CN109651468A - 具有抑制病毒复制活性的核苷氨基磷酸酯类似物、制备方法及其药物用途 - Google Patents

具有抑制病毒复制活性的核苷氨基磷酸酯类似物、制备方法及其药物用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组具有抑制病毒复制活性的核苷氨基磷酸酯类似物、制备方法及其药物用途。本发明公开的新型核苷氨基磷酸酯类似物在抗丙肝活性方面显著优越于临床应用的索非布韦，在手性磷原子上，用烷氧羰氧基烷基或长链烷氧基烷基取代苯基，在所测细胞系中显示显著降低了细胞毒性，且生物利用度有所提高，具有非常好的临床应用前景。

Description

具有抑制病毒复制活性的核苷氨基磷酸酯类似物、制备方法 及其药物用途
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一类新型的核苷氨基磷酸酯类似物的制备方法及其药物组合物和用途，特别是作为治疗丙型肝炎的用途。
背景技术
由于HCV基因组在结构和表型特征上与人黄病毒和瘟病毒相类似，将其归为黄病毒科HCV。黄病毒科家族的病毒包括至少三种不同的属：瘟病毒属(pestiviruses)，其在牛和猪中引起疾病；黄病毒属 (flavivruses)，其为诸如登革热和黄热病等疾病的主要原因；以及丙型肝炎病毒属(hepaciviruses)，其唯一成员为HCV。黄病毒属包括的成员超过68个，基于血清学亲缘关系进行分组。临床症状各异并且包括发热、脑炎和出血热。全球所关注的与人类疾病有关的黄病毒属包括登革出血热病毒(DHF)、黄热病病毒、休克综合征病毒和日本脑炎病毒。丙型肝炎病毒是正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。
HCV药物，包括蛋白酶抑制剂、核苷类和非核苷类聚合酶抑制剂以及NS5A抑制剂等。FDA批准的蛋白酶抑制剂类药物有三个： VX-950(Telaprevir)，SCH-503034(Boceprevir)和 TMC435(Simeprevir)，蛋白酶抑制剂的缺点是易产生突变、毒性大、生物利用度差，对个别的基因类型有效。
丙肝的聚合酶抑制剂通常分为核苷类和非核苷类两种。目前，临床上仅有索菲布韦一个核苷类丙肝药物被FDA批准上市，但是，由于 sofosbuvir在体内有近90％代谢为没有活性的代谢产物，需要用较大的给药剂量，丙肝患者需要接受长期治疗，随之带来的病毒耐药以及长期安全性问题不容忽视，因此，开发新的生物利用度高及更长的半衰期，药效高的HCV感染治疗药物仍是临床的迫切需求。
发明内容
本发明的目的是对核苷氨基磷酸酯类似物的结构进行更进一步的改造，得到具有更高生物利用度、更低毒性和更高抗HCV病毒活性的新型核苷氨基磷酸酯类似物，为今后深入研究与开发本发明化合物的抗病毒应用奠定基础。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一组具有通式结构(Ia)的化合物，其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶，
其中，Base是B1、B2、B3、B4或B5；
这里，R1、R2、R3、R4、R5各自独立地是H、D、F、Cl、CH3、NN2或环丙氨基。
Ri是五元核糖Ri1、Ri2或Ri3；
这里，X2、Y2、X3、Y3、Y4各自独立地是H、F、Cl、OH、CH3或 N3。
Z1＝O或C＝CH2；
Z2＝O或CH2；
Z3、Z4各自独立地是O或S；
X、Y各自独立地是H或D；
Ra＝CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3或CH2AR22；
这里，m＝0-4，n＝12-18；A＝OCOO，OCO或COO；R22＝H或 C1-C6烷基；
Rb＝H或CHR6R7；
这里，R6＝H或C1-C6烷基；R7＝H，C1-C6烷基，AR22或与R6相连形成的C3-C8的环；
Rc是任一天然或非天然α-氨基酸的侧链。
作为进一步优选的方案，所述化合物(Ia)，其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶，优选m＝1，n＝14的组合或m＝0，n＝16的组合；优选A＝OCOO；R22优选异丙基、异丁基、新戊基；Rb优选异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基；Rc优选甲基或苯甲基。
作为再进一步优选的方案，本发明所述的化合物，其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶，其磷原子为手性原子，优选其单一构型S(P)构型或R(P)构型或S(P)构型与R(P)构型任一比例的混合物。
作为更进一步优选的方案，本发明所述的化合物，其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶，又更进一步优选下列结构式的化合物：
本发明提供了核苷氨基磷酸酯类似物的制备方法，所述制备方法的合成路线如下：
这里：Base、Ri、X，Y，Ra，Rb或Rc定义同定义(Ia)化合物。
在碱性条件下，RaOH与三氯氧磷反应后，加入氨基酸酯反应，再加入五氟苯酚反应得到化合物FA3-2和FA3-1；在低温条件下，化合物FA3-2或FA3-1与核苷反应，分别得到化合物NA3-1或NA3-2。
本发明提供的核苷氨基磷酸酯类似物，可与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂以及纳米制剂，以适合于经口或胃肠外给药；给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。
一种包含本发明所述的核苷氨基磷酸酯类似物的医药组合物。
本发明所述医药组合物，还含有独立地选自以下药物的其他治疗剂：利巴韦林(Ribavirin)、干扰素、丙肝NS3蛋白酶抑制剂、 HCV逆转录酶NS5B非核苷抑制剂、HCV逆转录酶NS5B核苷抑制剂、NS5A抑制剂以及NS5A抑制剂的增效剂、进入抑制剂、环孢素免疫抑制剂、NS4A拮抗剂、NS4B抑制剂、亲环素抑制剂。
本发明所述的核苷氨基磷酸酯类似物及其药用组合物在制备抗黄病毒科病毒的药物中的应用，所述黄病毒科病毒是丙型肝炎病毒。
本发明所述的药物组合物，所述药物组合物的剂型为片剂、针剂或胶囊。
具体实施例
以下通过实施例对本发明作进一步详细阐述，但本发明不限于这些实施例。本发明实施例中使用的试剂和原料均为市场商购所得。
实施例1
