CN109652495B - 一种湿巾产品中微生物限度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种湿巾产品中微生物限度的检测方法，包括步骤S1，取湿巾样品，制备供试液；步骤S2，检测供试液中的需氧菌总数和霉菌酵母菌总数；步骤S3，取步骤S1中的供试液制备初增菌液A，检测初增菌液A中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌；步骤S4，取步骤S1中的供试液制备初增菌液B，检测初增菌液B中的沙门氏菌。本发明提供的方法中，采用含有吐温‑80的溶液D作为冲洗液及缓冲液对滤膜进行冲洗，中和了湿巾配方中的防腐剂，并对滤膜采用含有吐温‑80和卵磷脂的TSAWLP和SDAWLP培养基进行培养，有效降低了检测中假阴性的可能性，提高了湿巾产品中微生物限度检测的准确度。
Description
技术领域
本发明属于日用品领域，涉及一种湿巾产品中微生物限度的检测方法。
背景技术
微生物限度(能自行繁殖的微生物的数量)检测，是湿巾产品能否上市的重要指标，其原理是通过对湿巾产品的取样检测，通过相应的培养基培养，将湿巾中的微生物培养出来，如果湿巾中的微生物指标不符合标准要求，则判断产品不合格，不允许上市。
目前，一般都采用薄膜过滤法进行微生物限度的检测，并参照USP61和USP62测试。但是，市面上销售的一些湿巾配方中一般都具有防腐剂，依据目前的测试方法会存在假阴性的结果，为了准确检测湿巾中的微生物，必须要对消除防腐剂对检测方法的干扰。而目前业内并没有针对含有防腐剂的湿巾产品中微生物限度的检测方法。因此，为了能够消除湿巾中防腐剂对微生物限度检测的影响，保证湿巾产品中微生物指标判断的准确性，需要寻求一种新的能够准确检测湿巾产品中微生物限度的方法。
发明内容
为了解决上述生产中的问题，本发明提供了一种湿巾产品中微生物限度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，取湿巾样品加入到溶液D中，制备供试液；
步骤S2，将供试液采用滤膜过滤，并采用溶液D对滤膜进行冲洗，检测滤液中的需氧菌总数和霉菌酵母菌总数；
步骤S3，取步骤S1中的供试液制备初增菌液A，检测初增菌液A中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌；
步骤S4，取步骤S1中的供试液制备初增菌液B，检测初增菌液B中的沙门氏菌；
其中，所述溶液D的制备方法为，
将1g胃蛋白胨溶解于1000ml纯净水中，再加入1ml吐温-80，溶解完全后，调节pH至7.1±0.2,置于121℃条件下灭菌20分钟，即得。
进一步地，所述步骤S1具体操作如下，剪取20g样品置于无菌三角瓶中，并加入180ml溶液D，将无菌三角瓶置于摇床上，摇匀，即得到质量体积比为1:10的供试液。
进一步地，所述摇床条件为以190-220转/分的速度振荡至少10分钟。
进一步地，所述步骤S2具体操作如下，取10ml 1:10供试液通过膜过滤器过滤，再取100ml溶液D进行过滤冲洗，取一次过滤膜贴于TSAWLP平板，将TSAWLP平板置于30-35℃培养箱中培养3-5天，用于检测需氧菌总数，取另一次过滤膜贴于SDAWLP平板，将SDAWLP平板置于20-25℃培养箱中培养5-7天，用于检测霉菌酵母菌总数。
进一步地，所述步骤S3中，所述初增菌液A的制备方法为，取10ml1:10的供试液过滤后，用100ml溶液D进行冲洗过滤，将滤膜放至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液A。
进一步地，所述步骤S3中，初增菌液A中的金黄色葡萄球菌的检测方法为，用接种环从初增菌液A中挑取一环至甘露醇氯化钠琼脂(MSA)上涂匀，30-35℃倒置培养18-72小时；若MSA平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阴性，判断供试品未检出金黄色葡萄球菌。
进一步地，所述步骤S3中，初增菌液A中的大肠埃希菌的检测方法为，取1ml初增菌液A加入至100ml麦康凯肉汤(MCB)中，在42℃-44℃培养18-72小时，用接种环从MCB培养物中挑取一环至麦康凯琼脂培养基(MCA)上涂匀，在30℃-35℃再培养18-72小时；若MCA中菌落呈黑紫色，有金属光泽，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出大肠埃希菌。
进一步地，所述步骤S3中，初增菌液A中的铜绿假单胞菌的检测方法为，用接种环从初增菌液A中挑取一环至十六烷基三甲基溴化铵(CM)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-72小时；若CM上菌落或菌落周围呈蓝绿色，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
