CN109642824A - 用于校准针对基于光片的纳米颗粒跟踪和计数装置的调查体积的方法 - Google Patents

用于校准针对基于光片的纳米颗粒跟踪和计数装置的调查体积的方法 Download PDF

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Abstract

公开了一种用于校准暗场显微技术设置的方法。该方法包括：制备多个颗粒样本，每个颗粒样本具有已知的浓度和颗粒大小，该多个颗粒样本具有一种以上颗粒大小并且可选地具有一个以上折射率和一种以上稀释液。针对多个颗粒样本中的每个样本，在设置中测量该样本并且测量散射光强度和颗粒数目。根据该数据，可以确定散射光强度、颗粒大小、和校准调查体积之间的关系。使用校准调查体积来获取给定稀释液中的适当颗粒大小分布。

Description

用于校准针对基于光片的纳米颗粒跟踪和计数装置的调查体 积的方法
技术领域
本发明涉及使用装配有数字视频摄像头的显微镜测量和观察液体样本中的纳米颗粒。
相关申请
本申请要求于2016年7月1日递交的名为“METHOD FOR CALIBRATINGINVESTIGATED VOLUME FOR LIGHT SHEET BASED NANOPARTICLE TRACKING AND COUNTINGAPPARATUS”的美国临时专利申请No.62/357,777的优先权；要求于2016年8月8日递交的名为“METHOD FOR CALIBRATING INVESTIGATED VOLUME FOR LIGHT SHEET BASEDNANOPARTICLE TRACKING AND COUNTING APPARATUS”的美国临时专利申请No.62/372,025的优先权；要求于2016年11月14日递交的名为“METHOD FOR CALIBRATING INVESTIGATEDVOLUME FOR LIGHT SHEET BASED NANOPARTICLE TRACKING AND COUNTING APPARATUS”的美国临时专利申请No.62/421,585的优先权；并且要求于2017年6月27日递交的名为“METHOD FOR CALIBRATING INVESTIGATED VOLUME FOR LIGHT SHEET BASEDNANOPARTICLE TRACKING AND COUNTING APPARATUS”的美国专利申请No.15/634,858的优先权，所有它们的公开内容通过引用全部结合于此。
本申请还涉及于2015年10月14日递交的名为“APPARATUS FOR MEASUREMENTS OFGROWTH OR DISSOLUTION KINETICS OF COLLOIDAL NANOPARTICLE”的美国临时专利申请No.62/241,354；于2016年10月16日递交的名为“APPARATUS AND METHOD FOR MEASUREMENTOF GROWTH OR DISSOLUTION KINETICS OF COLLOIDAL PARTICLES”的美国专利申请No.15/293,180；于2016年2月8日递交的名为“MULTI-CAMERA APPARATUS FOR OBSERVATION OFMICROSCOPIC MOVEMENTS AND COUNTING OF PARTICLES IN COLLOIDS AND ITSCALIBRATION”的美国专利申请No.15/018,532；于2016年6月28日递交的名为“SPECIALPURPOSE CUVETTE ASSEMBLY AND METHOD FOR OPTICAL MICROSCOPY OF NANOPARTICLESIN LIQUIDS”的美国专利申请No.15/194,823(在2017年1月10日公布的美国专利No.9,541,490)；于2015年6月3日递交的名为“NANOPARTICLE