片段。
4.如权利要求3所述的抗体制剂，其中所述分离抗体或其片段包含RSSKSLLHSSGKTYLY(SEQ ID NO: 58)、RLSSLA (SEQ ID NO: 68)、MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60)、GFSLIDYGVN(SEQ ID NO: 61)、VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62)、和IVY (SEQ ID NO: 63)的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗体制剂，其中所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
6.一种抗体制剂，其包含：
a) 约175 mg/mL的人源化IgG4抗CXCR5抗体；
b) 约10 mM柠檬酸盐缓冲剂；
c) 约1.0 mg/mL聚山梨醇酯80；
d) 约200 mM精氨酸HCl；和
e) 约45 mg/mL蔗糖，
其中所述制剂的pH是约pH 6，其中所述人源化IgG4 抗CXCR5抗体包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列且所述轻链包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列。
7.一种容器，其包含如权利要求1-6任一项所述的抗体制剂。
8.如权利要求7所述的容器，其中所述容器是预填的注射器、小瓶或自动注射器。
9.一种容器，其包含冻干形式的如权利要求1-6任一项所述的抗体制剂。
10.一种试剂盒，其包含如权利要求7或8所述的容器和用于施用和使用所述抗体制剂的标签或说明。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述施用通过注射进行。
12.权利要求1-6任一项所述的抗体制剂在制备用于治疗有需要的受试者中的CXCR5介导的疾病的药物中的用途。
13.如权利要求12所述的用途，其中所述CXCR5介导的疾病包括炎性疾病。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述炎性疾病包括类风湿性关节炎。
15.如权利要求1-6中任一项所述的抗体制剂在制备用于诊断有需要的受试者中CXCR5介导的疾病的药物中的用途。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述CXCR5介导的疾病为炎性疾病。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述炎性疾病包括类风湿性关节炎。
18.如权利要求1-6任一项所述的抗体制剂的冻干形式。
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