CN109652595A - 一种基于raa荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒 - Google Patents

一种基于raa荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN109652595A
CN109652595A CN201910029711.4A CN201910029711A CN109652595A CN 109652595 A CN109652595 A CN 109652595A CN 201910029711 A CN201910029711 A CN 201910029711A CN 109652595 A CN109652595 A CN 109652595A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
respiratory tract
probe
reaction
raa
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201910029711.4A
Other languages
English (en)
Inventor
郑伟
王刚
吕沁风
杨天赐
王玲
吴忠华
郭利川
汤赛君
王智宏
应清界
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd
Zhejiang International Travel Health Care Center (port Outpatient Department Of Zhejiang Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau)
Original Assignee
Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd
Zhejiang International Travel Health Care Center (port Outpatient Department Of Zhejiang Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd, Zhejiang International Travel Health Care Center (port Outpatient Department Of Zhejiang Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau) filed Critical Jiangsu Qitian Gene Biological Science & Technology Co Ltd
Priority to CN201910029711.4A priority Critical patent/CN109652595A/zh
Publication of CN109652595A publication Critical patent/CN109652595A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种基于RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒，所述引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出呼吸道腺病毒，特异性能够达到100%，所述检测试剂盒能够方便快速且准确地鉴定呼吸道腺病毒，操作方便，检测时间短，15 min内可以完成检测，无需像PCR一样通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50~60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在30~42℃下进行等温扩增即可完成检测。也无需像LAMP技术一样使用4‑6条引物在65℃情况下进行扩增且容易产生假阳性。

Description

一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检 测试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒。
背景技术
腺病毒是儿童急性呼吸道感染中最常见的病毒病原之一。该病毒可通过人、水、媒介物和器械传播，室温条件下，在污物中存在周期可延长至3周。腺病毒在儿童和军营人员中更易发生感染和大规模流行，大多数婴幼儿在出生后的5年内至少感染过1种腺病毒株。脂类消毒剂无效，对热、甲醛、氯敏感。腺病毒感染分布全球，全年均可发生。腺病毒可以感染呼吸道、肠道、眼睛、膀胱以及肝脏等，并在人群中造成流行疾病的传播。腺病毒侵入宿主细胞后至少能引起3种感染：慢性、潜伏性感染：常在淋巴细胞内发生，潜伏感染时外放的病毒量极少,细胞坏死也不明显，故临床上感染不明显，潜伏感染的机制尚不清楚。溶解性感染：病毒在细胞内如人类上皮细胞中经历复制过程，通过溶解细胞作用使细胞死亡。肿瘤样变异：此时病毒繁殖只进行最初几步，然后腺病毒DNA与细胞DNA整合并复制，但不产生感染性病毒，腺病毒抗原性较稳定。
腺病毒(Adenovirus，ADV)是无囊膜的线性双股DNA病毒，根据宿主范围不同，分为哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。人腺病毒(Human adenovirus，HAdV)，根据免疫学、生物学、生物化学特性不同，将其分为A-G7个亚种，共有52个血清型，不同的血清型有不同的器官亲和性并引起相应的临床表现，与呼吸道有关的是B、C和E组。其中3型和7型是引起儿童呼吸道腺病毒感染最常见的型别。人类腺病毒是一种没有包膜的直径为70-100nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm，其中六邻体240个，五邻体12个。六邻体带有主要的属和亚属抗原决定簇和次要的种抗原决定簇，而五邻体带有主要的种抗原决定簇和次要的亚属抗原决定簇。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。依据DNA同源性的不同人类腺病毒的49个型分为7个亚属A-G(其中G尚有不同看法)。
目前诊断呼吸道腺病毒的实验室检测方法主要包括病毒分离培养法检测、血清学诊断、血清抗体检测及分子生物学方法检测。
病毒分离通常是腺病毒感染检测的金标准，方法是将临床标本接种于敏感细胞，如肺癌A549、Hela、Hep-2等细胞，通过观察细胞病变，可以观察期致病性，同时还可以使病毒增值。由于细胞培养所检测出的病毒是具有感染性的病毒，所以可在一定程度上确定为引起呼吸道感染的病原体。但是由于细胞病变一般2-7天出现，因此该方法周期较长，且比较繁琐。
免疫荧光技术不仅可用于细胞培养中病毒的鉴定，也可用于临床标本中病毒抗原的检测，具有快速简便、特异性高的特点，但是其敏感性较低。
分子生物学方法如实时荧光PCR具有灵敏度，特性好，但需要专业技术人员和复杂的仪器和完备的实验室，时间周期也需要1.5-2小时；逆转录环介导等温扩增法(LAMP)具有等温60-65℃，具有很好的特异性，但假阳性率较高，引物设计复杂。