ANALYZER”的美国专利申请No.14/730,138(在2017年5月9日公布的美国专利No.9,645,070)；于2017年1月5日递交的名为“SPECIAL PURPOSE CUVETTE ASSEMBLY AND METHOD FOR OPTICAL MICROSCOPY OFNANOPARTICLES IN LIQUIDS”的美国专利申请No.15/399679；于2017年5月15日递交的名为“SPECIAL PURPOSE CUVETTE ASSEMBLY AND METHOD FOR OPTICAL MICROSCOPY OFNANOPARTICLES IN LIQUIDS”的美国专利申请No.15/594967；以及于2015年7月1日递交的名为“SPECIAL PURPOSE CUVETTE ASSEMBLY AND METHOD FOR OPTICAL MICROSOPY OFNAMOPARTICLES IN LIQUIDS”的美国专利申请No.62/187391；所有它们的公开内容通过引用全部结合于此。
背景技术
纳米颗粒无处不在并且是迄今为止地球上的自然环境中最丰富的类颗粒实体，广泛应用于与人类活动相关联的很多应用。存在很多类型的自然存在的纳米颗粒和人造(人工设计)的纳米颗粒。纳米颗粒存在于空气、水生环境、雨水、饮用水、生物流体、药物、药品输送和治疗产品、以及各种很多工业品中。纳米颗粒通常存在于多分散聚合物(assemblage)中，这些多分散聚合物的特征在于同时存在不同大小的颗粒。
在广泛使用纳米颗粒的情况下，控制并精确表征它们的属性的能力对于很多应用可能是有用的。用于测量纳米颗粒属性的传统方法对于在很多应用中常见的混合纳米颗粒大小的多分散样本可能是不精确的。这些传统方法中的一些方法对样本中的大部分纳米颗粒的总体进行测量。由于同时测量从所有纳米颗粒散射的光，所以在存在一系列颗粒大小时很难将这些纳米颗粒分解到它们的组分大小。其他方法没有考虑由横跨一系列纳米颗粒大小的不同大小的纳米颗粒产生的散射光强度的巨大差异。在这些方法中，来自小纳米颗粒的低散射信号可能没有被检测到，或者来自较大纳米颗粒的高散射信号可能会模糊来自较小纳米颗粒的信号。并且在一些其他方法中，测量结果没有考虑颗粒的生长速度或溶解速度，因此大小分布的快照可能在片刻后会不准确。由于这些不足，任意给定大小的纳米颗粒的浓度可能会经历未知错误，并且因此整个大小分布也会经历未知错误。
这些检测纳米颗粒的方法被统称为暗场(dark field)显微技术(microscopy)。图1A和1B示出了执行这种分析的仪器设置10。该设置一般包括：产生穿过柱透镜的光束20的光源15和形成光片(light sheet)30的光学物镜25，其中，光片30指向小单元(试管(cuvette))35。试管35包含由稀释液制成的胶体中的纳米颗粒，这些纳米颗粒中的一些颗粒在调查体积38中被观察到。调查体积38中的纳米颗粒散射被定向通过聚焦光学物镜45(其还可以包括放大光学物镜，即，显微镜)的光40，产生聚焦到传感器(摄像头)55上的聚焦光束50。处理器60可以连接到传感器55和光源15以控制它们。设置10使得能够用精确形成的窄光片对任何液体进行照射并且对来自纳米颗粒的散射光(通常以相对于光片平面的90度角)进行观察。换言之，观察方向垂直于照射平面的方向。
由于摄像头捕捉来自不同大小的颗粒的反射光图像，所以这些不同大小的颗粒是可见的，其中，这些图像基于颗粒的大小和它们的成分(composition)(与稀释液的折射率不同的折射率)而具有不同的强度(包括图像的像素的不同亮度)。通过跟踪所记录视频的后续帧上的散射光的图像并使用布朗运动理论(爱因斯坦方程)，可以分别确定每个观察到的颗粒的大小(这通常称为纳米颗粒跟踪分析或NTA)。由于可以对所有观察到颗粒进行计数并确定它们的大小，所以在理论上，也可以精确计算颗粒大小分布(PSD)。一般，为了获取这种分布，对颗粒大小进行分组，即，将具有某个直径范围内的大小的所有颗粒的数目相加并将它们置于与该直径范围相对应的不同组(bin)中。为了获取PSD，可以用每组中的颗粒数目除以对应组宽度和调查体积。