(S)-N-[(五氟苯氧基)(3-(十六烷氧基)丙氧基)磷酰基]-L-丙氨酸异丙酯(FP130-1)和(R)-N-[(五氟苯氧基)(3-(十六烷氧基)丙氧基) 磷酰基]-L-丙氨酸异丙酯(FP130-2)的合成。
在反应瓶中加入三氯氧磷(5g，3.04ml，32.6mmol)，加乙腈 200mL，冷却到-70℃，缓慢滴加K11(9.8g，32.6mmol)和三乙胺 (3.3克，4.53ml，32.6mmol)的乙腈(60mL)溶液，滴加完毕，缓慢升至室温，反应过夜。将上述混合液冷却到0℃，加入HA30(4.93g，29.4mmol)，冷却到-70℃，滴加三乙胺(7.3克，10ml，72mmol) 的乙腈溶液60mL，加毕，升温到0℃，反应3小时将五氟苯酚(5.4g， 29.4mmol)和三乙胺(7.3克，10ml，72mmol)的乙腈溶液60mL液体滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入100毫升二氯甲烷及100毫升水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0-30％乙酸乙酯/己烷)得 11.5g白色固体，固体用10％叔丁基甲基醚/己烷重结晶，得白色固体FP130-2(4.5g)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)得 FP130-1(3.4g)和FP130-2(0.6g)，FP130-2和FP130-1纯度均大于99％。
FP130-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.88(3H，t， CH3)，1.22-1.36(35H，m，13×CH2and3×CH3)，1.49-1.59(2H， m，CH2)，1.92-1.98(2H，m，CH2)，3.27-3.56(5H，m，2×OCH2and NCH)，3.82-4.10(2H，m，OCH2)，4.34-4.41(1H，m，NH)， 4.95-5.02(1H，m，COOCH)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ-1.48。
FP130-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.88(3H，t， CH3)，1.24-1.38(35H，m，13×CH2and3×CH3)，1.51-1.61(2H， m，CH2)，1.95-2.01(2H，m，CH2)，3.29-3.58(5H，m，2×OCH2and NCH)，3.85-4.12(2H，m，OCH2)，4.37-4.43(1H，m，NH)， 4.97-5.06(1H，m，COOCH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.78。
实施例2
(S)-N-[(五氟苯氧基)(2-(十八烷氧基)乙氧基)磷酰基]-L-丙氨酸异丙酯(FP1230-1)和(R)-N-[(五氟苯氧基)(2-(十八烷氧基)乙氧基) 磷酰基]-L-丙氨酸异丙酯(FP1230-2)的合成。
以实施例1类似的方法合成FP1230-1和FP1230-2。
FP1230-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.88(3H， t，CH3)，1.23-1.37(39H，m，15×CH2and3×CH3)，1.49-1.57(2H， m，CH2)，3.27-3.56(3H，m，OCH2and NCH)，3.83-4.11(4H，m，2×OCH2)，4.32-4.42(1H，m，NH)，4.96-5.05(1H，m，COOCH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.53。
FP1230-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.89(3H， t，CH3)，1.26-1.40(39H，m，15×CH2and3×CH3)，1.51-1.60(2H， m，CH2)，3.30-3.61(3H，m，OCH2and NCH)，3.86-4.15(4H，m，2×OCH2)，4.34-4.46(1H，m，NH)，4.99-5.08(1H，m，COOCH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.83。
实施例3
(S)-N-[(五氟苯氧基)(3-(十六烷氧基)丙氧基)磷酰基]-L-丙氨酸新戊酯(FP133-1)和(R)-N-[(五氟苯氧基)(3-(十六烷氧基)丙氧基) 磷酰基]-L-丙氨酸新戊酯(FP133-2)的合成。
以实施例1类似的方法合成FP133-1和FP133-2
FP133-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.79-0.99 (12H，m，4×CH3)，1.15-1.44(29H，m，13×CH2and CH3)， 1.48-1.59(2H，m，CH2)，1.81-1.94(2H，m，CH2)，3.26-3.50(4H，m，2×OCH2)，4.00-4.18(5H m OCH2，NCH and COOCH2)， 4.31-4.43(1H，m，NH)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.57。
FP133-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.82-1.02 (12H，m，4×CH3)，1.17-1.47(29H，m，13×CH2and CH3)， 1.52-1.62(2H，m，CH2)，1.84-1.97(2H，m，CH2)，3.29-3.53(4H，m，2×OCH2)，4.03-4.23(5H m OCH2，NCH and COOCH2)， 4.34-4.45(1H，m，NH)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.86。
实施例4
(S)-N-[(五氟苯氧基)(3-(十六烷氧基)丙氧基)磷酰基]-L-丙氨酸正丁酯(FP134-1)和(R)-N-[(五氟苯氧基)(3-(十六烷氧基)丙氧基) 磷酰基]-L-丙氨酸正丁酯(FP134-2)的合成。
以实施例1类似的方法合成FP134-1和FP134-2