重组酶介导的等温核酸扩增技术(简称为RAA技术)是一种利用重组酶代替PCR高温变性，完成对双链的解链，解开的双链被单链结合蛋白结合，防止DNA链复性。再由聚合酶完成链的延伸，以DNA为模板合成目的产物，反应在30-42℃条件下进行5-20分钟完成扩增。
发明内容
本发明的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种基于RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的引物。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种基于RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为：CAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGC；所述下游引物序列为：TGCGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGC。
本发明的第二个目的在于，针对现有技术的不足，提供一种基于RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的探针。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种基于RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的探针，其特征在于，所述探针的序列为：AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAGTCATTCAACGACTAYCTATC。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：
优选地，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基CA，其中的碱基A用四氢呋喃残基替换。
优选地，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，优选为FAM或HEX。
优选地，所述荧光淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL，优选为BHQ1或BHQ2。
优选地，修饰后的探针优选为：AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAG(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)TCAACGACTAYCTATC。
本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种基于RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的检测试剂盒。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种基于RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：引物、如前文所述的探针、RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为：CAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGC；所述下游引物序列为：TGCGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGC。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：
优选地，所述上游引物和下游引物的浓度分别优选为0.01～0.1mM，更优选为0.05mM。
优选地，所述探针的浓度优选为0.02～0.07mM，更优选为0.03mM。
优选地，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为300mM的Tris-HCl缓冲液(PH＝8.0)、浓度为280mM的MgAc和质量分数为20％的PEG 20000。
优选地，所述阳性质控品中含有呼吸道腺病毒的基因组DNA；所述呼吸道腺病毒的基因组DNA的浓度为1×104Copies/ul。
优选地，所述阴性质控品为ddH2O或纯化水。
本发明提供一种基于RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒，所述引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出呼吸道腺病毒，特异性能够达到100％，所述检测试剂盒能够方便快速且准确地鉴定呼吸道腺病毒，操作方便，检测时间短，15min内可以完成检测，无需像PCR一样通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。也无需像LAMP技术一样使用4-6条引物在65℃情况下进行扩增且容易产生假阳性。
检测试剂盒所用的检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，研究表明本发明提供的基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的试剂盒，检测呼吸道腺病毒时与其他呼吸道病毒如人偏肺病毒(MPV)、人博卡病毒(BOV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人鼻病毒、甲流病毒、乙流病毒无交叉反应，具有特异性强，特异性达100％。灵敏度高，每反应检测灵敏度达到为10Copies。
本发明提供的基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。
附图说明
图1为不同引物组合质粒DNA检测结果。
图2为不同浓度质粒DNA灵敏度检测结果。
图3为与常规荧光定量PCR的比较试验结果。
图4为呼吸道腺病毒质粒DNA重复性检测结果。
图5为呼吸道腺病毒的特异性检测结果。
图6为呼吸道腺病毒样本DNA检测结果。
具体实施方式
参照附图和具体实施例对本发明作进一步地详细地描述。
本发明提供了一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒，其实现方法有以下几个步骤：
1)选择正确的呼吸道腺病毒保守序列进行引物探针设计；
2)选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团；
3)合成引物探针；
4)合成阳性质粒；
5)制备阳性质粒标准品；
6)筛选灵敏度高的引物探针；
7)用筛选出来的引物探针进行RAA荧光检测实验；
8)提取呼吸道腺病毒样本DNA进行验证；