这种方法的问题在于，用于使颗粒可见从而进行跟踪和计数的光片的光强度的不一致性。如图2所示，通过使用微尺度找出精确的校准常数(即，每个摄像头像素的长度单位的数目)来简单地校准摄像头所观察的面积。理想光片具有“顶帽(top hat)”光强度特性65，即，如图3所示，样本的照射区和暗区(体积)之间存在尖锐边界。但是，诸如激光器、透镜、和物镜之类的用于产生光片的光学设备一般生成光强度的类高斯分布70，参见示出了相比于高斯分布的“顶帽”分布65的图3(两条曲线下方是相同强度或面积)。取决于给定稀释液中的给定颗粒材料的光散射截面和摄像头灵敏度(量子效率)，有效光片厚度会大大改变从而使得调查体积大大改变(更靠近光片边缘的颗粒接收到更少的用于散射的光，因此可能不会被装置检测到)。可变的调查体积将高度影响对胶体中的颗粒浓度或PSD的确定(除非适当考虑该可变的调查体积)。
因此，存在针对不同类型和不同大小的颗粒适当校准调查体积的需求。随后可以使用这种取决于大小/类型的调查体积来实现对任意胶体的颗粒浓度或PSD的更准确的确定。
发明内容
下面给出了简化概要，以便提供对于请求保护的主题的一些方面的基本理解。该概要不是全面概述并且不旨在标识关键/重要元素或者勾画请求保护的主题的范围。其目的在于以简化形式给出一些概念，作为对于随后给出的更详细描述的序。
本文描述的装置、系统、和方法雅致地解决了上述问题。公开了一种用于校准暗场显微技术设置中的调查体积的方法。该设置包括被构造为将电磁辐射波束发射在样品室处的光源，该样品室被构造为容纳胶体颗粒并允许该波束的一部分垂直于进入该样品室的波束散射，该波束的散射部分指向传感器，其中，传感器被适配为检测电磁辐射。这包括制备具有已知浓度和颗粒大小的多个颗粒样本，该多个颗粒样本具有一种以上颗粒大小，并且可选地具有一个以上折射率和一种以上稀释液。对于多个颗粒样本中的每个颗粒样本，将该样本引入样品室，启动光源，并且记录传感器检测到的颗粒数目和散射光强度。确定散射光强度与(可选的)针对多个颗粒样本中的每种颗粒大小的样本相对于稀释液的折射率的折射率之间的关系。另外，基于针对多个颗粒样本中的每种颗粒大小的样本所测量的颗粒数目，确定校准调查体积与(可选的)该样本在各种稀释液中的折射率之间的关系。
可以针对在相同稀释液中具有未知相对折射率(RI)的颗粒大小，推断散射光强度与颗粒和稀释液的相对折射率的关系、以及调查体积与相对RI的关系。可以使用该方法来创建针对给定稀释液的调查体积、颗粒大小、以及散射光强度之间的三维关系。
可以在各种光源波长处执行该方法，并且可以针对各种稀释液确定光源波长、散射光强度、颗粒大小、以及调查体积之间的四维关系。
基于所确定的关系(即，散射光强度与稀释液中的颗粒的相对折射率之间的关系，以及调查体积与相对折射率之间的关系)，可以更精确地计算出未知样本的颗粒大小分布。将已知稀释液中的未知样本引入样品室，并启动光源。对于未知样本中的多种颗粒大小中的每种颗粒大小，在传感器所记录的图像上测量散射光强度和颗粒数目。对于每种颗粒大小，基于设置的预定关系来确定校准调查体积。然后，可以确定基于校准调查体积的精确颗粒大小分布。
这些方法可以被自动执行并在连接到传感器的处理器上运行。
对于本领域技术人员显而易见的附加方面、替代、和变形也在本文中被公开，并且具体地被预见到作为本发明的一部分而被包括。仅在本申请和相关申请中专利局所允许的权利要求中阐述了本发明，并且某些示例的以下概要描述不以任何方式限制、限定、或建立法律保护范围。
附图说明
参考下面的附图可以更好地理解本发明。附图中的组件不一定是按比例的，而是将重点放在清楚示出本发明的示例方面。在附图中，贯穿不同视图和/或实施例，参考标号指定对应的部分。将理解的是，某些组件和细节可能没有出现在附图中，以帮助更加清楚地描述本发明。
图1A示出了暗场显微技术设置。
图1B示出了暗场显微技术设置的详细示出调查体积、进入的极化、和散射光的部分。