FP134-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.85-0.94 (6H，m，2×CH3)，1.02-1.45(31H，m，13×CH2，CH2and CH3)， 1.49-1.65(4H，m，2×CH2)，1.83-1.93(2H，m，CH2)，3.32-3.68(5H， m，2×OCH2and NCH)，3.76-4.17(4H，m，COOCH2，and OCH2)，4.33-4.41(1H，m，NH)。31PNMR(162MHz，CDCl3)δ-1.59。
FP134-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.88-0.97 (6H，m，2×CH3)，1.04-1.47(31H，m，13×CH2，CH2and CH3)， 1.52-1.68(4H，m，2×CH2)，1.86-1.96(2H，m，CH2)，3.35-3.70(5H， m，2×OCH2and NCH)，3.80-4.20(4H，m，COOCH2，and OCH2)， 4.37-4.48(1H，m，NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.88。
实施例5
(S)-[(((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-1-基)-4-氟-3 -羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲基)(3-(十六烷氧基)丙基)((S)-1-(异丙氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(SOF130-1)的合成。
向50mL烧瓶中加入核苷SOF(260.2mg，1mmol)和5.0mL无水 THF，混合物在冰水浴中冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁1.0Min THF 溶液(3.0mL，3.0mmol)，反应混合物在0℃下搅拌30min，随后在 0℃下滴加磷试剂FP130-2(1.055g，1.6mmol)在5mL THF中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升至室温，搅拌20小时后，加入饱和 NH4Cl(15mL)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释，分出有机相，水层用乙酸乙酯(30mL)萃取两次。合并的有机层用水 (30mL)、饱和NaHCO3(2x30mL)、盐水(30mL)洗涤，并经Na2SO4干燥后减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物SOF130-1(375.3mg)，收率51％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.88(3H，t，CH3)， 1.22-1.36(35H，m，13×CH2and3×CH3)，1.43-1.59(5H，m， CH2and糖环2’-位上的CH3)，1.92-1.99(2H，m，CH2)，3.27- 3.56(5H，m，2×OCH2and)，3.83-4.10(3H，m，OCH2and糖环3’-位上的H)，4.28(1H，brs，糖环3’-位上的OH)，4.34-4.42 (2H，m，PNHand糖环4’-位上的H)，4.47-4.57(2H，m，糖环 5’-位上的H)，4.95-5.08(1H，m，COOCH)，5.58(1H，d，嘧啶环5位上的H)，6.18(1H，d，糖环1’-位上的H)，7.18-7.41(1H， d，嘧啶环6位上的H)，9.74(1H，s，嘧啶环3位上的NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.75；
LCMS-ESI+(m/z)：736.8(M+H)+。
实施例6
(R)-[(((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-1-基)-4-氟-3 -羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲基)(3-(十六烷氧基)丙基)((S)-1-(异丙氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(SOF130-2)的合成。
以实施例5类似的方法合成SOF130-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.88(3H，t，CH3)， 1.24-1.38(35H，m，13×CH2and3×CH3)，1.46-1.61(5H，m， CH2and糖环2’-位上的CH3)，1.93-2.01(2H，m，CH2)，3.32- 3.52(5H，m，2×OCH2and)，3.84-4.12(3H，m，OCH2and糖环3’-位上的H)，4.29(1H，brs，糖环3’-位上的OH)，4.37-4.44 (2H，m，PNH and糖环4’-位上的H)，4.49-4.57(2H，m，糖环 5’-位上的H)，4.96-5.08(1H，m，COOCH)，5.59(1H，d，嘧啶环5位上的H)，6.20(1H，d，糖环1’-位上的H)，7.19-7.36(1H， d，嘧啶环6位上的H)，9.75(1H，s，嘧啶环3位上的NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.96；
LCMS-ESI+(m/z)：736.8(M+H)+。
实施例7
(S)-[(((2R，5S)-5-(5-氟-4-氨基-2(1H)-嘧啶酮-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲基)(3-(十六烷氧基)丙基)((S)-1-(正丁氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(FTC134-1)的合成。
以实施例5类似的方法合成FTC134-1。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.85-0.94(6H，m，2 ×CH3)，1.04-1.41(31H，m，13×CH2，CH2and CH3)，1.49-1.65 (4H，m，2×CH2)，1.81-1.93(2H，m，CH2)，3.07-3.28(2H，m，糖环2′-位上的H)，3.38-3.67(5H，m，2×OCH2and NCH)， 3.80-4.18(4H，m，COOCH2，and OCH2)，4.26-4.44(2H，m，糖环4′-位上的H and PNH)，5.29-5.40(2H，m，糖环5′-位上的H)，5.62(1H，t，糖环1′-位上的H)，5.81-6.18(2H，dbrs，嘧啶环4位上的NH2)，7.92-8.13(1H，s，嘧啶环6位上的H)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.66；