根据基因名称呼吸道腺病毒在Genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用DNASTAR软件进行同源性分析和b1ast序列分析，筛出呼吸道腺病毒高度保守序列如下：CCTTGGTAACGACCTACGGGTAGATGGCGCCAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGCTACCTTTTTCCCCATGGCTCACAACACCGCTTCCACCCTTGAAGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAGTCATTCAACGACTACCTATCTGCAGCTAACATGCTCTATCCCATTCCTGCCAATGCAACCAATATTCCCATTTCCATTCCTTCTCGCAACTGGGCGGCTTTCAGAGGCTGGTCATTTACCAGACTCAAAACCAAAGAAACTCCCTCTTTGGGGTCTGGATTTGACCCCTACTTTGTCTATTCTGGTTCTATTCCCTACCTGGATGGTACCTTCTACCTGAACCACACTT；以高度保守序列作为检测目的基因，合成阳性质粒并进行引物探针设计；
引物设计包括上游引物和下游引物，设计上游引物为：CAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGC；下游引物为：TGCGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGC。
根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小365bp；
1、引物探针设计
采用RAA技术引物及探针设计原则进行的设计，通过筛选和评价，确定上游引物：
5’-CAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGC-3’
下游引物：
5’-TGCGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGC-3’
探针序列为：
5’-AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAGTCATTCAACGACTAYCTATC-3’
2、选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团
根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的RAA-F1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为FAM荧光，因此荧光修改基团选为FAM，荧光淬灭基团选为BHQ1；
也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光修饰基团选择为HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；荧光淬灭基团选择TAMRA、Eclipse、BHQ2、BHQ3或DABCYL；
但优选荧光修饰基团为FAM、HEX，优选荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2。
3、所述探针的修饰方法优选包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基CA，其中碱基A用四氢呋喃残基替换；经过修饰的探针为：AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAG(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)TCAACGACTAYCTATC；
4、引物探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。
5、质粒阳性标准品制备
重组质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备成1.0×101copies/ul-1.0×1010Copies/ul备用。
6、组成试剂盒
基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的试剂盒，包括RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品，引物和探针；
上游引物和下游引物的浓度独立优选为0.01～0.05mM，更优选为0.03mM。
探针的浓度优选为0.01～0.05mM，更优选为0.02mM。
试剂盒中包括RAA荧光通用反应试剂，RAA荧光通用反应试剂优选为经过低温冷冻干燥的冻干粉。本发明实施例中RAA荧光通用反应试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为F00001，反应规格为50ul，使用前用反应缓冲液进行重溶。
重溶RAA反应缓冲液优选包括以下含量的组分：浓度为300mM的Tris-HCl(PH＝8.0)缓冲液、浓度为280mM的MgAc和质量分数为20％的PEG 20000。本发明中，Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 20000的浓度均为终浓度。本发明对所述Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 20000的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明实施例中所述Tris-HCl、和PEG20000的购自Sigma-Aldrich，MgAc购自国药沪试。
试剂盒包括阳性质控品。所述阳性质控品中优选含有呼吸道腺病毒的基因组DNA。所述呼吸道腺病毒的基因组DNA的浓度优选为1×104Copies/ul。本发明实施例中所述阳性质控品通过重组质粒转接大肠杆菌培养并提取。
试剂盒包括阴性质控品。阴性质控品优选为ddH2O或纯化水。
在本发明中，上述方案所述的RAA荧光法检测呼吸道腺病毒的试剂盒的使用方法，优选包括如下步骤：
(1)提取待测样品(呼吸道腺病毒)的DNA，提取方法可以采用市售商品化的病毒核酸提取试剂，按说明书进行操作。本发明中采用西安天隆的核酸自动提取仪，选用西安天隆的配套病毒DNA核酸提取试剂进行DNA的提取；提取得到的DNA-20℃保存备用；待测样本由浙江国际旅行保健中心提供。
(2)将检测仪器RAA-F1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置为39℃，反应时间：20min。
(3)在42.5μL反应缓冲液中加入1μL探针和1μL引物，充分混合后添加到RAA荧光通用反应试剂中混合；得到反应预混液；
(4)将5μL所述步骤(1)中得到的DNA提取液与所述步骤(3)中得到的反应混合液充分混合，得到的反应体系进行放入检测仪器RAA-F1620进行检测荧光信号；
(5)根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值K≥20时，判定为阳性。斜率值K＜20时判定为阴性。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：引物筛选实验
上游引物：
F1：5’-CAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGC-3’；
F2：5’-GCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGCTA-3’；