图2示出了用于传感器校准的微型光栅。
图3示出了相比高斯光分布的顶帽光分布。
图4示出了用于传感器校准，尤其用于确定景深(放置在相对于观察线的45度角)的微型光栅。
图5示出了针对聚苯乙烯大小标准的样本稀释的图表。
图6示出了针对水中的聚苯乙烯和二氧化硅计算出的Mie散射截面。
图7A是在利用450nm的光源波长的情况下针对水中的175nm直径的颗粒的折射率描绘的观察平均强度的曲线图。
图7B是在利用450nm的光源波长的情况下针对水中的175nm直径的颗粒的折射率描绘的观察平均强度的曲线图，其中，已经将水平轴改为Rayleigh散射比例参数。
图7C是在利用450nm的光源波长的情况下针对水中的435nm直径的颗粒的折射率描绘的观察平均强度的曲线图。
图8A是在利用450nm的光源波长的情况下针对水中的175nm直径的颗粒的折射率描绘的校准调查体积的曲线图。
图8B是在利用450nm的光源波长的情况下针对水中的435nm直径的颗粒的折射率描绘的校准调查体积的曲线图。
图9示意性地示出了(未知)颗粒的两个不同大小d1和d2(大圆圈)的成分呈现，随之分别产生了不同的校准调查体积V1和V2。
图10示出了针对水中的各种折射率的材料计算出的Mie散射截面。
图11示意性地示出了产生针对给定稀释液的调查体积查找表面的三维曲线图。
图12示出了以两个不同波长针对水中的聚苯乙烯和二氧化硅计算出的Mie散射截面的比较。
图13是示出用于估计可以用来精确计算所跟踪和计数的颗粒的浓度的光片的有效厚度的方法的流程图。
图14是示出使用校准调查体积获取针对已知稀释液中的未知多分散样本的颗粒大小分布的方法的流程图。
图15是具有包含预定关系的数据库的暗场显微技术设置。
具体实施方式
本文参考包括发明人所预见到的用于实现本发明的任何最佳模式在内的本发明的一些具体示例。这些具体实施例的示例在附图中示出。尽管结合这些具体实施例描述了本发明，但是将理解的是，不旨在将本发明限制到所描述或示出的实施例。相反，旨在覆盖可以被包括在所附权利要求所限定的本发明的精神和范围中的替代、变形、和等同。
在下面的描述中，给出了很多具体细节，以便提供对本发明的透彻理解。本发明的特定示例实施例可以在没有这些具体细节中的一些或全部细节的情况下实现。在其他实例中，没有详细描述本领域技术人员公知的处理操作，以避免不必要地模糊本发明。为了清楚，有时将以单数形式描述本发明的各种技术和机制。但是，应该注意的是，一些实施例包括一种技术的多次迭代或多个机制(除非有明确的相反指示)。类似地，本文示出和描述的方法的各种步骤不一定按照所指示的顺序执行，或者在某些实施例中根本没有执行。因此，本文讨论的方法的一些实施方式可以包括比所示出或描述的步骤更多或更少的步骤。另外，本发明的技术和机制有时将描述两个以上实体之间的连接、关系、或通信。应该注意的是，实体之间的连接或关系不一定意味着直接的通畅连接，因为各种其他实体或处理可能驻留或出现在任何两个实体之间。因此，除非明确指示，否则所指示的连接不一定意味着直接的通畅连接。
示例特征的以下列表对应于图1至12并且是为了参考方便而提供的，其中，贯穿说明书和附图，相同的参考标号指示相应的特征。
仪器设置 10
光源 15
光束 20
光学物镜 25
光片 30
小单元、样品室、(试管) 35
调查体积 38
散射光 40
聚焦光学物镜 45
聚焦光束 50
传感器(例如，摄像头) 55
处理器 60
“顶帽”光强度特性 65
类高斯分布 70
数据库 75
估计可以用来精确计算所跟踪和计数的颗粒的浓度的光片的有效厚度的方法1300
(包括步骤1305至1360)
使用校准调查体积来获取未知多分散样本1400的颗粒大小分布的方法1400(包括步骤1405至1435)。