进一步地，所述步骤S4的操作如下，取10ml的1:10供试液至100mlRVS增菌肉汤培养基中，在30℃-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液B，用接种环从初增菌液B中挑取一环至木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基(XLD)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-48小时；若XLD平板上出现有生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为沙门氏菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出沙门氏菌。
进一步地，所述步骤S2-S4中还设置有阴性对照。
相关术语说明
其中，
所述TSAWLP：大豆酪蛋白消化物琼脂培养基(含有0.5％琼脂吐温80和0.07％卵磷脂)
所述SDAWLP:沙氏葡萄糖琼脂培养基(含有0.5％琼脂吐温80和0.07％卵磷脂)
所述TSB：大豆酪蛋白消化物肉汤
所述MSA：甘露醇氯化钠琼脂
所述CM：十六烷基三甲基溴化铵培养基
所述MCB：麦康凯肉汤培养基
所述MCA：麦康凯琼脂培养基
所述RV：增菌肉汤
所述XLD：木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基。
所述溶液D：一种溶液用来中和可能抑制微生物复苏生长的化学药剂。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1.本发明的检测方法中，增加了含有吐温-80的溶液D作为中和剂和冲洗剂，在对样品和滤膜的处理过程中既不影响微生物生长，也能很好中和湿巾成分中的防腐剂，同时，采用含有吐温80和卵磷脂的培养基对需氧菌和酵母菌进行培养，也能有效中和供试液中防腐剂对微生物的影响，从而保证检测结果的准确性，为生产企业检测湿巾中微生物生长状况提供真实可靠数据。
2.本发明首次以含有湿巾样品的供试液作为检测对象，并在其中添加中和剂，在培养基中同时添加吐温和卵磷脂，以湿巾供试液为检测环境，对吐温80和卵磷脂的用量进行摸索，以达到中和防腐剂的最优效果。
3.本发明采用薄膜过滤法，并在此基础上增加冲洗液对滤膜进行冲洗的步骤，能够有效中和防腐剂，且操作简单方便，实用性强。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的实施例是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。
实施例1制备供试液把剪刀的前端在注射针红外线加热消毒器中消毒至少5秒钟，然后冷却至少5秒钟，剪开样品包装袋，从样品上部剪取20g样品至180ml含有溶液D的罐子中，标记上简短的数字批号、抽样日期。将罐子放置摇床上，以190-220转/分的速度振荡至少10分钟，即得到质量体积比为1:10的供试液。所述溶液D的制备方法为，将1g胃蛋白胨溶解于1000ml纯净水中，再加入1ml吐温-80，溶解完全后，调节pH至7.1±0.2,置于121℃条件下灭菌20分钟，即得。
实施例2需氧菌总数和霉菌酵母菌总数的测定
将膜过滤器安装在装置上，取出10ml 1:10供试液，过滤后，取100ml溶液D进行冲洗，过滤后，将镊子的尖端在注射针红外线加热消毒器中消毒至少5秒钟，取出后冷却至少5秒钟，用镊子将一次膜贴在预先标记的TSAWLP平板上，将TSAWLP平板置于30-35℃培养箱中培养3-5天。将另一次膜贴在预先标记的SDAWLP平板上，将SDAWLP平板置于20-25℃培养箱中培养5-7天。
所述溶液D的制备方法为，将1g胃蛋白胨溶解于1000ml纯净水中，再加入1ml吐温-80，溶解完全后，调节pH至7.1±0.2,置于121℃条件下灭菌20分钟，即得。
检测结果如表1所述，其中，
Inoculums Product：接种浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液于平板上；
Product Challenge：在含有样品的供试液中同时添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照实施例1-2的方法取样并过滤，将滤膜铺于平板；
Neutralizing Agent Control：供试液中不添加样品，添加浓度100cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液，并按照实施例1-2的方法过滤，将滤膜铺于平板。
检测结果如表1所示，本发明检测的菌落回收率均在70％以上，符合药典规定中回收率的要求。同时，经过菌液回收率检测可知，采用冲洗液对滤膜进行冲洗，既不影响微生物生长，也能很好中和防腐剂，从而保证检测结果的准确性。