F3：5’-CATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGCTAC-3’；
下游引物：
R1：5’-TGCGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGC-3’；
R2：5’-CGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGCAT-3’；
R3：5’-GAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGCATT-3’；
探针序列为：
AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAGTCATTCAACGACTAYCTATC
采用荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ1)修饰探针；
修饰后的探针为
AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAG(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)TCAACGACTAYCTATC；
试剂盒组成如表1所示，表1为试剂盒成分表：
表1
制备好的重组质粒工作标准品，分别为：
工作标准品1，含有0.2×103Copies/ul呼吸道腺病毒质粒非传染性DNA片段。
引物筛选实验的实施方法为：
(1)反应缓冲液的配制
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取430μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5ml PE管，再加入20μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mM，引物的浓度为0.03mM)，再加入50μL工作标准品，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(2)RAA荧光反应试剂重溶
准备9个RAA荧光基础反应试剂，吸取步骤1中混匀的反应缓冲液50μL分别加入到准备好的9个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系。
(3)反应
在以上9个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图1所示。结果显示引物对F1/R1扩增效果最好，表明为本发明的最佳引物。
实施例2：灵敏度实验
上游引物：
5’-CAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGC-3’
下游引物：
5’-TGCGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGC-3’
探针序列为：
AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAGTCATTCAACGACTAYCTATC
采用荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ1)修饰探针；
修饰后的探针为：
AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAG(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)TCAACGACTAYCTATC；
试剂盒组成如表1所示。
制备好的重组质粒工作标准品，分别为：
工作标准品1，含有0.2×106Copies/ul呼吸道腺病毒质粒非传染性DNA片段。
工作标准品2，含有0.2×105Copies/ul呼吸道腺病毒质粒非传染性DNA片段。
工作标准品3，含有0.2×104Copies/ul呼吸道腺病毒质粒非传染性DNA片段。
工作标准品4，含有0.2×103Copies/ul呼吸道腺病毒质粒非传染性DNA片段。
工作标准品5，含有0.2×102Copies/ul呼吸道腺病毒质粒非传染性DNA片段。
工作标准品6，含有0.2×101Copies/ul呼吸道腺病毒质粒非传染性DNA片段。
灵敏度实验实施方法：
(1)反应缓冲液的配制
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取301μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5ml PE管，再加入16μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mM，引物的浓度为0.03mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(2)RAA荧光反应试剂重溶
准备7个RAA荧光基础反应试剂，吸取步骤1中混匀的反应缓冲液45μL分别加入到准备好的7个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为RAA反应体系。
(3)加样反应
在以上7个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、5μL标准工作品6、5μL标准工作品5、5μL标准工作品4、5μL标准工作品3、5μL标准工作品2、5μL标准工作品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。
将反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图2所示。结果显示最快5分钟明显有扩增，15分钟内所有标准工作品均有扩增，每个反应管灵敏度可以达到1.0×101Copies，即在每个反应管中存在10Copies，就可以在15分钟内检测出来，表明本发明灵敏度高。
(4)常规荧光定量PCR比较试验
以上海之江呼吸道腺病毒核酸检测试剂盒为比较试剂盒，根据试剂盒说明书配置反应体系(19μL反应液、1μL酶液、)，在反应体系中分别加入5μL阴性质控品、5μL标准工作品6、5μL标准工作品5、5μL标准工作品4、5μL标准工作品3、5μL标准工作品2为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为25μL。
将反应管放入ABI Vii7荧光PCR仪中，设定反应条件为45℃-10min、95℃-15min；再按95℃-15sec→60℃-60sec循环40次。检测结果如图3所示。结果显示上海之江呼吸道腺病毒核酸检测试剂盒灵敏度下限为1.0×102Copies，而本发明灵敏度可以达到1.0×101Copies，表明本发明的灵敏度高于传统荧光PCR检测方法。
实施例3：重复性实验
引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。
试剂盒组成如表1所示。
重复性实验的实施方法为：
(1)反应缓冲液配制：