图1A示出了本文描述的允许可视化的光片30的示意图。其包括创建在透明试管35(也称为样品室)内的非常窄的光片30的光源15(具有可以穿过光学物镜或其他波束形成元件25的不同波束颜色/波长的一个或多个激光器)。由在试管35中所包含的给定胶体中的被照射的颗粒散射的光40一般由显微镜(物镜)45以90度角观察，其中该显微镜45在传感器55(数字视频摄像头)上收集光。由于纳米颗粒的典型大小(直径在1微米以下)与可见光的波长是可比较的，所以显微镜45不能区分光散射纳米颗粒的细节而仅能够记录由每个颗粒散射的光的强度，从而在传感器55上投射看起来像覆盖多个像素的圆形斑点或圆盘的图像。为了校准传感器55所观察到的光片30的面积，微型光栅的图像被置于物镜45前面而不是试管30前面；图2示出了这样的微型光栅。在本示例中，传感器图像中的1161个像素覆盖260微米的距离，因此校准常数大约为224nm每像素。对于这里描绘的1280像素x 720像素的图像，面积为46,242平方微米或0.000462cm2。一般的数字传感器具有方形像素，所以校准在任何方向都是一致的；但是，如果使用矩形像素，则可以在沿着像素行的每个垂直方向应用相同的过程。
为了计算对装置所记录的图像有贡献的对光进行散射的颗粒所来自的体积，必须考虑光学系统的景深(DOF)并且光学系统的DOF应该足够大覆盖光片30的整个厚度。图4示出了用于校准系统的相同微型光栅的图像(但是这次该光栅旋转偏离光轴45度)。对清晰图像与模糊图像的限制的精确确定是主观的，但是显而意见的是，在本示例中，这样的距离在数十微米的范围中(大约为60微米)。考虑微小尺寸的旋转(沿光轴√2更短距离的因子)以及在装有稀释液的试管中进行跟踪和计数的事实(在稀释液是水(水是最流行的稀释液，并且其相对于空气的折射率大约为1.33)的情况下，这是按相对于视知觉深度的大约为4/3的因子的延长)，在图4所示的示例中，估计系统的有效DOF大约为56微米。在合理设计的仪器的情况下，该DOF使得创建应该具有大约为或小于56微米的平均厚度的光片成为必要。在装配有20x放大物镜45的传感器55的上述示例中，调查体积为大约2.6百万立方微米或大约2.6nL。
为了通过本专利描述的方法高效检测、跟踪、并计数给定胶体中的颗粒，应该限制在所记录视频的每帧内可见的颗粒图像的数目，因为如果存在太多颗粒，则在数百帧的典型运行期间轨迹最终重叠的可能性增大，从而妨碍精确跟踪。在所描述的实施例中仍然可以被检测和跟踪的颗粒的一般数目为大约250，从而将所检查的样本的有效浓度/密度限制到大约108个颗粒/毫升以下。
图13示出了估计可以用来精确计算所跟踪和计数的颗粒的浓度的光片的有效厚度的方法1300。
为了开始校准，应该制备并使用具有已知颗粒密度的已知稀释液中的胶体样本(步骤1305)。如上面提到的，当视频图像中存在太多颗粒时，对颗粒的跟踪变得更加困难甚至不可能。因此，有效浓度/密度在108个颗粒/毫升以下。由于不同大小的颗粒不同地吸收和反射光，所以应该使用已知浓度/密度的多个颗粒直径。测试样本应该具有已知的颗粒浓度，该颗粒浓度可以通过例如重量分析方法得出。一般，胶料(sizing)标准包含1％每重量的颗粒。这允许对浓度的精确估计，其中该浓度是通过对这种标准进行后续稀释(这是达到有效浓度所需要的)来获得的。图5示出的图表提供了用于达到从密理博公司安装(Millipore Corporation installation)获取的非常干净的水中的不同大小的聚苯乙烯(PSL)颗粒的大约2x107个颗粒/毫升的样本稀释。
随后在步骤1310将这些样本引入暗场显微技术设置10的试管35中(即，参见图1A和1B中的设置)，并且记录设置10所检测到的颗粒数目并将该颗粒数目与从稀释(即，在图5的图表中)获知的数目进行比较。将使用该数据来创建体积校准。针对在设置10中使用的标准的固定激光功率和摄像头增益，还记录针对已知稀释液中的各种颗粒直径计算出的平均散射光强度(步骤1315)。