实施例3金黄色葡萄球菌的检测
取10ml1:10的供试液过滤后，用100ml溶液D进行冲洗过滤，将滤膜放至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小20时，即得初增菌液A。用接种环从初增菌液A中挑取一环至甘露醇氯化钠琼脂(MSA)上涂匀，30-35℃倒置培养18-72小时；若MSA平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阴性，判断供试品未检出金黄色葡萄球菌。检测结果如表2所示。
表2 金黄色葡萄球菌的检测
实施例4大肠埃希菌的检测
取10ml1:10的供试液过滤后，用100ml溶液D进行冲洗过滤，将滤膜放至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液A。取1ml初增菌液A加入至100ml麦康凯肉汤(MCB)中，在42℃-44℃培养24-48小时，用接种环从MCB培养物中挑取一环至麦康凯琼脂培养基(MCA)上涂匀，在30℃-35℃再培养18-72小时；若MCA中菌落呈黑紫色，有金属光泽，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出大肠埃希菌。检测结果如表3所示。
表3 大肠埃希菌的检测
实施例5铜绿假单胞菌的检测
取10ml1:10的供试液过滤后，用100ml溶液D进行冲洗过滤，将滤膜放至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤(TSB)中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液A。用接种环从初增菌液A中挑取一环至十六烷基三甲基溴化铵(CM)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-72小时；若CM上菌落或菌落周围呈蓝绿色，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。检测结果如表4所示。
表4 铜绿假单胞菌的检测
实施例6沙门氏菌的检测
取100ml的1:10供试液过滤后，将滤膜放至100ml TSB中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液B，取0.1ml的初增菌液B至10mlRVS肉汤培养基中，在30℃-35℃条件下培养18-24小时，用接种环从RVS肉汤中挑取一环至木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基(XLD)培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-48小时；若XLD平板上出现有生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为沙门氏菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出沙门氏菌。检测结果如表5所示。
表5沙门氏菌的检测
实施例7
按照实施例1方法制备供试液，其中溶液D中不添加吐温80，接种浓度103cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液于9.9ml的所述溶液D中，并涂布与TSA平板上。同时，接种浓度103cfu/ml左右，体积为0.1ml左右的菌液于9.9ml的pH＝7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液中，并涂布与TSA平板上。将平板置于30-35℃培养箱中培养3-5天，检测其中需氧菌数量，结果如表6所示。
表6 需氧菌数量的检测
从表6中可以看出，在供试液中不存在吐温80的情况下，需氧菌Staphylococcusaureus、Pseudomonas aeruginosa、Bacilus subtilis、Burkholderia cepacia中均会出现假阴性，从而影响检测结果的准确性。因此，在溶液D中添加吐温80可以有效中和防腐剂对需氧菌生长的影响。
实施例8
将膜过滤器安装在装置上，取出10ml 1:10供试液，过滤后，取100ml溶液D进行冲洗，过滤后，将镊子的尖端在注射针红外线加热消毒器中消毒至少5秒钟，取出后冷却至少5秒钟，用镊子将一次膜贴在预先标记的TSAWLP平板上，将TSAWLP平板置于30-35℃培养箱中培养3-5天。同时接种含有不同浓度吐温和卵磷脂的TSAWLP平板。检测需氧菌的数量，数据见表7。可以看出，在含有不同的浓度组合的吐温和卵磷脂的培养基中，各种需氧菌的生长情况是不同的，仅有在添加0.5％吐温80+0.07％卵磷脂的培养基中，才能保证所有的需氧菌检测过程中避免出现假阴性的结果。