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取173μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5ml PE管，再加入8μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol/，引物的浓度为0.03mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(2)RAA荧光基础反应试剂重溶
准备4个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的4个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为RAA反应体系，并做好标记。
(3)加样反应
在以上4个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、其他3个反应管中分别加入5μL呼吸道腺病毒质粒DNA；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。
将混匀的4个反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图4所示。结果显示扩增反应重复性好。
实施例4：特异性实验
引物探针及阳性质控品序列与实施例2相同。
试剂盒组成如表1所示。
特异性实验的实施方法为：
特异性实验中呼吸道腺病毒(AD)、人偏肺病毒(MPV)、人博卡病毒(BOV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲流病毒、乙流病毒、人鼻病毒样本样本来源：其中呼吸道合胞病毒(RSV)RNA、呼吸道腺病毒(AD)DNA由中国疾病预防控制中心病毒病预防所提供，人偏肺病毒(MPV)、人博卡病毒(BOV)、甲流病毒、乙流病毒、人鼻病毒样本由浙江国际旅行保健中心提供，并通过西安天隆全自动核酸提取仪及配套试剂盒提取病毒DNA，-80℃保存备用。
实施方法：
(1)反应缓冲液的配制
样本DNA反应缓冲液配制：从试剂盒中反应缓冲液管里吸取370μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5ml PE管，再加入18μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mM，引物的浓度为0.03mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(2)RAA荧光基础反应试剂重溶
准备8个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的8个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。
(3)加样反应
在以上8个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、5μL呼吸道腺病毒(AD)DNA、5μL人偏肺病毒(MPV)RNA、5μL人博卡病毒(BOV)RNA、5μL呼吸道合胞病毒(RSV)RNA、5μL甲流病毒RNA、5μL乙流病毒RNA、5μL人鼻病毒RNA；每加好一个样就盖好管子盖子，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。
(4)检测
将混匀的8个反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如附图5所示。结果显示只有呼吸道腺病毒(AD)样本DNA有扩增，为阳性，其他样本如人偏肺病毒(MPV)、人博卡病毒(BOV)、人鼻病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲流病毒、乙流病毒样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。表明本发明提供的检测方法特异性强。
实施例5：样本实验
引物探针及阳性质控品序列与实施例2相同。
试剂盒组成如表1所示。
样本实验的实施方法为：
(1)反应缓冲液配制：
从试剂盒中反应缓冲液管里吸取128.4μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5ml PE管，再加入6μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mM，引物的浓度为0.03mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。
(2)RAA荧光基础反应试剂重溶
准备3个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的3个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。
(3)加样反应
在以上3个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、其他2个反应管中分别加入5μL提取好的呼吸道腺病毒样本DNA和5μL阳性质控品；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。
将混匀的3个反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如附图6所示。结果显示呼吸道腺病毒样本DNA和阳性质控品有扩增，阴性质控品无扩增，能满足快速检测呼吸道腺病毒样本DNA的目的。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江国际旅行卫生保健中心(浙江出入境检验检疫局口岸门诊部)
江苏奇天基因生物科技有限公司
<120> 一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagcatcagt ttcacgagca tcaacctcta tgc 33
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcgagaagg aatggaaatg ggaatattgg ttgc 34
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agccatgctg cggaatgaca ccaatgatca gtcattcaac gactayctat c 51

Claims (4)

1.一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物序列为：CAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGC；所述下游引物序列为：TGCGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGC。
2.一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的探针，其特征在于，所述探针的序列为：AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAGTCATTCAACGACTAYCTATC。
3.根据权利要求2所述的基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的探针，其特征在于，修饰后的探针优选为：