在优选实施例中，应该针对在不同稀释液中具有不同折射率的材料(例如，二氧化硅、聚苯乙烯、和金)重复对具有不同颗粒直径的已知稀释的制备，并且应该将测量出的颗粒浓度与每种材料的已知浓度进行比较(1325)，该测量出的颗粒浓度应该足够推断出材料类型(即，相对于稀释液的不同折射率)和直径(步骤1320)。样本的数目应该是至少针对两种不同材料、至少两种不同稀释液、以及至少两种不同直径，但是最好存在覆盖感兴趣的范围的三种以上材料、多种稀释液、以及很多直径(在1000nm以下并且低至10nm以及具有在1.4至2.0范围中的RI的材料)。类似地，针对在设置10中使用的标准的固定激光功率和摄像头增益，还记录各种颗粒直径的平均散射光强度(针对具有不同相对折射率的每种材料，其中该相对折射率是相对于在相同稀释液中观察到的相同大小颗粒的很多轨迹之间计算出的稀释液平均RI的)。可以针对其他激光功率设置和摄像头增益重复该过程或在知晓这些设置的功率和增益的比率的情况下进行推断。
进一步有利的是，检查散射光强度的结果是否符合针对已知的相对折射率计算出的Mie散射截面(步骤1330)。(参见图6，用于比较水中的PSL和二氧化硅纳米颗粒的散射截面，参见Pol等的“Refractive index determination of nanoparticles in suspensionusing NTA”(2014))。
在步骤1335，对于每种大小的颗粒，相对于图7A所示的平均测量强度绘制相对折射率的曲线图(针对在利用450nm光源波长的情况下的水中的175nm直径颗粒)。对于小于大约200nm直径的颗粒，散射截面和观察到的强度与Rayleigh散射比例参数是线性的(n是散射材料的折射率，n0是稀释液的折射率)：
图7B示出了与图7A相同的数据，但是水平轴是从等式1推导得出的，产生了线性关系。对于大于200nm直径的颗粒，光强度与颗粒的折射率n形成线性关系，如图7C所示(针对在利用450nm的光源长度的情况下的水中的435nm直径颗粒)。
该方法的要点在于提供一种校准方法，以考虑调查体积对于不同稀释液中的不同大小的颗粒不恒定的事实(因为不同大小的颗粒将不同地散射光，同样地，调查体积对于具有不同的相对于稀释液的折射率的折射率的颗粒不恒定)。在没有对调查体积进行适当校准的情况下，所观察和计数的颗粒的数目将是胶体中的颗粒的实际数目的误传。
在图8A中，对不同折射率的水中的一系列175nm直径颗粒进行测量并计数，并且相对于调查体积地绘制折射率的曲线图(步骤1340)。来自图8A的调查体积是将校正对不同大小和不同相对折射率的颗粒的多计数或少计数的校准因子。图8A取决于所使用的光源的波长和设置。用户可以创建针对特定设置和光源的曲线图(即，图7A至图8B)，并且可以使用相同的设置和光源来测试未知样本。
通过比较调查体积中的已知颗粒的数目和所观察到的颗粒数目来确定校准调查体积。所以，如果在相同液体中的相同浓度的情况下观察到的一个折射率的颗粒是具有较低折射率的颗粒的二倍之多，则第一种颗粒的校准调查体积应该是第二种颗粒的二倍。再次转向图8A，较低折射率的颗粒趋向于不太高效地散射光，所以校准调查体积将接近1nL；同时，较高折射率的颗粒更高效地散射光，所以校准体积将接近2nL。当计算颗粒大小分布(PSD)时，用来对属于第i组的所有颗粒(它们的数目为j)求和的等式为：
其中，di是第i组的宽度，并且在被分组的所有j个颗粒上求和，其中每个颗粒具有分别如上所确定的校准调查体积Vj。
因此，由高折射率材料制成的颗粒的数目被更大的校准调查体积打了折扣。实际上，图8A明显示出了未校准的调查体积的问题。在没有校准的情况下，与具有1.61的折射率的175nm直径的颗粒相比，具有1.45的折射率的相同大小的颗粒将被少计数大约50％(它们二者都被置于水中)。对于水中的435nm直径的颗粒，图8B创建了相同的曲线图并示出了相似的效果。
图9示意性地示出了针对水中的(未知)颗粒的两个不同大小d1和d2(大圆圈)的该处理的成分呈现，随之分别产生了不同的校准体积V1和V2。
尽管图7A至图9所示的曲线图是使用离散类型的材料创建的，但是通过执行对正在被校准的装置的几何图形(即，所使用的物镜的数值孔径(numerical aperture)NA)的散射截面的Mie计算，可以超越测试颗粒地推断结果(针对更大范围的折射率、颗粒大小、或不同稀释液)。例如，图10提供了针对各种材料的Mie计算(水是稀释液(n0＝1.33))。