表7 不同需氧菌的检测
以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种湿巾产品中微生物限度的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，剪取20g样品置于无菌三角瓶中，并加入180ml溶液D，将无菌三角瓶置于摇床上，以190-220转/分的速度振荡至少10分钟，即得到质量体积比为1:10的供试液；其中，所述溶液D的制备方法为，将1g胃蛋白胨溶解于1000ml纯净水中，再加入1ml吐温-80，溶解完全后，调节pH至7.1±0.2,置于121℃条件下灭菌20分钟，即得；
步骤S2，将供试液采用滤膜过滤，采用溶液D对滤膜进行冲洗，并将滤膜分别贴在TSAWLP平板上和SDAWLP平板上，检测滤液中的需氧菌总数和霉菌酵母菌总数，所述TSAWLP平板和SDAWLP平板均含有质量分数0.5％的吐温80和质量分数0.07％的卵磷脂；
步骤S3，取步骤S1中的供试液制备初增菌液A，所述初增菌液A的制备方法为，取10ml的1:10的供试液过滤后，用100ml溶液D进行冲洗过滤，将滤膜放至100ml大豆-酪蛋白消化物肉汤TSB中，在30-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液A，检测初增菌液A中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及铜绿假单胞菌；
步骤S4，取步骤S1中的供试液制备初增菌液B，取10ml的1:10供试液至100mlRVS增菌肉汤培养基中，在30℃-35℃条件下培养18-24小时，即得初增菌液B，检测初增菌液B中的沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2具体操作如下，取10ml 1:10供试液通过膜过滤器过滤，再取100ml溶液D进行过滤冲洗，取一次过滤膜贴于TSAWLP平板，将TSAWLP平板置于30-35℃培养箱中培养3-5天，用于检测需氧菌总数，取另一次过滤膜贴于SDAWLP平板，将SDAWLP平板置于20-25℃培养箱中培养5-7天，用于检测霉菌酵母菌总数。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，初增菌液A中的金黄色葡萄球菌的检测方法为，用接种环从初增菌液A中挑取一环至甘露醇氯化钠琼脂MSA上涂匀，30-35℃倒置培养18-72小时；若MSA平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似的菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阴性，判断供试品未检出金黄色葡萄球菌。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，初增菌液A中的大肠埃希菌的检测方法为，取1ml初增菌液A加入至100ml麦康凯肉汤MCB中，在42℃-44℃培养18-72小时，用接种环从MCB培养物中挑取一环至麦康凯琼脂培养基MCA上涂匀，在30℃-35℃再培养18-72小时；若MCA中菌落呈黑紫色，有金属光泽，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出大肠埃希菌。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中，初增菌液A中的铜绿假单胞菌的检测方法为，用接种环从初增菌液A中挑取一环至十六烷基三甲基溴化铵培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-72小时；若十六烷基三甲基溴化铵培养基平板上菌落或菌落周围呈蓝绿色，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S4的操作如下，用接种环从初增菌液B中挑取一环至木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基平板上，在30℃-35℃条件下培养18-48小时；若木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基平板上出现有生长良好的红色菌落，带有或没有黑色中心，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为沙门氏菌；若没有菌落生长，或虽有菌落生长但革兰氏染色鉴定结果为阳性，判断供试品未检出沙门氏菌。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2-S4中还设置有阴性对照。
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