LCMS-ESI+(m/z)：737.9(M+H)+。
实施例8
(R)-[(((2R，5S)-5-(5-氟-4-氨基-2(1H)-嘧啶酮-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲基)(3-(十六烷氧基)丙基)((S)-1-(正丁氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(FTC134-2)的合成。
以实施例5类似的方法合成FTC134-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)6(ppm)：0.88-0.97(6H，m，2 ×CH3)，1.07-1.42(31H，m，13×CH2，CH2and CH3)，1.52-1.67 (4H，m，2×CH2)，1.86-1.96(2H，m，CH2)，3.09-3.32(2H，m，糖环2′-位上的H)，3.39-3.72(5H，m，2×OCH2and NCH)， 3.80-4.22(4H，m，COOCH2，and OCH2)，4.28-4.47(2H，m，糖环4′-位上的H and PNH)，5.32-5.43(2H，m，糖环5′-位上的H)，5.64(1H，t，糖环1′-位上的H)，5.85-6.21(2H，dbrs，嘧啶环4位上的NH2)，7.06(1H，s，嘧啶环6位上的H)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.94；
LCMS-ESI+(m/z)：737.9(M+H)+。
实施例9
(S)-[(((2R，5S)-5-(4-氨基-2(1H)-嘧啶酮-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲基)(3-(十六烷氧基)丙基)((S)-1-(新戊氧基羰基)乙基氨基)] 磷酸酯(3TC133-1)的合成。
以实施例5类似的方法合成3TC133-1。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.79-0.98(12H，m，4 ×CH3)，1.15-1.45(29H，m，13×CH2and CH3)，1.48-1.59(2H，m，CH2)，1.81-1.94(2H，m，CH2)，3.11-3.47(6H，m，糖环2′ -位上的H and2×OCH2)，3.90-4.19(5H，m，OCH2，NCH and COOCH2)，4.27-4.44(2H，m，糖环4′-位上的H and NH)， 5.29-5.40(3H，m，糖环5′-位and嘧啶环5位上的H)，5.62(1H， t，糖环1′-位上的H)，5.82-6.18(2H，dbrs，嘧啶环4位上的 NH2)，8.32-8.70(1H，d，嘧啶环6位上的H)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ4.02；
LCMS-ESI+(m/z)：733.9(M+H)+。
实施例10
(R)-[(((2R，5S)-5-(4-氨基-2(1H)-嘧啶酮-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲基)(3-(十六烷氧基)丙基)((S)-1-(新戊氧基羰基)乙基氨基)] 磷酸酯(3TC133-2)的合成。
以实施例5类似的方法合成3TC133-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.81-1.02(12H，m，4 ×CH3)，1.20-1.47(29H，m，13×CH2and CH3)，1.49-1.63(2H， m，CH2)，1.84-1.96(2H，m，CH2)，3.15-3.48(6H，m，糖环2′ -位上的H and 2×OCH2)，3.93-4.22(5H，m，OCH2，NCH and COOCH2)，4.29-4.47(2H，m，糖环4′-位上的H and NH)， 5.33-5.43(3H，m，糖环5′-位and嘧啶环5位上的H)，5.66(1H， t，糖环1′-位上的H)，5.85-6.23(2H，dbrs，嘧啶环4位上的 NH2)，8.35-8.71(1H，d，嘧啶环6位上的H)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ4.31；
LCMS-ESI+(m/z)：733.9(M+H)+。
实施例11
(S)-[(((2S，3S，5R)-5-(5-甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-1-基)-3-叠氮四氢呋喃-2-基)甲基)(2-(十八烷氧基)乙基)((S)-1-(异丙氧基羰基) 乙基氨基)]磷酸酯(AZT1230-1)的合成。
以实施例5类似的方法合成AZT1230-1。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.88(3H，t，CH3)， 1.23-1.37(39H，m，15×CH2and3×CH3)，1.49-1.57(2H，m， CH2)，1.95(3H，s，嘧啶环5位上的CH3)，2.30-2.50(3H，m，糖环2′-位上的H and糖环3′-位上的H)，3.32-3.52(2H，m，OCH2)， 3.83-4.20(7H，m，PNH，NCH，2×OCH2and糖环4′-位上的 H)，4.27-4.42(2H，m，糖环5′-位上的H)，4.96-5.05(1H，m，COOCH)，6.15(1H，s，糖环1′-位上的H，7.25(1H，s，嘧啶环 6位上的H)，9.25(1H，m，嘧啶环3位上的NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ4.27；
LCMS-ESI+(m/z)：757.9(M+H)+。
实施例12
(R)-[(((2S，3S，5R)-5-(5-甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-1-基)-3-叠氮四氢呋喃-2-基)甲基)(2-(十八烷氧基)乙基)((S)-1-(异丙氧基羰基) 乙基氨基)]磷酸酯(AZT1230-2)的合成。