图7A至图9中的信息可以结合到图11所示的三维表面图中(可选步骤1350)。系统可以测量给定稀释液中的颗粒的直径和光强度，从而可以通过借助于针对该稀释液的查找表面来确定校准调查体积。一旦确定了校准调查体积，则系统利用针对具有与特定组相对应的大小的每个颗粒的校准调查体积，对该特定组大小中的颗粒数目进行计数并且应用上述等式2。
在步骤1355和1360，通过包括包含有光源的不同波长的推断，使得图11所示的查找表面更加鲁棒。所以，例如，图12示出了分别在405nm和450nm光波长的情况下针对水中的聚苯乙烯(PSL)和二氧化硅散射截面的Mie计算。这会产生不容易在2D中用曲线图表示的四维矩阵，但是该四维矩阵本质上是在四维中具有附加的光源波长轴的图11的表面。这样的矩阵可以由计算机处理器创建。系统将使用波长、直径、和强度来推断每个颗粒的校准调查体积。并且根据这些校准体积，可以计算精确PSD。通过在上述过程中考虑各种稀释液来添加又一维度。
如图14所示，公开了使用校准调查体积获取未知多分散样本的颗粒大小分布的方法1400。将已知稀释液中的未知多分散样本装入试管(步骤1405)并且设置光源波长。在步骤1410，记录测量到的未知颗粒的散射强度和直径。然后使用这两个值来根据针对给定稀释液的图12的查找表面确定校准调查体积；或者，如果不使用该表面，则通过以上关于图7A至图9讨论的图表来获取校准调查体积。还在步骤1420记录特定组大小中的颗粒数目。应用以上等式2，利用针对每个颗粒计算出的调查体积，可以在步骤1425计算样本的PSD。可以针对已知稀释液中的未知样本中的多个直径执行该处理(步骤1430)并针对各种波长重复该处理(步骤1435)。
方法1400可以在图15所示的处理器60上实现。具体地，散射光强度与样本相对于稀释液的相对折射率之间的预定关系、以及调查体积与样本的相对折射率之间的预定关系可以是处理器的数据库75的一部分。处理器60可以记录通过已知稀释液中的未知颗粒测量到的散射强度、颗粒大小、和颗粒数目。基于该信息，处理器可以确定针对所计数的所有颗粒的校准调查体积并创建未知样本的PSD。如果使用多个波长的光，则处理器可以使用光源波长并且可以根据数据库来执行这些确定，该数据库可以具有基于各种波长的散射光强度相对于折射率的关系和校准调查体积相对于折射率的关系。
既然已经描述了用于确定校准调查体积的鲁棒方法，但是应该注意的是，这些相同的技术可以用来确定针对同质(homogenous)胶体的校准调查体积(当考虑颗粒的材料时)。参考图9，顶线描绘了针对折射率为1.466的二氧化硅的相对于校准调查体积的颗粒直径。如果同质但是未知材料的样本在相同稀释液中具有这样的颗粒：其具有与二氧化硅相似的颗粒直径上的散射强度(参见图7A至7C)，则该材料的样本具有与二氧化硅相似的相对于该稀释液的折射率；因此，可以使用针对该稀释液的二氧化硅校准调查体积(即，图9)。这实质上是图11所示的3D表面的单曲线(部分)。这是不需要已知大小和相对于稀释液的折射率的多个样本来得出校准调查体积的简化情况。
尽管本文描述了包括以上描述并在所包括的示例附图中示出的本发明的示例性实施例和应用，但是并不希望将本发明限制于这些示例性实施例和应用或限制于这些示例性实施例和应用操作或在本文中被描述的方式。实际上，对于本领域普通技术人员显而易见的是，对示例性实施例的很多变形和修改是可能的。本发明可以包括任何设备、结构、方法、和功能，只要产生的设备、系统、或方法落入专利局基于本专利申请或任何相关专利申请允许的权利要求之一的范围中。

Claims (12)

1.一种用于确定胶体的颗粒大小分布的系统，所述系统包括：
光源，被构造为将电磁辐射的波束发射在样品室处，该室被构造为容纳所述胶体并允许所述波束的一部分从包含在所述胶体中的颗粒散射；
传感器，被放置为观察所述波束的散射部分，其中，所述传感器被适配为检测所述电磁辐射；
数据库，被配置为存储散射光强度、颗粒大小、以及校准调查体积之间的预定关系；