AGCCATGCTGCGGAATGACACCAATGATCAG(FAM-dT)C(THF)(BHQ1-dT)TCAACGACTAYCTATC。
4.一种基于RAA荧光法快速检测呼吸道腺病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：引物、如权利要求2或3所述的探针、RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为：CAGCATCAGTTTCACGAGCATCAACCTCTATGC；所述下游引物序列为：TGCGAGAAGGAATGGAAATGGGAATATTGGTTGC。
CN201910029711.4A 2019-01-14 2019-01-14 一种基于raa荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒 Withdrawn CN109652595A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910029711.4A CN109652595A (zh) 2019-01-14 2019-01-14 一种基于raa荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910029711.4A CN109652595A (zh) 2019-01-14 2019-01-14 一种基于raa荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109652595A true CN109652595A (zh) 2019-04-19

Family

ID=66119946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910029711.4A Withdrawn CN109652595A (zh) 2019-01-14 2019-01-14 一种基于raa荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109652595A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112301156A (zh) * 2020-02-06 2021-02-02 广州普世君安生物科技有限公司 一种快速检测人腺病毒的rda方法及试剂盒

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112301156A (zh) * 2020-02-06 2021-02-02 广州普世君安生物科技有限公司 一种快速检测人腺病毒的rda方法及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Andeweg et al. Improved detection of rhinoviruses in clinical samples by using a newly developed nested reverse transcription-PCR assay
Wang et al. Development of a novel quantitative real‐time PCR assay with lyophilized powder reagent to detect African swine fever virus in blood samples of domestic pigs in China
US20230340624A1 (en) Detection reagents for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 and detection methods
CN111235316A (zh) 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用
JP7374377B2 (ja) チフス菌の検査キット、その製造方法及びその用途
Zhang et al. Development of a directly visualized recombinase polymerase amplification–sybr green i method for the rapid detection of African swine fever virus
CN111549184B (zh) 一种呼吸道腺病毒的pcr荧光检测试剂盒及其应用
CN109593890A (zh) 检测腹泻病毒的核酸组合物、试剂盒及试剂盒的使用方法
CN109517927A (zh) 一种甲型、乙型流感病毒快速分型检测试剂盒及其应用
WO2021189546A1 (zh) 用于检测SARS-CoV-2冠状病毒的试剂盒及其专用引物和探针
CN108624720A (zh) Raa荧光法检测裂谷热病毒的引物探针组及试剂盒
Spezia et al. Redondovirus DNA in human respiratory samples
WO2023093387A1 (zh) 用于检测丙型肝炎病毒的raa引物、试剂盒及其应用
CN109913591A (zh) 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒
CN105886663A (zh) 一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量pcr的检测试剂盒
CN113186226B (zh) Rna病毒核酸检测参照标准品及其用途
CN113846191A (zh) 用于检测新型冠状病毒的引物、探针及其应用
CN109055614A (zh) 基于raa荧光法检测乙型肝炎病毒的引物探针组及试剂盒
CN108411014A (zh) 鉴别a型和b型牛多杀性巴氏杆菌的双重实时荧光定量pcr的引物和探针以及检测方法
CN109652595A (zh) 一种基于raa荧光法快速检测呼吸道腺病毒的引物、探针及检测试剂盒
KR20140022971A (ko) Ｂ형 간염 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 ｂ형 간염 바이러스 진단 방법
US20230250497A1 (en) One-step nested pcr primers set and kit modified with locked nucleic acid for detecting african swine fever virus
CN109609697A (zh) 一种基于raa荧光法快速检测人鼻病毒的引物、探针及检测试剂盒
CN106521038B (zh) 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN106119421A (zh) 猪蓝耳病qyyz株的荧光定量检测引物、探针及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20190419

WW01 Invention patent application withdrawn after publication