以实施例5类似的方法合成AZT1230-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.89(3H，t，CH3)， 1.26-1.40(39H，m，15×CH2and3×CH3)，1.51-1.60(2H，m， CH2)，1.96(3H，s，嘧啶环5位上的CH3)，2.32-2.53(3H，m，糖环2′-位上的H and糖环3′-位上的H)，3.33-3.55(2H，m，OCH2)， 3.88-4.24(7H，m，PNH，NCH，2×OCH2and糖环4′-位上的 H)，4.30-4.46(2H，m，糖环5′-位上的H)，4.99-5.08(1H，m，COOCH)，6.16(1H，s，糖环1′-位上的H，7.26(1H，s，嘧啶环 6位上的H)，9.27(1H，m，嘧啶环3位上的NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ4.56；
LCMS-ESI+(m/z)：757.9(M+H)+。
实施例13
(R)-N-[(五氟苯氧基)(异丙氧基羰氧基甲氧基)磷酰基]-L-丙氨酸异丙酯(FP230-1)和(S)-N-[(五氟苯氧基)(异丙氧基羰氧基甲氧基) 磷酰基]-L-丙氨酸异丙酯(FP230-2)的合成。
在反应瓶中加入三氯氧磷(5g，3.04ml，32.6mmol)，加乙腈 200mL，冷却到-70℃，缓慢滴加K2(4.37g，32.6mmol)和三乙胺 (3.3g，4.53ml，32.6mmol)的乙腈(60mL)溶液，滴加完毕，缓慢升至室温，反应过夜。将上述混合液冷却到0℃，加入HA30(4.93g， 29.4mmol)，冷却到-70℃，滴加三乙胺(7.3g，10ml，72mmol)的乙腈溶液60mL，加毕，升温到0℃，反应3小时将五氟苯酚(5.4g， 29.4mmol)和三乙胺(7.3g，10ml，72mmol)的乙腈溶液60mL液体滴加到上述溶液中，在0℃搅拌1小时，升至室温，搅拌过夜后，加入100毫升二氯甲烷及100毫升水，分出有机相，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，残余物用硅胶柱分离(0-30％乙酸乙酯/己烷)得 8.1g白色固体，固体用10％叔丁基甲基醚/己烷重结晶，得白色固体 FP230-2(3.1g)，母液用硅胶柱分离(50％乙酸乙酯/己烷)得FP230-1 (2.4g)和FP230-2(0.4g)，FP230-2和FP230-1纯度均大于99％。
FP230-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：1.14-1.42 (15H，m，5×CH3)，3.75-4.07(1H，m，NCH)，4.29-4.45(1H， m，NH)，4.84-5.10(2H，m，2×COOCH)，5.54-5.74(2H，m，OCH2O)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.53。
FP230-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：1.16-1.44 (15H，m，5×CH3)，3.75-4.09(1H，m，NCH)，4.30-4.46(1H， m，NH)，4.86-5.09(2H，m，2×COOCH)，5.55-5.77(2H，m，OCH2O)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.83。
实施例14
(R)-N-[(五氟苯氧基)(异丙氧基羰氧基甲氧基)磷酰基]-L-丙氨酸新戊酯(FP233-1)和(S)-N-[(五氟苯氧基)(异丙氧基羰氧基甲氧基) 磷酰基]-L-丙氨酸新戊酯(FP233-2)的合成。
以实施例1类似的方法合成FP233-1和FP233-2
FP233-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.94(9H， s，3×CH3)，1.26-1.36(6H，m，2×CH3)，1.40-1.46(3H，d，CH3)， 3.88-3.95(2H，m，NH and NCH)，4.08-4.39(2H，m，COOCH2)，4.86-4.97(1H，m，COOCH)，5.57-5.73(2H，m，OCH2O)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.72。
FP233-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.95(9H， s，3×CH3)，1.28-1.37(6H，m，2×CH3)，1.42-1.51(3H，d，CH3)， 3.90-3.99(2H，m，NH and NCH)，4.11-4.38(2H，m，COOCH2)，4.87-5.01(1H，m，COOCH)，5.59-5.76(2H，m，OCH2O)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.99。
实施例15
(R)-N-[(五氟苯氧基)(异丙氧基羰氧基甲氧基)磷酰基]-L-丙氨酸正丁酯(FP234-1)和(S)-N-[(五氟苯氧基)(异丙氧基羰氧基甲氧基) 磷酰基]-L-丙氨酸正丁酯(FP234-2)的合成。
以实施例1类似的方法合成FP234-1和FP234-2
FP234-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.93(3H， t，3×CH3)，1.18-1.44(11H，m，3×CH3and CH2)，1.55-1.67(2H， m，CH2)，3.96-4.07(2H，m，NH and NCH)，4.08-4.41(2H，m，COOCH2)，4.85-4.98(1H，m，COOCH)，5.53-5.72(2H，m， OCH2O)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.42。
FP234-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.94(3H， t，3×CH3)，1.20-1.46(11H，m，3×CH3and CH2)，1.57-1.69(2H， m，CH2)，3.98-4.08(2H，m，NH and NCH)，4.21-4.39(2H，m，COOCH2)，4.87-5.01(1H，m，COOCH)，5.55-5.73(2H，m， OCH2O)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.72。