处理器，被连接到所述光源、传感器、和所述数据库，所述处理器被配置为执行以下步骤：
a.启动所述光源；
b.从所述传感器获取一系列图像；
c.确定所述图像中的颗粒的大小，针对每种大小进行以下操作：
i.确定所述图像中的颗粒的数目；
ii.分别确定针对所述图像中的颗粒的散射光强度；
d.基于来自步骤(c)的信息和所述预定关系，计算所述胶体的所述颗粒大小分布。
2.如权利要求1所述的系统，其中，所述预定关系进一步取决于所述电磁辐射的波长；其中，所述光源能够被调整以产生多个波长的电磁辐射；并且其中，所述处理器进一步被配置为调整所述光源以产生多个波长。
3.一种用于校准暗场显微技术设置的方法，其中，所述设置包括光源，该光源被构造为将电磁辐射的波束发射在样品室处，该室被构造为容纳胶体颗粒并允许所述波束的一部分从所述颗粒散射，所述波束的散射部分指向传感器，其中，所述传感器被适配为检测所述电磁辐射，所述方法包括：
a.制备具有已知的浓度和颗粒大小的多个颗粒样本，所述多个颗粒样本具有一个以上折射率和一种以上颗粒大小；
b.针对所述多个颗粒样本中的每个样本进行以下操作：
i.将该样本引入所述样品室；
ii.启动所述光源；
iii.测量所述传感器检测到的颗粒数目和散射光强度；
c.针对所述多个颗粒样本中的每种颗粒大小，确定样本的折射率与散射光强度之间的关系；以及
d.基于针对所述多个颗粒样本中的每种颗粒大小的样本所测量的颗粒数目，确定样本的折射率与调查体积之间的关系。
4.如权利要求3所述的方法，还包括：
e.确定散射光强度、颗粒大小、和调查体积之间的三维关系。
5.如权利要求3所述的方法，还包括：
e.基于步骤(c)的确定结果，确定针对所述多个颗粒样本中没有测量的颗粒大小的折射率与散射光强度之间的关系。
6.如权利要求3所述的方法，还包括：
e.基于步骤(d)的确定结果，确定针对所述多个颗粒样本中没有测量的颗粒大小的折射率与调查体积之间的关系。
7.如权利要求3所述的方法，其中，所述光源被改变以产生多个波长的电磁辐射，所述方法还包括：
e.针对所述多个波长中的每个波长执行步骤(a)至(d)。
8.如权利要求7所述的方法，还包括：
f.确定光源波长、散射光强度、颗粒大小、以及调查体积之间的四维关系。
9.如权利要求3所述的方法，还包括：
e.将未知样本引入所述样品室；
f.启动所述光源；
g.针对所述未知样本中的多种颗粒大小进行以下操作：
i.测量所述传感器检测到的颗粒数目和散射光强度；
ii.基于步骤(c)和(d)中的关系来确定校准调查体积；
iii.基于从所述未知样本测量到的颗粒数目和校准调查体积，计算颗粒大小分布。
10.一种用于校准暗场显微技术设置的方法，其中，该设置包括光源，该光源被构造为将电磁辐射的波束发射在样品室处，该室被构造为容纳胶体颗粒并允许所述波束的一部分从所述颗粒散射，所述波束的散射部分指向传感器，其中，所述传感器被适配为检测所述电磁辐射，所述方法包括：
a.制备已知浓度的具有已知颗粒大小的多个样本；
b.针对所述多个样本中的每个已知颗粒大小样本进行以下操作：
i.将该样本引入所述样品室；
ii.启动所述光源；
iii.测量所述传感器测量到的颗粒数目和散射光强度；
c.针对每种已知颗粒大小，基于所述已知浓度、测量到的散射、和测量到的颗粒数目来确定校准调查体积。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述光源被改变以产生多个波长的电磁辐射，所述方法还包括：
d.针对所述多个波长中的每个波长执行步骤(a)至(c)。
12.如权利要求10所述的方法，还包括：
d.将未知样本引入所述样品室；
e.启动所述光源；
f.针对所述未知样本中的多种颗粒大小进行以下操作：
i.测量所述传感器检测到的颗粒数目；
ii.基于从所述未知样本测量到的颗粒数目和校准调查体积，计算颗粒大小分布。
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