实施例16
(R)-N-[(五氟苯氧基)(新戊氧基羰氧基甲氧基)磷酰基]-L-丙氨酸新戊酯(FP2333-1)FP2333-1和(S)-N-[(五氟苯氧基)(新戊氧基羰氧基甲氧基)磷酰基]-L-丙氨酸新戊酯(FP2333-2)的合成。
以实施例1类似的方法合成FP2333-1和FP2333-2
FP2333-1：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.94(18H， s，6×CH3)，1.40-1.46(3H，d，CH3)，3.88-3.95(2H，m，NH and NCH)，4.08-4.39(4H，m，2×COOCH2)，5.57-5.73(2H，m，OCH2O)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.68。
FP2333-2：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.96(18H， s，6×CH3)，1.43-1.49(3H，d，CH3)，3.89-3.99(2H，m，NH and NCH)，4.11-4.38(4H，m，2×COOCH2)，5.55-5.75(2H，m，OCH2O)。31P NMR(162MHz，CDCl3)δ-1.98。
实施例17
(R)-[(((2R，5S)-5-(5-氟-4-氨基-2(1H)-嘧啶酮-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲基)(异丙氧基羰基氧甲基)((S)-1-(异丙氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(FTC230-1)的合成。
向50mL烧瓶中加入核苷FTC(247.3mg，1mmol)和5.0mL无水 THF，混合物在冰水浴中搅拌冷却至0℃。滴加叔丁基氯化镁1.0Min THF溶液3.0mL(3.0mmol)，反应混合物在0℃下搅拌30min，随后在0℃下滴加磷试剂FP230-2(789.3mg，1.6mmol)在5mL THF 中的溶液。将所得到的澄清反应溶液升至室温，搅拌20小时后，加入饱和NH4Cl(15mL)，搅拌5分钟，将混合物用乙酸乙酯(200mL) 稀释，分出有机相，水层用乙酸乙酯(30mL)萃取两次。合并的有机层用水(30mL)、饱和NaHCO3(2x30mL)、盐水(30mL)洗涤，并经 Na2SO4干燥后减压蒸去溶剂，残留物经由硅胶柱层析(0-10％甲醇的二氯甲烷)纯化，得白色固体产物FTC230-1(295mg)，收率53％)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：1.13-1.43(15H，m，5 ×CH3)，3.04-3.51(2H，m，糖环2′-位上的H)，3.74-4.08(1H， m，NCH)，4.26-4.47(2H，m，糖环4′-位上的H and PNH)，4.83-5.09(2H，m，2×COOCH)，5.27-5.42(2H，m，糖环5′-位上的H)，5.53-5.75(3H，m，OCH2Oand糖环1′-位上的H)， 5.79-6.21(2H，dbrs，嘧啶环4位上的NH2)，7.90-8.16(1H，s，嘧啶环6位上的H)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.66；
LCMS-ESI+(m/z)：557.5(M+H)+。
实施例18
(S)-[(((2R，5S)-5-(5-氟-4-氨基-2(1H)-嘧啶酮-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲基)(异丙氧基羰基氧甲基)((S)-1-(异丙氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(FTC230-2)的合成。
以实施例5类似的方法合成制备FTC230-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：1.17-1.45(15H，m，5 ×CH3)，3.07-3.54(2H，m，糖环2′-位上的H)，3.78-4.09(1H， m，NCH)，4.26-4.49(2H，m，糖环4′-位上的H and PNH)，4.87-5.14(2H，m，2×COOCH)，5.30-5.45(2H，m，糖环5′-位上的H)，5.56-5.77(3H，m，OCH2Oand糖环1′-位上的H)， 5.85-6.24(2H，dbrs，嘧啶环4位上的NH2)，7.93-8.18(1H，s，嘧啶环6位上的H)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.98；
LCMS-ESI+(m/z)：557.5(M+H)+。
实施例19
(R)-[(((2R，5S)-5-(4-氨基-2(1H)-嘧啶酮-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲基)(异丙氧基羰基氧甲基)((S)-1-(新戊氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(3TC233-1)的合成。
以实施例5类似的方法合成3TC233-1
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.94(9H，s，3×CH3)， 1.25-1.33(6H，m，2×CH3)，1.39-1.47(3H，d，CH3)，3.24-3.41(2H， m，糖环2′-位上的H)，3.87-3.96(2H，m，PNH andNCH)， 4.11-4.47(3H，m，糖环4′-位上的H and COOCH2)，4.85-4.98(1H， m，COOCH)，5.27-5.42(3H，m，糖环5′-位and嘧啶环5位上的H)，5.56-5.74(3H，m，OCH2O and糖环1′-位上的H)， 5.79-6.21(2H，dbrs，嘧啶环4位上的NH2)，8.46-8.72(1H，d，嘧啶环6位上的H)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.52；
LCMS-ESI+(m/z)：567.6(M+H)+。
实施例20
(S)-[(((2R，5S)-5-(4-氨基-2(1H)-嘧啶酮-1-基)-1，3-氧硫杂环戊烷-2-基)甲基)(异丙氧基羰基氧甲基)((S)-1-(新戊氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(3TC233-2)的合成。
以实施例5类似的方法合成3TC233-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.96(9H，s，3×CH3)， 1.27-1.37(6H，m，2×CH3)，1.41-1.57(3H，d，CH3)，3.12-3.39(2H， m，糖环2′-位上的H)，3.88-4.00(2H，m，PNH andNCH)， 4.14-4.49(3H，m，糖环4′-位上的H and COOCH2)，4.87-5.03(1H， m，COOCH)，5.30-5.45(3H，m，糖环5′-位and嘧啶环5位上的H)，5.58-5.78(3H，m，OCH2O and糖环1′-位上的H)， 5.83-6.23(2H，dbrs，嘧啶环4位上的NH2)，8.43-8.73(1H，d，嘧啶环6位上的H)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.84；
LCMS-ESI+(m/z)：567.6(M+H)+。
实施例21
(R)-[(((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-1-基)-4-氟-3- 羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙氧基羰基氧甲基)((S)-1-(正丁氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(SOF234-1)的合成。
以实施例5类似的方法合成SOF234-1
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.93(3H，t，CH3)，1.17- 1.45(14H，m，4×CH3andCH2)，1.54-1.68(2H，m，CH2)， 3.91-4.05(2H，m，PNH and NCH)，4.06-4.24(3H，m，糖环3’-位上的H and COOCH2)，4.27(1H，brs，糖环3’-位上的OH)， 4.33-4.41(1H，m，糖环4’-位上的H)，4.45-4.55(2H，m，糖环 5’-位上的H)，4.83-4.99(1H，m，COOCH)，5.51-5.75(3H，m，OCH2O and嘧啶环5位上的H)，6.18(1H，s，糖环1’-位上的 H)，7.14-7.27(1H，m，嘧啶环6位上的H)，9.74(1H，s，嘧啶环3 位上的NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.26；
LCMS-ESI+(m/z)：584.5(M+H)+。
实施例22
(S)-[(((2R，3R，4R，5R)-5-(2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-1-基)-4-氟-3- 羟基-4-甲基四氢呋喃-2-基)甲基)(异丙氧基羰基氧甲基)((S)-1-(正丁氧基羰基)乙基氨基)]磷酸酯(SOF234-2)的合成。
以实施例5类似的方法合成SOF234-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.95(3H，t，CH3)，1.20- 1.47(14H，m，4×CH3andCH2)，1.57-1.70(2H，m，CH2)，3.94-4.07(2H，m，PNH and NCH)，4.10-4.26(3H，m，糖环3’- 位上的H and COOCH2)，4.29(1H，brs，糖环3’-位上的OH)， 4.35-4.46(1H，m，糖环4’-位上的H)，4.50-4.62(2H，m，糖环 5’-位上的H)，4.87-5.02(1H，m，COOCH)，5.54-5.76(3H，m，OCH2O and嘧啶环5位上的H)，6.18(1H，s，糖环1’-位上的H)，7.17-7.26(1H，m，嘧啶环6位上的H)，9.76(1H，s，嘧啶环3 位上的NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ3.57；
LCMS-ESI+(m/z)：584.5(M+H)+。
实施例23
(R)-[(((2S，3S，5R)-5-(5-甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-1-基)-3-叠氮四氢呋喃-2-基)甲基)(新戊氧基羰基氧甲基)((S)-1-(新戊氧基羰基) 乙基氨基)]磷酸酯(AZT2333-1)的合成。
以实施例5类似的方法合成AZT2333-1。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.94(18H，s，6×CH3)， 1.39-1.47(3H，d，CH3)，1.95(3H，s，嘧啶环5位上的CH3)，2.29 -2.52(2H，m，糖环2′-位上的H)，3.84-3.97(2H，m，PNH and 糖环3′-位上的H)，4.04-4.44(8H，m，2×COOCH2，NCH and糖环4′-位、5′-位上的H)，5.56-5.74(2H，m，OCH2O)，6.15(1H， t，糖环1′-位上的H，7.25(1H，s，嘧啶环6位上的H)，9.25(1H， s，嘧啶环3位上的NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ4.01；
LCMS-ESI+(m/z)：633.6(M+H)+。
实施例24
(S)-[(((2S，3S，5R)-5-(5-甲基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-1-基)-3-叠氮四氢呋喃-2-基)甲基)(新戊氧基羰基氧甲基)((S)-1-(新戊氧基羰基) 乙基氨基)]磷酸酯(AZT2333-2)的合成。
以实施例5类似的方法合成AZT2333-2。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ(ppm)：0.95(18H，s，6×CH3)， 1.41-1.50(3H，d，CH3)，1.96(3H，s，嘧啶环5位上的CH3)，2.31 -2.56(2H，m，糖环2′-位上的H)，3.87-4.00(2H，m，PNH and 糖环3′-位上的H)，4.06-4.46(8H，m，2×COOCH2，NCH and糖环4′-位、5′-位上的H)，5.58-5.76(2H，m，OCH2O)，6.17(1H，t，糖环1′-位上的H，7.26(1H，s，嘧啶环6位上的H)，9.26(1H， s，嘧啶环3位上的NH)。
31P NMR(162MHz，CDCl3)δ4.30；
LCMS-EST+(m/z)：633.6(M+H)+。
实施例25
生物学评价
1.本发明的化合物在HCV复制子(HCVpp)系统中的抗病毒活性检测
HCV复制子测定程序
一般程序：使带有HCV基因型1b复制子和萤光素酶报道基因的 Huh-7来源的细胞系(Zluc)在补充10％胎牛血清、2mM GlutaMAX、1％MEM非必需氨基酸、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素和0.5mg/mL(G418)的Dulbecco改进Eagle 培养基(DMEM)中生长。通过采用基于脂质/组蛋白的转染过程，用人类羰酸酯酶1(CES1)瞬时转染Zluc细胞。转染24和48小时后，使用抗CES1和抗标签抗体，通过蛋白质印迹(Western blot)确认 CES1的表达。对于剂量反应测试，以7.5x103个细胞/孔，在50μL 体积中，将细胞接种在96孔板，并在37℃/5％CO2下孵育。在Huh-7 培养基中新鲜配制药物溶液作为2X储液。在不含G418的DMEM 中从这些储液制备10个另外的5倍稀释液。在接种Huc细胞后至少 3小时，通过向板中一式两份加入50μL的药物稀释液以开始药物处理。药物终浓度的范围为100nM-0.0000512nM。然后将细胞在 37℃/5％CO2下孵育。或者以两种浓度(10nM和100nM)测试化合物。在所有情况下，Huh-7(其未带有HCV复制子)用作阴性对照。在孵育72小时后，通过量化通过萤火虫萤光素酶将5’-氟萤光素单氧合成为氧基氟萤光素(oxyfIuoroluciferin)所发射的光子，来测量HCV复制的抑制。为此，通过轻叩，从板中除去培养基，将50微升 ONE-glo萤光素酶测定试剂加入各孔。在室温下将板轻轻振荡3分钟，使用700nm截止滤波器，在具有1秒钟读出时间的Victor3V1420多标记记数器(PerkinElmer)上测量发光。通过 Microsoft Excel和XLfit4.1软件求出的所得最佳拟合方程式的剂量反应曲线计算EC50值。
对于细胞毒性评价，将Zluc细胞用上述化合物处理，采用 CellTiter-Blue细胞存活力测定法(Promega)，将20μL测定溶液加入各孔中，来监测细胞存活力。然后将板在37℃/5％CO2下孵育至少3小时。分别用560和590nm的激发和发射波长，在 Victor3V1420多标记记数器(Perkin Elmer)中检测板的荧光，应用 Microsoft Excel和XLfit4.1软件求出CC50值。
根据上述复制子测定法测定下表提供的化合物
+++表示1-10nM；++表示10-100nM；+表示0.1-1μM；
＊索菲布韦是依照参考文献J.Org.Chem.2011，76，8311制备。

Claims (10)

1.具有结构(Ia)的化合物，其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶，
其中，Base是B1、B2、B3、B4或B5；
这里，R1、R2、R3、R4、R5各自独立地是H、D、F、Cl、CH3、NN2或环丙氨基。
Ri是五元核糖Ri1、Ri2或Ri3；
这里，X2、Y2、X3、Y3、Y4各自独立地是H、F、Cl、OH、CH3或N3。
Z1＝O或C＝CH2；
Z2＝O或CH2；
Z3、Z4各自独立地是O或S；
X、Y各自独立地是H或D；
Ra＝CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3或CH2AR22；
这里，m＝0-4，n＝12-18；A＝OCOO，OCO或COO；R22＝H或C1-C6烷基；
Rb＝H或CHR6R7；
这里，R6＝H或C1-C6烷基；R7＝H，C1-C6烷基，AR22或与R6相连形成的C3-C8的环；
Rc是任一天然或非天然α-氨基酸的侧链。
2.如权利要求1所述的化合物(Ia)，其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶，其特征在于，优选m＝1，n＝14的组合或m＝0，n＝16的组合；优选A＝OCOO；R22优选异丙基、异丁基、新戊基；Rb优选异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基；Rc优选甲基或苯甲基。
3.如权利要求1-2所述的化合物，其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶，其特征在于，磷原子为手性原子，优选其单一构型S(P)构型或R(P)构型或S(P)构型与R(P)构型任一比例的混合物。
4.如权利要求1-3所述的化合物，其立体异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或结晶，其特征在于，又优选下列结构式的化合物：
5.一种制备权利要求1-4所述的核苷氨基磷酸酯类似物的方法，其特征在于，所述方法的合成路线如下：
这里：Base、Ri、X，Y，Ra，Rb、Rc定义同权利要求1。
在碱性条件下，RaOH与三氯氧磷反应后，加入氨基酸酯反应，再加入五氟苯酚反应得到化合物FA3-2和FA3-1；在低温条件下，化合物FA3-2或FA3-1与核苷反应，分别得到化合物NA3-1或NA3-2。
6.根据权利要求1-4所述的核苷氨基磷酸酯类似物，其特征是：与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂以及纳米制剂，以适合于经口或胃肠外给药；给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。
7.一种包含权利要求1-4所述的核苷氨基磷酸酯类似物，其特征在于：核苷氨基磷酸酯类似物的医药组合物。
8.根据权利要求7所述医药组合物，其特征是：还含有独立地选自以下药物的其他治疗剂：利巴韦林(Ribavirin)、干扰素、丙肝NS3蛋白酶抑制剂、HCV逆转录酶NS5B非核苷抑制剂、HCV逆转录酶NS5B核苷抑制剂、NS5A抑制剂以及NS5A抑制剂的增效剂、进入抑制剂、环孢素免疫抑制剂、NS4A拮抗剂、NS4B抑制剂、亲环素抑制剂。
9.一种权利要求1-4所述的核苷氨基磷酸酯类似物及其药用组合物在制备抗黄病毒科病毒的药物中的应用，其特征是：所述黄病毒科病毒是丙型肝炎病毒。
10.如权利要求7-9所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为片剂、针剂或胶囊。
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